2 с сохранением активности исходного фермента. .Поставпенна цеш Достигаетс тем, 4to при попученни иммобилизованных НА завйсимых ферментов св зывание НАД .с носителем осушествп ют путем сорбции. В качестве носител исцодьзуетс целлюлоз и ее производные. В качестве НАД-аависимо го фермента используют алкогольдегидроге зу. В качестве производных це люпозм используют гуанидоэтилцеллюлозу. Сущность изобретени {заключаетс в сорбции на носителе кофермента НАД (в окисленной ипИ востааовленной фор ме) с цюследуклиим присоеданением фермента к спою сорбированного кофермента Предпочтительно процесс провод т следующим образом. Производ т сорбцию кофер мента (НАД или НАД сорбента обеспечивающих прочное ср зьгеание кофермента с последующим св зыванием ферментов со споем сорбированного коферцента за счет специфического взаимо действи фермент-кофермент, а также взаимодействи фермента с носителем. Дн замены инактивированных в процессе работы фермента и кофермента на новые предпагаетсл осуществл ть их десорбцию в услови х, отличных от усло вий, в которых работает система фермен кофермент. ОписыЁаемый способ испытан в систем когольдегидрогеназа-никотинамидеденинн леотид (НАД). Дл этого кофермент НАД сорбируют, например, на целлюлозе из водного О,О15 М буферного раствора фосфата кани при рН 7,7 и ввод т в систему фермент - а когольдегидрогеназу . При Эгом происходит самосборка иммобилизоеаывой фермеит-кофермектной системы - цеилюдоэа-НЛД-а когольдегнд геназа, котора в усдови х проведени ферментативного процесса восстановлени лактапьдегида в 1,2-пропандиол (О,015 .М буфернь й раствор фосфата капи при рН 7,7, температура ) прочно удерживаетс на сорбенте. В случае потери активности фермент коферментной системы проводитс ее д&сорбци непосредственно в ферментативном реакторе (например, проточной колонке ) водно-спиртовой смесью 3:.1 при рН-10 с последукндей иммобилизацией активных койлонент по описьюае- мому способу. П р и- М е р 1. Из исходного раство ра восстановленноцх никотинамидаденин-.динуклеотила I НАЛ кпшюитпочмоЛ фосфата кали рН 7,7 берут апЬ|«шоту, родержашую примерло 260 «Ю НАД-Нд в 2 мл буферного раствора (ко 11«ество вз того дл србции НАДН- провер ют спектрофотометрическим методом при 340 ммк в 1 см. кювете, учитыва , что коэффициенч 1светопогашеии : дл НАИ Hg/Ej 6,2),.Приготрвленный раствор кофермента приливают к 0,1 г гуанидоЭ7илцefллюлозы . Сорбцию кофермента провод т, в течение 1 ч при и перио дическом перемешивании. После сорбции целлюлозу отдел ют от раствора и последний спектрофотометрируют. По разности исходных и конечных количеств НАД Н.определ ют величину сорбции. Дл гуанидоэтилделлюлозы она сооТ ветствует 59,6%. Слабо св занный с сорбентом НАДН.д отмывают буфер ,ным раствором. Количественное определение иммобипизовацного на гуанидоэтилцеплюпозе НАД Н осуществл ют по нингидрин-сер х нокислотной методике. Дл этого готов т раствор, содержащий следующие компоненты; О 15 ммоль/мд буфера фосфата кали (рН 7,7),, 5О мкмоль/мл этанола , 17 мкмопь/мл лактальдегида и 0,16 мг/мл алкоголь.