DE3125944A1

DE3125944A1 - Verfahren zur erzeugung von acetaldehyd aus aethanol

Info

Publication number: DE3125944A1
Application number: DE19813125944
Authority: DE
Inventors: Wynn R. 32750 Longwood Fla. Raymond
Original assignee: Coca Cola Co
Current assignee: Coca Cola Co
Priority date: 1980-07-01
Filing date: 1981-07-01
Publication date: 1982-02-04
Also published as: ES503553A0; GB2079280A; BR8104173A; JPS5743690A; DE3153656C2; MX7550E; ES513148A0; ES8300855A1; US4481292A; ES8306179A1; IT8122657A0; MA19188A1; DE3125944C2; AR227431A1; IT1137269B; IL63138A0; ES513147A0; GB2079280B; GR75717B; ES8305043A1

Description

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die enzymkatalysierte Herstellung: von Acetaldehyd aus Methanol. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren für die in situ-Erzeugung von Acetaldehyd in äthanolhaltiger Orangen-Essenz. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Stabilisieren von wässrigen Acetaldehydlösungen.

Die vorliegende Erfindung beruht auf Arbeiten, die sich mit der Erzeugung von Acetaldehyd in"Orangen-Essenz befassen. Orangen-Essenz ist ein wässriges Destillat, das während der anfänglichen Stufen der Verdampfungskonzentrierung von Orangensaft erhalten wird und die flüchtigeren Komponenten des Orangengeschmacks -enthält. Die wässrige Essenz wird wieder zu konzentriertem Orangensaft vor dem Gefrieren gegeben, um den frischen Fruchtgeschmack wiederherzustellen, und sie wird auch in grossem umfang als Aromastoff in anderen, auf Zitrusfrüchten basierenden Produkten verwendet.

Es ist bekannt, dass Acetaldehyd, der primäre Aldehyd in der Orangen-Essenz, einen positiven Einfluss auf den Orangengeschmack ausübt. Darüber hinaus ist der Acetaldehyd ein wichtiger Bestandteil von zahlreichen anderen Fruchtessenzen und spielt daher nicht nur in Zitrusprodukten, sondern in der gesamten Aromaindustrie eine wichtige Rolle. Es ist daher wünschenswert, Verfahren zur Herstellung von Acetaldehyd zu untersuchen und zu finden, insbesondere zur "Herstellung von natürlichem Acetaldehyd, das heisst von Acetaldehyd, der durch einen natürlichen Prozess aus einer auf natürlichem Wege erhaltenen Quelle erzeugt wird.

Orangen-Essenz ist ein sehr geeigneter Stoff für ein solches. Verfahren, da Äthanol bis zu 90 % der gesamten flüchtigen Bestandteile der Essenz ausmacht, selbst aber keinen positiven

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Beitrag zu dem Geschmack leistet. Das Verhältnis von Äthanol zu Acetaldehyd in Orangen-Essenz liegt in der Grössenordnung von 100 zu 1. Die natürliche in situ-ümwandlung des Äthanols in der Orangen-Essenz zu Acetaldehyd ist daher ein grundsätzlich möglicher Weg, um eine an Acetaldehyd angereicherte Essenz herzustellen, vorausgesetzt, dass eine solche Umwandlung durchgeführt werden kann, ohne dass die anderen wünschenswerterweise vorhandenen Bestandteile des Quellenmaterials für das Äthanol nachteilig beeinflusst oder verändert werden.

Die natürliche Oxidation von Äthanol kann auf zahlreichen verschiedenen Wegen erreicht werden. Ein Verfahren, wie beispielsweise dasjenige der US-PS 3 642 581 vom 15. Februar 1972, Risley und Goodhue, verv;endet Mikroorganismen, um die Oxidation durchzuführen, wobei die Äthanolquelle (Substrat) zu dem Kulturmedium hinzugefügt und das Produkt aus diesem gewonnen wird. Dieses Verfahren eignet sich nicht bei Verwendung eines Materials komplexer Zusammensetzung, wie beispielsweise einer Essenz, wegen der möglichen Veränderung der restlichen Bestandteile ausser dem Äthanol und dem Acetaldehyd .

Ein zweites, von Leavitt and Pennington gefundenes Verfahren (US-PS 3 344 047 vom 26. September 1967) verwendet den vollständigen, zellfreien Enzymextrakt aus einem Mikroorganismus, der in einer Nährbrühe gewachsen ist, wobei das gewünschte Substrat die einzige Kohlen stoff quelle' *ist„ Die Produkte werden entweder durch Lösungsmittelextraktion oder durch Emulgierung der wässrigen Lösung mit einer ölphase in welche das Produkt kontinuierlich extrahiert wird, gewonnen (Leavitt, US-PS 3 880 739 vom 29. April 1975). Die Ölphase/Produkt-Lösung wird durch Verwendung einer semi-permeablen Membrane gewonnen. Während dieses Verfahren selektiver ist als das zuvor beschriebene Verfahren, ist es für die Verwendung eines Material komple-

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xer Zusammensetzung, wie beispielsweise eine Essenz, ungeeignet, wegen der möglichen Anzahl ungewünschter Enzymreaktionen, die erfolgen können.

Die grösste Selektivität bei der natürlichen Oxidation von Äthanol wird durch Verwendung eines spezifischen Enzyms für die Katalysierung der Oxidation erreicht, in diesem Fall Alkoholdehydrogenase (ADH). Während die in vivo-Verwendung dieses Enzyms schon seit Jahrhunderten bei der fermentativen Erzeugung von Äthanol durch Hefe praktiziert worden ist, hat das reine Enzym wegen der Probleme, die mit der Zurückhaltung und Zurückführung seines erforderlichen Cofaktors, des Nicotinamid-adenin-dinucleotids (NAD+) verbunden sind, in der Industrie nur wenig Anwendung gefunden. Die Lösung des ersteren Problems wurde in jüngerer Zeit auf verschiedenen Wegen versucht.

Weibel et al., "Enzyme Engineering", Vol. 2, S. 203 (Plenum Press, N.Y. 1973); Weibel, "Interdisciplinary Research on Enzyme Systems With Special Emphasis On Redox Reactions", Report No.NSF/RA 761624, S. 33 (Nat'l. Tech. Info. Serv., Washington, D.C. 1976) und Bright, Ibid., S. 10 haben das Nicotinamid-adenin-dinucleotid auf einem löslichen, hochmolekularen Dextrin immobilisiert und diesen immobilisierten Cofaktor und das ADH-Enzym unter Verwendung einer semi-permeablen Membrane eingeschlossen. Während die Aktivität und die Stabilität von solchen löslichen immobilisierten Cofaktoren ermutigend sind, ist die praktische Anwendung dieser Materialien zum gegenwärtigen Zeitpunkt wegen ihrer Zugänglichkeit und aufgrund von wirtschaftlichen Erwägungen ausgeschlossen. Davis (US-PS 3 915 799 vom 3. Oktober 1975) lehrt die Zurückhaltung des Cofaktors unter Verwendung eines beträchtlichen Überschusses an Enzym über den Cofaktor, wobei der Cofaktor als ein an das Enzym gebundener Komplex zurückgehalten wird, welcher seinerseits durch eine semi-permeable Membrane zurückgehalten wird. Dieser Versuch einer Lösung hat den Nachteil, dass zu jeder Zeit ein grosser Teil des Enzyms wegen der teilweisen Cofaktorbeladung inaktiv ist. Während der Cofaktor zurückgehalten wird,

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kann ein Cofaktorverlust nicht verhindert werden.

Ein dritter Lösungsweg besteht in der Verwendung einer Membrane, die genügend dicht ist, um sowohl das Enzym als auch den Cofaktor zurückzuhalten, während sowohl Substrat als auch Produkt hindurchwandern können (Chambers et al., "Enzyme Engineering", Vol. 2, Seite 195 (Plenum Press, N.Y. 1973)), Dieser Lösungsweg ist insofern nachteilhaft, als Membranen, die genügend dicht sind, um NAD+ zurückzuhalten, gleichseitig die Diffusion von kleineren Molekülen beträchtlich verzögern und so den Kontakt zwischen Enzym und Substrat verringern=

Bei der enzymkatalysierten Umwandlung des Äthanols oder Äthanol enthaltender Produkte zu Acetaldehyd ist die Regenerierung des erforderlichen Cofaktors, der bei der Oxidation des Äthanols reduziert wird, erwünscht, um ein auf kommerziellem Wege durchführbares Verfahren zu erhalten. Die Regenerierung des Cofaktors wurde unter Verwendung eines zweiten Enzyms erreicht, wie beispielsweise Lactatdehydrogenase, um den reduzierten Cofaktor (NADH) zu oxidieren, während ein zweites Substrat reduziert wird (Mosbach et al., "Enzyme Engineering", Vol. 2, Seite 143, Plenum Press, Ν.Ϊ. 1973). Dies erfordert die Abtrennung der Produkte, die aus den beiden Enzymreaktionen erhalten werden. Ein ähnlicher Lösungsweg wird von Fink in Enzyme Technology Digest, 5, 52 (1976) beschrieben, bei welchem jedoch kein zweites Enzym benötigt wird, und bei welchem Benzaldehyd zu der Reaktionsmischung hinzugegeben wird, welcher während der Äthanoloxidation,durch NADH reduziert wird und auf diese Weise eine Rückführung des NADH in NAD+ erfolgt. Dies macht wiederum die Abtrennung der Produkte erforderlich. Ein dritter Lösungsweg besteht darin, den reduzierten Cofaktor schliesslich mit molekularem Sauerstoff zu oxidieren, entweder über einen geeigneten, zwischengeschalte-* ten Protonenakzepton', wie beispielsweise Flavin, oder.auf direktem Wege unter Verwendung eines Ensyms, wie beispiels-

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weise Diaphorase (Chambers, supra; Jones, Enzyme Technology Digest, 5, 50 (1976)).

Neben diesen Schwierigkeiten zur S chaffung eines praktischen, enzymkatalysierten Verfahrens zur Umwandlung von Äthanol, insbesondere von Äthanol, das als Bestandteil in einer komplexen Mischung, wie einer Essenz, enthalten ist, zu Acetaldehyd, ist diese Gleichgewichtsumwandlung in thermodynamischer Hinsicht für eine merkliche Oxidation des Äthanols ungünstig. Tatsächlich begünstigen Gleichgewxchtserwägungen die umgekehrte Reaktion, das heisst die Umwandlung des Acetaldehyds in Äthanol, selbst unter theoretisch ungünstigen Bedingungen, wie beispielsweise bei Vorliegen des Äthanols in einem beträchtlichen Überschuss. Das Gleichgewicht kann jedoch zugunsten der Bildung von Acetaldehyd verschoben werden, indem man den Acetaldehyd bei seiner Bildung entfernt. Bislang wurde dies dadurch erreicht, dass man entweder ein Carbonyladditionsprodukt des Acetaldehyds (beispielsweise mit Natriumbisulfit) bildete, oder eine enzymatische Umwandlung des Acetaldehyds zu einem anderen Produkt mittels einer irreversiblen oder thermodynamisch günstigen Gleichgewichtsreaktion durchführte (beispielsweise durch Oxidation des Acetaldehyds zu Essigsäure). Es ist offensichtlich, daß ein solches Vorgehen unerwünscht ist, wenn man Acetaldehyd oder ein mit Acetaldehyd angereichertes Produkt erhalten woll.

Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, um auf ökonomische Weise und auf natürlichem Wege beträchtlich erhöhte Mengen an Acetaldehyd in situ in Orangen-Essenz aus dem darin natürlich vorkommenden Äthanol.zu erzeugen, während andere Änderungen in der Zusammensetzung der Essenz, die unerwünscht sein könnten, auf einem Minimum gehalten werden.

Bei der Entwicklung eines Verfahrens, das diese Aufgabe zu lösen imstande ist, wurden weitere Entdeckungen gemacht, die Lösungen

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allgemeinerer Aufgaben darstellen, beispielsweise die ökonomische Umwandlung von Äthanol oder Äthanol enthaltenden Produkten, ausser Orangen-Essenz, zu Acetaldehyd oder zu Produkten mit einem angereicherten Gehalt an Acetaldehyd, und ein Verfahren zum Stabilisieren von Acetaldehydlösungen. Die Lösung dieser und anderer Aufgaben wird aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich werden.

Gemäss der Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren entwickelt für die enzymkatalysierte in situ-Umwandlung von in einer Fruchtessenz vorhandenem Äthanol, insbesondere Orangen-Essenz, zu Acetaldehyd, um eine mit Acetaldehyd angereicherte Essenz zu erhalten. Im speziellen umfasst das Verfahren die Verwendung von Älkoholdehydrogenase und ihres Cofaktors Nicotinamid-adenin-dinucleotid, um das in der Orangen-Essenz vorhandene Äthanol zu Aldehyd umzuwandeln, wobei lediglich das Alkoholdehydrogenase-Enzym durch eine semi-permeable Membrane zurückgehalten oder isoliert wird, während eine freie Diffusion der Essenz, des Cofaktors und der Reaktionsprodukte durch die Membrane gestattet wird. Darüber hinaus beinhaltet das Verfahren die Verwendung eines speziellen Materials, das heisst Tri-(hydroxymethyl)-methylamin, um die Reaktionslösung zu puffern und, was noch wichtiger ist, einen Anlagerungskomplex mit dem Acetaldehyd zu bilden, der bei der Umsetzung gebildet wird. Durch diese Komplexbildung wird der Acetaldehyd im wesentlichen aus dem Reaktionssystem "entfernt",und dadurch verschiebt sich die Gleichgewichtsreaktion zugunsten der Bildung von zusätzlichen Acetaldehyd. Der "gebildete Komplex ändert die chemische Natur des Acetaldehydproduktes per se nicht, und der Acetaldehyd kann durch sehr einfache Massnahmen quantitativ aus dem Komplex zurückgewonnen werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Orangen-Essenz behandelt, um erhöhte Mengen an gewünschtem Acetaldehyd in situ zu erzeugen, und zwar durch ein Verfahren,

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welches die Inberührung-Bringung von Orangen-Essenz, Alkoholdehydrogenase, Nicotinamid-adenin-dinucleotid und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin unter solchen Bedingungen beinhaltet, bei denen das in der Essenz enthaltene Äthanol zu Acetaldehyd umgewandelt wird, wobei der erzeugte Acetaldehyd mit dem Tri-(hydroxymethyl)-methylamin einen Anlagerungskomplex bildet. Während des Ablaufes der Oxidationsreaktion wird der Cofaktor Nicotinamid-adenin-dinucleotid reduziert. Die Regenerierung dieses Cofaktors, die erforderlich ist, um die Umwandlung des Äthanols zu Acetaldehyd zu unterhalten, wird dadurch erreicht, dass man den reduzierten Cofaktor mit einem Oxidationsmittel unter geeigneten Bedingungen in Berührung bringt. Dieses Oxidationsmittel, das selbst während der Regenerierung des reduzierten Cofaktors reduziert wird, wird seinerseits durch geeignete Oxidationsmittel regeneriert.

Gemäss weiterer spezieller .Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung wird ein bevorzugtes Verfahren, wie das oben beschriebene, unter Verwendung besonders günstiger Materialien skizziert. Das Gesamtreaktxonsschema kann wie folgt dargestellt werden:

Acetaldehyd _K -.NADH ν , ^FMN - H₀O₀ ^

Λ /* ir ¹N f ^{2 2}^n

ADH Licht O₂ . Katalase Äthanol S ^ NAD+ i/ V» FMNH₂ J ^ O₂ *< > H₂O

Bei dieser Umsetzung wird Äthanol (beispielsweise vorhanden in Orangen-Essenz) in Gegenwart von Alkohdldehydrogenase und Nicotinamid-adenin-dinucleotid zu Acetaldehyd umgewandelt, in zusätzlicher Gegenwart von Tri-(hydroxymethyl)-methylamin (nicht dargestellt), um die Reaktion zu puffern und den gebildeten Acetaldehyd zu komplexieren. Der Cofaktor wird durch lichtkatalysierte Oxidation des reduzierten Cofaktors mit Flavinmononucleotid (FMN) regeneriert. Das reduzierte Flavinmononucleotid (FMNH₂) wird durch Oxidation mit molekularem

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Sauerstoff wieder in FMN umgewandelt.Das Nebenprodukt dieser letzteren Umwandlung, Wasserstoffperoxid, wird durch Einwirkung der Enzymkatalase zu Sauerstoff und Wasser zersetzt, wobei der auf diese Weise erzeugte Sauerstoff für die Oxidation von FMNH₂, wie oben beschrieben, zur Verfügung steht.