дегидрогеназы (все компоненть реакционной смеси добавл ют при ),,0,2 МП полученной смеси приливают в пробирки/со стандартными растворами, содержащими из1вестное количество НАДНдИ с 0,1 г целлюлозы с сорбированным НАДН„. Реакционные смеси инкубируют в термостате при 37 С в течение 45 мин. После чего фер ментативную реакцию в стандартных растворах прекращают добавлением 1 мл серной кис оты. В сдучае, иммобилизованной системы реакци останавпиваетс ( отделением раствора субстрата от иммо- бипизованной ферМерт-коферментной сиотемы фильтрованием в центрифуге. Дл стандартизации условий,в фильтрат добавл ют 1 мл серной кислоты. Растворы тщательно перемещивают и снова инку- бирую;г при 70 С в течение 10 мин; Реакционную CMetb охлаждают до комнатной температуры и при тщательном перемешивании добавп ют 4О мкл свежеприготовленного раствора нингидрина (3% нингидрина и 5% бисульфита натри ). Раствор оставл ют сто ть при комнатной температуре в течение 60 миН)) затем в смесь припивают еще 1 мл концентрированной серной кислоты и оставл ют сто ть При комнатной темпера- , туое в течение 5 мин. Опгич(чпку1п nnmv. Активность сорбированного коферментб определ ют по калибровочной криэой в зависимости от величины оптической ппотноств Подучают копичественное значение активности сорбированного НАД Н прО11Вл$ио1аего физиологическую активность В иммобилизованном состо нии. Оно ока за лось равным 56,3% от о&пего количест ва кофермента, сорбированного на матри ..«У-, . . ..: .. Приме р 2. Колонку размером О,3 X 1О см заполн ют 0,5 г ryaifHAo дтилцёллюлозы, уравновешивают 0,015 М буферным раствором фосфата кали (рН 7 Через колонку пропускают до насыщени ,0,ОО5 моль/л раствор 1уосотннамидаденйндинуклеотида () Осуществл ют спектрофотометрическай контроль элюата на выходе из колонки при,340 мм. Слабо св занный НАД-Н отмывают буферным раствором. Пропускают через колонку раствор фермента с концентрацией 2 1 моль/л в Ь,О15. М буферном растворе фосфата кали (рН 7,7) до насьпцени сор бента, алюат на выходе спектрофотометри руют при 28р ммк. Избыток фермента отмыва1рт, 9Л|онру буферный раствор через колонку. Работу полученной фермент-коферментной системы провер ют; следу кадим образом . Через колонку с фермент-коферментной систем6й эгаоируюг: со скоростью 2 мл/ч раствор, содержащий следующие компоненты; 0,15 ммодь/ма буфера фоофата кали с рН 7,6 50 мкмопь/мп этанола и 17 мкмопь/мп пактапьдегида. Смесь после прохождени через колонку фракционируют на коллекторе фракций. Количество образующегос в результате ферментативной реакции 1,2-пропандиола определ ют по нингидрнн-сернркнслотной методике. Дл удалени инактивированной систе Ы провод т десорбцию в динамических слови х смесью вода-спирт в соотношеии 3:1 при рН 10. Элюат на выхода из колонки спектрофотометрируют при 880 ммк. Сорбент промывают буферным раствором и заново провод т иммобилизааию кофермента и фермента по onHcaiiой выше методике. При этом получают активность, равную исходной. . Формула изобретенин 1,Способ получени иммобшшзованных ннкотинамидадениндинуклеотнд (НАЛ)зависймых ферментов, вкпючакадий СВЯЗЬЕванне кофермента НАД в окиспенной и пи восстановленной форме с носителем и после юшее присоедннение фермента к коферменту на носителе, отличающийс тем, что с целью упрощени процесса с сохранением активности ио;ходного фермента, св зывание НАД с iio сителем осуществл ют путем сорбции h в качестве носителей используют целлюлозу и ее производные. 2.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с тем, что в качестве HA/L-. зависимого фермента используют алкогопьдеги/фогеназу . 3. Способ по п. 1, отличающий с тем, что в качестве производных целлюлозы используют гуанидоэтипцеплк лоау . Источники информации прин тые во внимание при экспертизе; 1. Иммобилизованные ферменты Современное состо ние и перспективь. Том П.Под ред.. И. В. Березина, р. К. Антонова , К. Мартинена.. Изд. 1976.