Wie bereits erwähnt, besteht ein wichtiger Gesichtspunkt des oben beschriebenen Verfahrens in der Verwendung von Tri-(hydroxymethyl)-methylamin, um mit dem gebildeten Acetaldehyd einen Anlagerungskomplex zu bilden und dabei die enzymkatalysierte Gleichgewichtsumwandlung des Äthanols zu verstärken. Ein anderer wichtiger Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung der Alkoholdehydrogenase in der Reaktion. So wurde gefunden, dass, obgleich es theoretisch möglich ist, die gesamte Reaktionsabfolge auf eine Weise durchzuführen, bei der sämtliche.Reaktionsteilnehmer und Produkte miteinander vermischt und den geeigneten Reaktionsbedingungen unterworfen werden können, ein solches Verfahren zu einer oder mehreren unerwünschten Reaktionen führen kann. Beispielsweise kann die Einwirkung der lichtkatalysierten Regenerierung des Nicotinamidadenin-dinucleotids oder die sauerstoffinduzierte Oxidation des reduzierten Flavinmononucleotids oder die Einwirkung beider Reaktionen auf die Alkoholdehydrogenase zu einem Abbau, einer Inaktivierung oder Zerstörung dieses Enzyms führen. Die gleichen nachteiligen Auswirkungen können dann eintreten, wenn dieses Enzym während der Verfahrensmassnahmen und -bedingungen anwesend ist, die zur Rückgewinnung des Acetaldehyds aus dem Anlagerungskomplex mit Tri- (hydroxymeiliyl)-triethylamin angewandt werden, und selbst durch das einfache Nebeneinandervorliegen des Enzyms und des freien Adetaldehyds für irgendeinen Zeitraum.

Demzufolge wurde ein Verfahrensschema entwickelt, welches auf der Isolierung der Alkoholdehydrogenase während der Reaktionsabfolge beruht. Ungleich bestimmten bekannten Verfahren muss

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jedoch nur die Alkoholdehydrogenase isoliert werden (wie dies nachfolgend diskutiert werden wird, wobei andere Enzyme, wie beispielsweise Katalase, die in dem Verfahren Anwendung finden, ebenfalls irgend eine Form von Isolierung von besonderen Reaktionsmaterialien oder -bedingungen erforderlich machen) , das heisst, der Nicotinamid-adenin-dinucleotid-Cofaktor muss nicht auf ähnliche Weise isoliert und eingeschlossen werden.

Gemäss diesem Verfahren wird eine erste Zone gebildet, die die Alkoholdehydrogenase und die anderen Materialien und Reaktionsteilnehmer, die in dem Verfahren verwendet werden, enthält (beispielsweise Quellenmaterial für das Äthanol, Cofaktor, Flavinmononucleotid und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin (THAM)). Weiterhin wird eine zweite Zone gebildet, die die gleichen Materialien mit Ausnahme der Alkoholdehydrogenase enthält. Die Zonen werden durch eine semi-permeable Membrane getrennt, die solche Abmessungen aufweist, dass die Alkoholdehydrogenase in der ersten Zone zurückgehalten wird, jedoch den Durchgang aller anderen Ausgangsmaterialien und auch der während der Reaktionen gebildeten Produkte (einschliesslich des Acetaldehyd/Tri- (hydroxymethyl)-methylamin-Komplexes) zwischen den Zonen gestattet. Zu Beginn des Verfahrens reagiert das Äthanol in der ersten Zone in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase und ihres Cofaktors unter Bildung von Acetaldehyd, welcher dann mit dem THAM-Puffer einen Anlagerungskomplex bildet. Der sich dadurch ergebende Konzentrationsmangel an Äthanol in der ersten Zone stellt eine ^!Treibkraf t für die Diffusion des Äthanols in der zweiten Zone durch die Membrane dar, und dieses reagiert dann in der ersten Zone in Gegenwart des Enzyms und des Cofaktors, während der Acetaldehyd/THAM-Komplex aufgrund eines ähnlichen Konzentrationsgradienten durch die Membrane in die zweite Zone diffundiert. Auf gleiche Weise erfolgt eine Diffusion des reduzierten Cofaktors aus der ersten in die zweite Zone und eine Diffusion des Cofaktors aus der zweiten in die erste Zone.

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Die in der zweiten Zone vorhandenen Materialien können getrennt unter solchen Bedingungen behandelt werden (beispielsweise Beleuchtung, Sauerstoffzugabe, Entfernung von Acetaldehyd) , welche zu den gewünschten Regenerierungs-, Zersetzungs- (beispielsweise von H₃O₂) oder Dekomplexierungsreaktionen führen, welche jedoch wünschenswerterweise von der Alkoholdehydrogenase entfernt gehalten werden. Die zweite Zone kann dann wieder mit der ersten Zone in Kontakt gebracht werden (durch die Membrane hindurch), um die erste Zone mit regenerierten Materialien zu ergänzen, zusätzliches Quellenmate- ^ rial für das Äthanol zur Verfügung zu stellen und das Acetaldehydprodukt und andere Produkte* für die Regenerierung aus der ersten Zone aufzunehmen.

Es ist offensichtlich, dass zur Lösung der speziellen Aufgabe der vorliegenden Erfindung Massnahmen angewandt werden, deren Hützlichkeit über den Rahmen der Lösung der Hauptaufgabe hinausgeht. Durch die Erkenntnisse, die im Zusammenhang mit dem Acetaldehyd/THAM-Komplex gemacht worden sind, wird durch die vorliegende Erfindung ein Weg zur Verfügung gestellt, der auf jede Gleichgewichtsumwandlung eines Produktes unter Bildung von Acetaldehyd anwendbar ist, wo Gleichgewichte oder andere Überlegungen es wünschenswert erscheinen lassen, eine schnelle Entfernung von freiem, nicht komplexiertem Acetaldehyd aus dem Reaktionssystem vorzunehmen, ohne dass die chemische Natur des gewünschten Produktes geändert wird, und auf solche Weise, dass das gewünschte Produkt auf einfache Weise gewonnen werden kann. Aufgrund der gleichen Erkenntnisse bietet die vorliegende Erfindung in grundlegender Weise ein Mittel zur Stabilisierung von Acetaldehyd in Lösung in einer Form, die die grundlegende chemische Integrität des Acetaldehyds unangetastet lässt, und aus welcher der Acetaldehyd auf einfache Weise zurückgewonnen werden kann. Im Zusammenhang mit den Erkenntnissen_s die die physikalische Zurückhaltung der Alkoholdehydrogenase, nicht jedoch ihres Cofaktors, bei einer Reaktionsabfolge, bei der diese Materialien eingesetzt werden, betreffen, bietet

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die vorliegende Erfindung per se weiterhin einen geeigneten Weg für die Durchführung solcher Reaktionen an (das heisst ohne besondere Rücksicht auf bestimmte Komplexierungsmittel, Regenerierungstechniken und dergleichen).

Es ist gleichfalls offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung, was die Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd betrifft, auf jede Äthanolquelle anwendbar ist, unabhängig davon, ob das Äthanol im wesentlichen rein ist oder in Mischung mit anderen Komponenten vorliegt, ob es aus einer künstlichen oder einer natürlichen Quelle stammt, oder ob das gewünschte Produkt Acetaldehyd per se oder ein an Acetaldehyd angereichertes Produkt ist.

Die verschiedenen Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung werden nachstehend mit Hilfe von Zeichnungen und einer Anzahl von Ausführungsbeispielen im einzelnen weiter erläutert.

Gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Äthanol oder ein Äthanol enthaltendes Produkt (Substrat) in flüssiger Phase in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase (ADH), ihres Cofaktors Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+) und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin (THAM) umgesetzt, um Acetaldehyd in Form eines Anlagerungskomplexes mit THAM zu bilden. Die Bedingungen dieser Reaktion werden so gewählt, dass sowohl die gewünschte Reaktion als auch die Bildung des Anlagerungskomplexes erfolgen. Im allgemeinen wird die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von etwa 18° bis etwa 40⁰C, vorzugsweise 25°C bis etwa 30⁰C, und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 9,0, vorzugsweise von etwa 8,2 bis 8,7, durchgeführt. Bei Temperaturen unterhalb etwa 18⁰C wird die Geschwindigkeit der enzymkatalysierten Reaktion als unökonomisch gering erachtet, während Temperaturen oberhalb etwa 40⁰C in die Nähe solcher Temperaturen kommen, bei denen das Enzym durch Denaturierung inaktiv wird. Bei dieser Reaktion

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werden die relativen Mengen an Reaktionsteilnehmern (einschliesslich Substrat und NAD+), Enzym-Katalysator (ADH) und Puffer (THAM) so gewählt, dass eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit erzielt wird, um die Komplexbildung von im wesentlichen allem erzeugten Acetaldehyd zu gewährleisten (die Anwesenheit von freiem Acetaldehyd beeinflusst in nachteilhafter Weise die Geschwindigkeit und das Ausmass der Vollständigkeit der Reaktion und hat eine inhibierende Wirkung auf die ADH-Aktivität), und um eine ausreichende Pufferkapazität in dem Reaktionssystem sicherzustellen.

Im allgemeinen bedingen diese Erwägungen eine solche Menge an THAM, die ausreicht, um wenigstens ein Molverhältnis von 0,5:1 in der Reaktionslösung, bezogen auf den darin erzeugten Acetaldehyd, zu ergeben, vorzugsweise von wenigstens 1,5:1 bis 2,0:1. Die praktische obere Grenze dieses Verhältnisses von THAM zu Acetaldehyd wird in erster Linie eher durch ökonomische als durch chemische oder funktioneile Erwägungen bedingt. Typischerweise wird es selten notwendig sein, ein Molverhältnis von oberhalb etwa 5,0:1 anzuwenden. Das Molverhältnis von NAD+ zu ADH wird typischerweise in einem Bereich von etwa 50:1 bis etwa 500:1 gehalten, wobei die maximale Reaktionsgeschwindigkeit bei einem Molverhältnis von etwa 380:1 erreicht wird.

Um eine länger unterhaltene Reaktion zur weiteren Herstellung von Acetaldehyd zu erhalten,. ist es notwendig, dass.das bei der Reaktion reduzierte Nikotinamid-aäenin-dinucleotid regeneriert wird, um für die weitere Reaktion zur Verfügung zu stehen ο Zu diesem Zweck enthält das Reaktionssystem ein Oxidationsmittel, das in der Lage ist, reduziertes NAD+ (NADH) zu NAD+ zn oxidieren. Die funktionellen Erfordernisse für dieses Oxidationsmittel bestehen einfach in der Fähigkeit, diese Regenerierung zuwege zu bringen, ohne dass ein Teil des NAD+- Moleküls so zerstört wird, dass es nicht mehr als effektiver

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Cofaktor für ADH in der Hauptreaktion wirken kann, in der chemischen Verträglichkeit mit anderen Bestandteilen des Reaktionssystems, darin, dass andere gewünschte Reaktionen nicht gestört werden,und in der Wasserlöslichkeit. Die sekundären, aber dennoch wichtigen Erfordernisse umfassen Kosten und Zugänglichkeit, und, sofern Nahrungsmittel betroffen sind, Nahrungsmittelverträglichkeit. Wenn darüber hinaus die Äthanolquelle eine komplexe Geschmacks- und/oder Aromafraktion ist, ist es offensichtlich wünschenswert, dass das Oxidationsmittel so gewählt wird, dass es keine ungewünschten Änderungen bei den anderen Bestandteilen der Fraktion hervorruft. Weiterhin ist es wünschenswert, wenn die ReaJctionsabfolge die weitere Regenerierung von in der Reaktion verwendeten Materialien umfasst, dass das Oxidationsmittel so gewählt wird, dass es seine eigene Regenerierung auf eine solche Weise gestattet, die nicht übermässig komplex ist und keinen nachteiligen Einfluss auf die anderen Materialien in dem System hat oder zu Nebenprodukten führt, die solche nachteiligen Auswirkungen ausüben.

Das bevorzugte Oxidationsmittel, das all diese Kriterien erfüllt, ist Flavinmononucleotid (FMN). Andere Mittel umfassen Riboflavin, Cytochrome, Chinone, Phenazinmethosulfat, 2,6-Dichlorphenylindophenol, Acriflavin und Flavin-adenin-dinucleotid.

Die Verwendung des bevorzugten Oxidationsmittels, FMN, erfordert eine Beleuchtung", um die Oxidation des NADH zu NAD+ herbeizuführen. Dies wiederum verursacht das Problem von möglicherweise nachteiligen Auswirkungen durch₍die Beleuchtung auf das ADH-Enzym infolge von fotokatalytisehen Effekten. Es wird daher vorgezogen, die lichtkatalysierte Oxidation mit FMN in Abwesenheit des ADH-Enzyms durchzuführen. Wie bereits oben beschrieben und nachfolgend im einzelnen erläutert werden wird, ist die Verwendung einer semi-permeablen Membrane, um ADH auf der einen Seite zurückzuhalten, ein wirksames Mittel, um dies zu erreichen.

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Im Hinblick auf das Reaktionsschema bleiben die Bedingungen insoweit für die grundlegende Reaktion des Äthanols zu Acetaldehyd im wesentlichen unveränderte trotz der Anwesenheit des Oxidationsmittels in der Reaktionslösung. Im allgemeinen ist das Oxidationsmittel, beispielsweise FMN, in der Reaktionsmischung in einem Molverhältnis von etwa lsi bis etwa 17:1, bezogen auf NAD+, vorzugsweise in einem Bereich von etwa 3s1 bis etwa 10:1, vorhanden. Wenn die Oxidation von NADH zu NAD+ unter Verwendung von PMN erfolgt, wird die Belichtung dieser Reaktionsteilnehmer mit einer Beleuchtungsquelle wie beispielsweise Tageslicht oder kaltes, weisses Fluoreszenzlicht bevorzugt, obgleich auch kurzx^elliges UV-Licht, langwelliges UV-Licht oder Glühlicht verwendet werden kann« Im allgemeinen wird Licht eines Wellenlängenberexchs von etwa 4000 Ä bis etwa 5200 A bevorzugt, wobei ein optimaler Bereich im Bereich von etwa 4400 A bis etwa 4600 A liegt=

In weiterer Optimierung des ReaktiossSchemas können Mittel vorgesehen sein, um das Oxidationsmittel zu regenerieren, das während der Oxidation von NADH zu NÄD+ reduziert worden ist. Auch hier müssen die Mittel sur Durchführung dieser Regenerierung, sowohl im Hinblick auf die angewandten Bedingungen als auch im Hinblick auf die erzeugten nebenprodukte, verträglich mit den anderen Bestandteilen und den Reaktionen sein, obgleich, , wie bereits oben erwähnt, die Isolierung des ADH-Knzyms ein wirksames Mittel ist, um nachteilige Auswirkungen irgendeiner gewählten Regenerierungstechnik auf einem Minimum zu halten. r-.i

In dieser Hinsicht bevorzugt, insbesondere wenn FMN als Oxidationsmittel verwendet wird, ist die einfache Oxidation von reduziertem FMN (FMNBNg) zu FMN in Anwesenheit von molekularem

Sauerstoff. Da Sauerstoff das ADH-Enzym abbauen kann, wird auch hier diese Regenerierung von FMN vorzugsweise in Abwesenheit von ADH durchgeführt. Der Oxidationsgrad von FMNH₂ zu kann dadurch kontrolliert bst-7. verfolgt werden, dass man

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die Farbe der Lösung mit dem Auge oder spektrofotometrisch überwacht. Wenn FMN reduziert wird, wird ein Abklingen der

Absorption bei 4500 A beobachtet, und die reflektierte Farbe ändert sich von gelb-orange in amber und schliesslich in bläulich-grün. Demzufolge kann die Sauerstoffzugabegeschwindigkeit so eingestellt werden, dass die gelb-orange Farbe beibehalten wird.

Das Nebenprodukt der Sauerstoffregenerierung von FMN ist Wasserstoffperoxid, eine Verbindung, die auf das ADH-Enzym einen zerstörenden Einfluss hat. "Es ist deshalb äusserst wünschenswert, diese Reaktion nicht nur in Abwesenheit von ADH durchzuführen, sondern auch das H₂O₂ so schnell wie möglich nach seiner Bildung zu entfernen, um einen möglichen Kontakt mit ADH in solchen Fällen auf ein Minimum zu beschränken, bei denen die Reaktionslösung für die Berührung damit rezirkuliert wird. Ein wirksames Mittel, dies zu erreichen, besteht darin, das H₂O₂ durch die Einwirkung von Enzymkatalase zu Wasser und Sauerstoff zu zersetzen. Die Katalase kann zusammen mit dem ADH-Enzym anwesend sein (die Isolierung wegen abbauender Einflüsse durch beispielsweise Belichtung ist in gleicher Weise auch auf die Katalase anwendbar). Vorzugsweise ist die Katalase selbst jedoch während der Reaktionsabfolge von ADH getrennt, so dass die Peroxid-Zersetzung ohne besonderes Augenmerk auf eine mögliche Berührung mit ADH durchgeführt werden kann.

Die Kombination und Wechselwirkung der oben beschriebenen Merkmale und Massnahmeikönnen im Hinblick 'auf das schematische Diagramm des in Fig. 1 dargestellten halbkontinuierlichen Reaktionssystems auf einfachere Weise erläutert werden.

Die Mittel, um ADH in diesem Reaktionssystem getrennt zu halten, umfassen eine Hohlfasereinheit 10, die aus einer Mehrzahl von hohlen Fasern 12 aus semi-permeablem Membranematerial mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von etwa 10.000 besteht, wobei diese Fasern in einer Patronenhülse 14 angeordnet sind. Wie in Fig.

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dargestellt, sind drei dieser Einheiten parallel geschaltet, um erhöhte Durchsätze zu gestatten. Es ist jedoch offensichtlich,, dass die Anzahl, Grosse und Anordnung dieser Einheiten je nach besonderen Verfahrensvorteilen variiert werden können»

Das im Gefäss 16 enthaltene Äthanol enthaltende Substrat wird mit einer aus dem Gefäss 18 kommenden, THAM-gepufferten (pH-Wert 8,5) und NAD+, FMN und Zinkchlorid enthaltenden Lösung in Leitung 20 vermengt und in dem statischen Mischer 22 vermischt, Zinkchlorid ist ein weiterer Cofaktor, der die Reaktion unterhält und einen schützenden Einfluss auf das ADH-Enzym ausübt, und es kann typischerttfeise in einem Molverhältnis, bezogen auf Älkoholdehydrogenase, von etwa 5s1 bis 500s1, vorzugsweise von etwa 20s1 bis 100s1, angewandt werden, wobei optimale Ergebnisse bei einem MolverhSltnis von etwa 50s1 erzielt werden. Die erhaltene Lösung itfird aus dem Bewegungsgefäss 24 herausgepumpt und durch die in den Pasereinheiten 10 enthaltenen Fasern 12 zirkuliert,, ADH-Enzym und Katalase werden in dem gleichen THÄM/MAD+/FMM/ZnCl,-Medium aufgelöst und aus dem Gefäss 26 in Leitung 28 eingeführt und in den Patronenhülsen 14 der Fasereinheiten 10 zirkuliert (so dass die Zirkulation an der Aussenseite der Faser 12 erfolgt), und zwar über Leitungen 30 oder 32, je nachdem, ob ein Gegenstrom oder ein Gleichstrom gewünscht wird«

Innerhalb der Fasereinheiten 10 findet die Umsetzung des Äthanols su Acetaldehyd in Anwesenheit von ADH statt, das in den Patronenhülsen 14 zirkuliert,, itf©b<öäi' das Äthanol zu Beginn durch den ADB-»Zuführungsstrom _e und bei Fortschreiten des Verfahrens durch Diffusion des Äthanols aus dem in den Hohlfasern 12 zirkulierenden Strom durch die die Membrane bildenden Fasern hindurch in den ADB enthaltenden Strom„ zur Verfügung gestellt wird. Auf ähnliche Weise diffundiert der bei der " Reaktion erzeugte und mit THAM komplexierte Acetaldehyd durch die Membrane in den Strom, der innerhalb der Hohlfasern zirkuliert»

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Der aus den Fasern austretende abfliessende Strom verlässt die Fasereinheiten über Leitungen 34, 35 und 36 und wird in Leitung 38 vermischt, von wo aus er zur Belichtung mit Fluoreszenzlicht, um NADH zu NAD+ zu oxidieren, durch die Belichtungseinheit 40 geführt wird, wobei NADH in diesem abfliessenden Strom wegen seiner Diffusion durch die Membrane aus dem Enzym enthaltenden Strom, wo es durch Reduktion des NAD+ bei der Ä thanolreaktion gebildet wurde, anwesend ist . Nach der Durchführung durch die Bestrahlungseinheit wird ein Teil des abfliessenden Stromes in das Titrationsgefäss 42 gepumpt, wo der pH-Wert so eingestellt wird, dass eine Dekomplexierung des Acetaldehyd von THAM erfolgt, und ^rdann in den Verdampfer 44 gepumpt, um flüchtige Bestandteile abzuziehen und in der Kühlfalle 46 aufzufangen. Nach Wiedereinstellen des pH-Wertes wird das verbleibende Konzentrat im Verdampfer zu dem Gefäss zurückgeführt.

Der restliche Teil des abfliessenden Stromes wird über Leitung 50 in das Bewegungsgefäss 24 gepumpt, wo eine Sprinklung mit Sauerstoff (oxygen sparging) durchgeführt wird, um in der Bestrahlungsvorrichtung 40 erzeugtes FMNH₂ in FMN zurückzuverwandeln. Das Bewegungsgefäss 24 ist typischerweise mit einer Kühlfalle 52 ausgerüstet, um Verluste von mitgerissenen flüchtigen Materialien während der Sauerstoffanreicherung zu verhindern. Die Bestandteile des Bewegungsgefässes 24 werden, wie zuvor beschrieben, durch die Hohlfasern 12 rezirkuliert, wobei zusätzliche Mengen an THAM, NAD+, FMN und Äthanol enthaltendem Substrat hinzugefügt werden (aus den Gefässen 16 und 18), soweit erforderlich, um die Reaktion zu unterhalten und die gewünschten Konzentrationsgradienten einzustellen.

NAD+ kann periodisch gereinigt werden, beispielsweise durch Acetonausfällung aus der Pufferlösung, oder durch Gelfiltration auf Sephadex G-10, gefolgt von der Abtrennung von FMN und Nucleotidfragmenten auf einer DEAE-Sephadex-Anionenaustauschersäule, wobei mit Natriumacetatpuffer (ph-Wert 4,7)

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165 033

eluiert wird. Die NAD+-Fraktion wird durch Gelfiltration entsalzt und gefriergetrocknet. Das FMN wird mit Ammoniumsulfat aus der DEÄE-Sephadex-Säule ausgewaschen und verworfen. Diese NAD+-Reinigungsstufe ist eine wahlweise Vorsiehtsmassnahme, um sicherzustellen, dass Fragmente von NAD+, die sich gegenüber ADH hemmend auswirken (in erster Linie Adenosinmonophosphat, Adenosindiphosphat und ADP-Ribose) keine hemmenden Konzentrationen im Reaktionsgefäss erreichen. Die durchschnittliche Wiedergewinnung von NAD+ liegt bei diesem Verfahren bei 97 %.

Die Verwendung von THAM dient in. dem oben beschriebenen Verfahren,, und auch im Hinblick auf andere Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung, nicht nur dazu, das Reaktionssystem zu puffern, sondern auch dazu, das sonst ungünstige Gleichgewicht der enzymkatalysierten Äthanolreaktion zu verändern, indem sie ein Mittel darstellt, um den Acetaldehyd, so wie er entsteht, zu ™entfernen" (das heisst zu binden).

Es wurde aufgrund von Experimenten festgestellt (von denen einige nachfolgend als Beispiele beschrieben werden), dass Acetaldehyd in alkalischer Lösung einen schwachen, nichtgebundenen Anlagerungskomplex mit dem Puffermittel (THAM) bildet. In alkalischen Lösungen des Komplexes kann der freie Acetaldehyd quantitativ durch herkömmliehe Destillation bei atmosphärischem Druck (100⁰C) wiedergewonnen werden= Die teilweise Rückgewinnung des reinen Acetaldehyds aus alkalischer Lösung kann durch wiederholte Lösungsmrttelextraktionen oder wiederholte Vakuumdestillation bei niedriger Temperatur erreicht werden. Wenn der pH-Wert einer Lösung des Komplexes jedoch geringfügig auf unterhalb des Neutralpunkts verringert wird, wird die Anlagerung geschwächt, der Acetaldehyd befreit, und er kann dadurch quantitativ durch Vakuumdestillation bei niedriger Temperatur zurückgewonnen werden (beispielsweise 8 bis 15°C)o Der Mechanismus der Komplexbildung scheint nur eine Wasserstoffbindung zwischen den Hydroxyl- und Aminogruppen von THAM und der hydratisieren Form des Acetaldehyds

&t S

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zu beinhalten. Die spektroskopische überwachung des Komplexes in Lösung ergibt keine Anhaltspunkte für die Bildung einer Schiff'sehen Base zwischen der Carbonylgruppe des Acetaldehyds und der Aminofunktion von THAM, wahrscheinlich deshalb, weil THAM bei dem pH-Wert der Reaktionsmischung eine stärkere Base ist als die Aldehydcarbonylgruppe, und es (THAM) deshalb dazu neigt, eher protoniert zu werden als einen nucleophilen Charakter zu zeigen. Der komplexierte Acetaldehyd kann quantitativ durch Gasflüssigchormatographie (GLC) oder durch colorimetrische Standardanalyse bestimmt werden. Die Pufferkapazität von THAM wird durch die Komplexbilduhg nicht augenscheinlich beeinträchtigt. Von allen, möglichen Puffern in diesem pH-Bereich, die im Rahmen der Erfindung so untersucht wurden, zeigte nur THAM die Fähigkeit, einen solchen Komplex mit Acetaldehyd zu bilden. Glycin und Glycylglycin beispielsweise reagieren langsam und irreversibel mit Acetaldehyd unter Bildung von Iminen.

Diese Funktionalität von THAM in Gegenwart von Acetaldehyd macht es möglich, die enzymkatalysierte Äthanolumdwandlungsreaktion trotz des sonst ungünstigen Gleichgewichtes durchzuführen, und es werden daneben Verluste durch Verdampfung und Entzündungsgefahren während des gesamten Verfahrens auf ein Minimum beschränkt. Diese gleiche Funktionalität von THAM kann in vorteilhafter Weise auch in jedem anderen Verfahren ausgenutzt werden, wo es wünschenswert ist, entweder aus Gleichgewichtsgründen oder aus anderen Gründen, den entweder hergestellten oder im Verfahren anwesenden Acetaldehyd zu komplexieren, zu binden oder zu stabilisieren. Darüber 'hinaus kann THAM auch einfach bei der Stabilisierung von alkalischen Lösungen des Acetaldehyds unter geeigneten Bedingungen Anwendung finden (bei einem pH-Wert von 7,0 bis etwa 9,0, vorzugsweise 8,2 bis 8,7; bei Temperaturen unterhalb etwa 35⁰C und vorzugsweise im Bereich von etwa 20⁰C bis etwa 3O⁰C; und bei einem Molverhältnis von THAM zu Acetaldehyd von wenigstens etwa 0,5:1 und vorzugsweise im Bereich von etwa 1,5:1 bis etwa 2,5:1), wo

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es beispielsweise wünschenswert ist, Verluste durch Verdampfung su vermeiden oder die Entzündungsgefahr bzw. Entflammbarkeit während der Lagerung oder des Transports auf einem Minimum zu halten. Der Acetaldehyd kann dann durch Destillation bei atmosphärischem Druck oder durch Einstellung des pH-Wertes (beispielsweise auf einen Bereich von etwa 6,0 bis etwa 6,8) und Vakuumdestillation bei erniedrigter Temperatur (beispielsweise 10⁰C bis 15⁰C) von THAM dekomplexiert werden.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern eine Reihe von Merkmalen und Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung.

Beispiel I

Ansatzweises Reaktorsystem (200 ml Arbeitsvolumen). Eine Amicon H1P1Ö Hohlfaserpatrone (0,0924 qm (Isq.ft.) Faseroberfläche), die in einem DH-4-Adapter befestigt war, wurde bei diesem Laborsystem gemäss dem schematischen Diagramm von Figο 2 verwendet. Ein Sprenggefäss 101 (150 ml Kapazität) wurde nacheinander mit einer -30°C~Kondensiervorrichtung 102 und einer Falle mit flüssigem Stickstoff und einer Scheidewandöffnung zur Probenentnahme versehen.

Es wurden 200 ml Reaktionslösung hergestellt,, die 0,2 M THAM-Glycinpuffer (pH-Wert 0,9), 750 mg NAD+ (5,3 χ 10**³ M), 3,0 g FMN (3,3 χ 10~² M), ZnCl₂ (5 χ 1 θ"⁴ M), 100 ml Orangen-Essenz und 1990 ppm Aceton (interner gaschromatographxscher Standard) enthielt. Die anfänglichen Konzentrationen für Acetaldehyd und Äthanol in dieser Mischung lagen bei 310 mg/1 bzw«, 21.500 mg pro Liter.

110 ml dieser Lösung wurden in das Sprenggefäss 101, ?.und der Rest in ein Enzymzuführungsgefäss 104 gegeben, enthaltend 40 mg ADH und 10 mg Katalase, und ausgerüstet mit einer Scheidewand. Die Ströme aus den Gefässen 101 und 104 wurden dann durch die Fasereinheit 105 zirkuliert, wobei der Strom aus dem Gefäss 101 durch die Hohlfaser 106, und der Strom

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165 033 _ £

aus dem Gefäss 104 an der Aussenseite der Fasern innerhalb der Patronenhülse 107 zirkulierten. Die Zirkulation dieser Ströme erfolgte im Gleichstrom bei einer Geschwindigkeit von 60 ml/min durch die Fasern und 80 ml/min durch die Patronenhülse. Das Sprengen bzw. Sprinkeln mit Sauerstoff wurde begonnen (kontrolliert durch Überwachung der Farbe mit dem Auge) und die Fluoreszenzlampe 110 eingeschaltet.

Die Analysen auf Acetaldehyd und Äthanol wurden auf einem Hewlett Packard 5840 Gaschromatographen durchgeführt, der auf ^ bekannte Standardkonzentrationen dieser Verbindungen geeicht war, unter Verwendung von Aceton a-ls internem Standard. Eine 182,4 χ 0,32 cm (6¹ χ 1/8") Glassäule mit einer Tenax G.C.Packung wurde verwendet, die einen Trägergasfluss von 10 ml/min aufwies. Aus der Scheidewandflasche wurden periodisch Proben (2 μΐ) entnommen und in die Säule eingespritzt. Die Ofentemperatur lag bei 110⁰C. Der H.P. 5840 wurde so programmiert, dass die Ergebnisse in mg/1 angegeben wurden.

Die Durchschnittsgeschwindigkeit der Acetaldehyderzeugung lag bei 488 mg/1/Stunde während 8 1/2 Stunden, wobei die Reaktion nach diesem Zeitpunkt deutlich langsamer ablief. Die tatsächliche in dem Reaktionsgefäss erzeugte Nettomenge an Acetaldehyd betrug 800 mg, was etwa einer zwölffachen Zunahme über die in der Ausgangsessenz vorliegenden Menge (62 mg) entsprach. Das Äthanol nahm um einen gleichen Betrag ab, entsprechend einer Nettooxidation von 18 %. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn anstelle von Essenz wässriges Äthanol verwendet wurde.

Bei dem Verfahren dieses Beispiels kann die Gesamtreaktionsabfolge wie folgt dargestellt werden:

C2H5OH + NAD+ ADH j NADH + CH3CHO + H+

HADE + H+ + FMN Licht^ _FMNij₂ + _NAD+

FMNH₂ + O₂ » FMN + H₂O₃

2H₂O₂ . Katalase ^ 2H₂O + O₂

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- 30 -

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Beispiel II

Halbkontinuierliches Reaktorsystem

Ein Laborreaktorsystem gemäss dem schematischen Diagramm von Fig. 1 wurde zur Behandlung von wässrigem Äthanol (30 g/l) in einer Reaktionsmischung verwendet, die in jeder Hinsicht derjenigen von Beispiel I entsprach, mit der Ausnahme, dass THAM-HCl anstelle von THAM-Glycin und kein Acetonstandard verwendet wurden. Der Reaktor wurde wie in Beispiel I beladen,und es wurde mit der Zirkulation durch die Amicon HIP1O-Einheit, dem Sprengen und der Belichtung begonnen. Abgewogene Mischungen von NAD+, FMN und ZnCl₂ wurden bei 4⁰C aufbewahrt und nach Bedarf mit 100 ml Puffer/Äthanol-Lösung gemischt. Einmal pro Stunde wurden 50 ml Produkt durch die automatische Titrationszelle entnommen, wo der pH-Wert mit 2 N HCl auf 6,5 eingestellt wurde, und dann in ein mit einem Stopfen verschlossenes, auf einer Temperatur von 1°C gehaltenes Aufnahmegefäss gegeben. Ein entsprechendes Volumen frischer Reaktionsmischung wurde dann in das Sprenggefäss gegeben.

Die gaschromatographische Analyse wurde wie in Beispiel I durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die aus den Zirkulationsströmen entnommenen Proben direkt injiziert wurden und der Acetaldehydgehalt durch Multiplizieren der groben Signalfläche mit dem Ansprechfaktor bestimmt. Die Proben des aus der pH-Zelle abfliessenden Produktes wurden bestimmt, indem man 0,5 ml Aceton als interner Standard (1990 ppm) in einen 5-ml-Masskolben gab und mit Probe auffüllte. Der H.P. 5840 wurde so programmiert, dass Acetaldehyd und Äthanol wie im Beispiel I in mg/1 angegeben wurden, unter Verwendung eines Korrektürfaktors für äie Verdünnung durch internen Standard und Säure.

Am Ende des Reaktorlaufes wurde der gesamte aus den Fasern abfliessende Strom über die pH-Zelle in den Aufnahmekolben gepumpt und das Volumen gemessen. Das Volumen des Enzymstromes wurde gemessen, und der Acetaldehydgehalt dieses Materials zuzüglich des abfliessenden Mischproduktes wurde mit Hilfe der

oben beschriebenen internen Standardmethode bestimmt, um die insgesamt hergestellte Menge an Acetaldehyd zu berechnen.

Die gesamte Acetaldehydanreicherung nach 9 Stunden betrug 1,3 g. Die Anreicherungsgeschwindigkeit blieb während der gesamten Zeitspanne konstant, was anzeigt, dass die Enzymaktivität nicht nachgelassen hat. Ein gleichbleibender Zustand wurde während der neun Stunden angenähert, jedoch nicht erreicht, da die Bildungsgeschwindigkeit des Acetaldehyds die Verdünnungsgeschwindigkeit durch neues Substrat übertraf. Die Konzentration an Acetaldehyd in dem Enzym-Pool erreichte näherungsweise nach 9 Stunden 2,5 g/l.^rDie Konzentration. im abfliessenden Produkt hinkte etwa 4 Stunden hinter derjenigen des Enzym-Pools hinterher und begann sich dann letzterer Konzentration anzugleichen, wobei der gleichbleibende Zustand angenähert wurde.

Beispiel III

Das ansatzweise Reaktorsystem von Beispiel I wurde, wie in Fig. 3 dargestellt, modifiziert, indem eine zweite Hohlfaservorrichtung 200, ein Bioflow 20-Becher (Dow Chemical Corp.), zwischen die Rückführung von dem Sprenggefäss 101 und die Ansaugseite der Pumpe , die zu dem Haupthohlfaserbündel 105 führt, hinzugefügt wurde . Die Bioflow 20-Fasern haben ein Grenzmolekulargewicht von 200 und gestatten deshalb nur den Durchtritt von Substrat, Produkt und Puffermolekülen, während sie gegenüber NAD+ und FMN als Barriere bzw. Sperre wirken. Der Reaktor wurde mit Enzymen und Reaktorflüssigkeit beladen (die Äthanol anstelle von Essenz enthielt). Eine Lösung (500 ml) von Äthanol der gleichen Konzentration (30 g/l) und 5 χ 10"⁴M ZnCl₂ in 0,2M THAM-HCl (pH-Wert 8,5) wurde durch die Hülle des Biofaser-Bechers unter kontinuierlichem magnetischen Rühren des Becherinhalts zirkuliert.

Nach 30 Stunden wurde der Reaktor abgestellt, und der Inhalt des Biofaserpermeat-Reservoirs durch Gasflüssigkeitschromato-

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graphie analysiert. Ein aliquoter Teil von 300 ml des Permeats wurde in einen 1-Liter-Siedekolben überführt und im Vakuum bei 10 mm Hg und bei einer Temperatur von 4⁰C destilliert, wobei in einer Falle mit flüssigem Stickstoff 133 ml Destillat aufgefangen wurden. Der Inhalt der Kühlfalle und derjenige des Siedekolbens wurden wie oben analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:

Acetaldehyd insgesamt

anfänglich

Destillat (A)

Topf
(B)

insgesamt (A+B)

mg 482

prozentualer Anteil der ursprünglichen Menge 100 %

33

454

487

6,8 %

94 % 100,8

Nach der Ansäuerung der Tppfflüssigkeit mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 6,5 erfolgte eine quantitative Destillation des restlichen Acetaldehyds.

Beispiel IV

Eine 100 ml-Reaktionsmischung, die 2 g NAD+, 0,2 M THAM/Glycin-Puffer (endgültiger pH-Wert 8,5), 4 g FMN, 10 ml Orangen-Essenz (endgültige Acetaldehyd-Konzentration von 64 ml/g? Äthanol 3600 mg/1) und 10 mg ADH enthielt, wurde hergestellt und eine Stunde bei Zimmertemperatur in einem verschlossenen 250-ml*-Siedekolben inkubiert.

Der Kolben wurde in einen Rotationsverdampfer gegeben und die, Hälfte des Inhalts bei einem Druck von 10 mm Hg und einer Temperatur von 6 bis 8⁰C destilliert, wobei das Destillat in einer Falle mit flüssigem Stickstoff gesammelt wurde. Der Kolben wurde entfernt, 50 ml Wasser hinzugefügt und der Inhalt wie oben bis zur Trockene nochmals destilliert.

Der Rückstand des Kolbens wurde in 50 ml Wasser aufgelöst und

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165 033 3

der pH-Wert mit 1 N HCl auf 6,0 eingestellt. Der Inhalt wurde wie oben zur Trockene destilliert und das Destillat in einer zweiten Falle mit flüssigem Stickstoff gesammelt.

Das Äthanol und der Acetaldehyd wurden in dem Material vor der Destillation, in dem kombinierten pH-Wert 8,5-Destillat und in dem pH-Wert 6,O-Destillat durch Gasflüssigchromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:

Probe	Volumen	Acetaldehyd"	Äthanol	Acetaldehyd	Äthanol
	(ml)	mg/l
anfänglich pH-Wert 8,5 pH-Wert 6,0	100 ^: 150 53	910 280 1120	2290 1380 400	46 % 62 %	90 % 9 %
ins gesamt (8,5+6,0)	ioo^a	98 0^a	2270^a	108 %	99 %

eingestellt auf der Basis des anfänglichen Volumens von 100 ml

Bei einem pH-Wert von 8,5 waren nach der Vakuumdestillation der ersten 50 ml weniger als 2 % des gesamten Acetaldehyde im Destillat vorhanden. Die Zugabe von Wasser und Destillation zur Trockene, wobei die Topftemperatür 15⁰C erreichte, führte zu einer vollständigeren Gewinnung des-Acetaldehyds (44 %). Nach Erniedrigung des pH-Wertes auf 6,0 destillierte der Rest augenblicklich über. Nach der Destillation wurde eine geringfügig höhere Ausbeute an Acetaldehyd im Vergleich zu derjenigen der Vordestillationsmischung erreicht, vermutlich wegen der anhaltenden Enzymaktivität während der anfänglichen Destillationsstufe. Im Gegensatz hierzu destillierten anfänglich 90 % des Äthanols bei einem pH-Wert von 8,5.

0D6f8/"096

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Eine zweite 150-ml-Reaktionsmischung wurde wie oben hergestellt und eine Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert. Durch Zugabe von 1 g Bromelain wurde ADH zerstört und der pH-Wert der Mischung wurde mit 1 N HCl auf 6,0 eingestellt. Die angesäuerte Mischung wurde wie oben destilliert und in einer Falle mit flüssigem Stickstoff wurden 103 ml Destillat gesammelt. Die Gasflüssigkeitschromatographie-Analyse der Reaktionsmischung vor der Ansäuerung und diejenige des Destillats ergaben, dass von ursprünglich insgesamt 200 mg anwesendem Acetaldehyd 194 mg (97 %) in den ersten 100 ml aus der angesäuerten Reaktionsmischung überdestillierten. Das Äthanol destillierte ebenfalls quantitativ über.

Beispiel V

Proben von 0,1 M THAM (pH-Wert 8,7) und etwa 2100 mg/1 Acetaldehyd in 0,1 M Ammoniumbicarbonat (pH-Wert 8,7) wurden in einem Spektrofotometer für UV- und sichtbares Licht von 1900

bis 8500 A unter Verwendung von Wasser bzw. 0,1 M Ammoniumbicarbonatlösung (pH-Wert 8,7) als Vergleichsproben vermessen.

THAM zeigt eine UV-Absorptionsbande mit einem Maximum bei 2000 A, und es ist oberhalb 2400 A transparent. Acetaldehyd zeigt eine schwache Carbonylabsorptionsbande mit einem Peak

bei 2800 A in Wasser, deren Intensität in Abhängigkeit von dem Hydratationsgrad variiert.

Eine dritte Probe, die 2100 mg/1 Acetaldehyd in 0,1 THAM (pH-Wert 8,7) enthielt, wurde- unmittelbar nach dem Mischen

- O

vermessen. Die Acetaldehydcarbonyl-Äbsorption bei 2800 A war in dem Augenblick, in dem die Mischung vermessen wurde, vollständig verschwunden. Die Ansäuerung mit 3,5 N HCl auf einen pH-Wert von 6,5 führte zu dem augenblicklichen Wiederauftauchen der Acetaldehydbande. Die gaschromatographische Analyse zeigte sowohl vor als auch nach der Ansäuerung die Anwesenheit von 2144 mg/1 Acetaldehyd.

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Eine vierte Probe, die 11 g/l (0,25M) Acetaldehyd in 0,1 M THAM (pH-Wert 8,7) enthielt, wurde wie oben augenblicklich vermessen und dann in Intervallen von 10 Minuten. Die anfängliche Absorption bei 280 ran betrug 1,08 und nahm nach 70 Minuten, als das THAM durch Acetaldehyd abgesättigt war, auf 0,89 ab. Auf der Grundlage eines Extinktionskoeffizienten von 8,62 für Acetaldehyd betrug das Sättxgungsverhältnis von Acetaldehyd:THAM 1,5:1. In beiden Proben wurden keine anderen Änderungen der UV-Absorptionskurven beobachtet.

Eine fünfte Probe wurde hergestellt, die 2000 mg/1 Acetaldehyd und 0,1 M Äthanolamin (pH-Wert 9) enthielt, und ein aliquoter Teil wurde unmittelbar anschliessend von 1900 bis 39OOA und dann in Intervallen von 5 Minuten vermessen. Die Absorptionsbande

bei 2800 A nahm ab und wurde schnell von einer gleichzeitig

wachsenden intensiven Bande bei 2270 A, die charakteristisch für eine Schiffsche Base ist, verdeckt. Nach dem Stehen über Nacht zeigte die Mischung, die nach einer Stunde klar war, eine leuchtende Korallenfarbe und eine neue Absorptionsbande bei 5150 A. Dieses Absorptionsmaximum bei 5150 A ist charakteristisch für Diazoverbindungen, von denen bekannt ist, dass sie sich durch Polymerisation von Schiff'sehen Basen bilden. Sowohl vor als auch nach der Ansäuerung konnten durch Gasflüssigkeits-Chromatographie nur 20 % des anfänglichen Acetaldehyd-Gehalts in dieser Mischung gefunden werden. Im Gegensatz hierzu begann ■ die 11 g/1-0,1 M THAM-Probe erst nach mehrwöchigem Stehen bei

Zimmertemperatur eine schwache Absorptionschulter bei 2270 A zu zeigen, die die Bildung einer Schiff'sehen Base anzeigt.

Beispiel VI

Es wurde eine Lösung (100 ml) von 2 g/l Acetaldehyd in 0,1 M THAM (pH-Wert 8,5) hergestellt und in ein automatisches Titrimetergefäss gegeben, das mit einem magnetischen Rührstab ausgerüstet war. Der Inhalt des Gefässes wurde kontinuierlich durch eine Durchflusszelle in einem UV-Spektrofotometer zirkuliert. Die Vergleichszelle enthielt 0,1 M THAM (pH-Wert 8,5).

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I65 033

Es wurde zunächst eine erste Vermessung von 1899 A bis 3900 A durchgeführt und dann wurde die pH-Werteinstellung des Titrimeters in Intervallen von 0,1 bis 0,4 pH-Wert-Einheiten verringert ,wobei man nach jeder pH-Werteinstellung 2 Minuten zum Mischen mit dem 2 N HCl-Txtranten verstreichen liess, bevor erneut vermessen wurde. Das Volumen an zugefügter Säure wurde

jedesmal zusammen mit der Absorption bei 2780 A aufgezeichnet. Die letzteren Werte wurden hinsichtlich der Verdünnung durch die Säure korrigiert. Der endgültige pH-Wert der Lösung betrug 3,2.

Eine, "sigmoide" Dissoziationskurve" wurde für THAM-Acetaldehyd . erhalten, wobei bei einem pH-Wert von 6,5 ein Wendepunkt auftrat (pKj-j) und zwischen einem pH-Wert von 3,3 und 5 eine 100 %ige Dissoziation erreicht bzw. angenähert wurde. Während der Komplex bei einem pH-Wert von 6,5 nur zu 50 % dissoziiert ist, ist eine quantitative Vakuumdestillation des Acetaldehyds bei diesem pH-Wert möglich, was dafür spricht, dass die Anziehungskräfte in dem Komplex sehr schwach sind.

Beispiel VII

Es wurde eine Kontrollprobe von 2 g Acetaldehyd in 1 1 Wasser hergestellt und wie oben beschrieben in einem UV-Spektrofotometer vermessen. Die Probe wurde bei TOO⁰C destilliert, wobei die ersten 90 ml Kondensat in einem 100 ml-Messzylinder aufgefangen wurden, der anfänglich 8 ml Wasser in einem Eisbad enthielt. Ein Teil des Rohres der Kondensationsvorrichtungsspitze erstreckte sich bis unterhalb der Oberfläche des anfänglich anwesenden Wasservolumens.

Es wurde eine zweite Lösung (1 Liter) hergestellt, die 2 g Acetaldehyd und 0,1 M THAM (pH-Wert 8,7) enthielt, und es wurde ein Spektrum aufgenommen, um sicherzustellen, dass die Äbsorptionsbande für den freien Acetaldehyd nicht vorhanden war. Die Probe wurde wie oben beschrieben destilliert. Zu beiden Destillaten wurde Wasser hinzugefügt, um ein Volumen von

100 ml zu erhalten. Beide Destillatproben wurden dann wie oben beschrieben gaschromatographisch auf Acetaldehyd analysiert, und man erhielt einen Wert von 1900 mg/1 an Acetaldehyd bei der Kontrollprobe und 2000 mg/1 in der anderen Probe. Demzufolge ist die quantitative Gewinnung des Acetaldehyds aus dem alkalischen THAM-Komplex durch herkömmliche Destillation möglich.

Beispiel VIII

Es wurde eine Lösung hergestellt, die 2 g/l Acetaldehyd in 0,1 g THAM (pH-Wert 8,5) enthielt. Eine zweite Vergleichslösung wurde hergestellt, die nur 0,1 M THAM (pH-Wert 8,5) enthielt. Nach der Verdünnung beider Proben auf 1:50 wurde die Acetaldehyd/ alkalisches THAM-Probe mit Hilfe eines abgewandelten Verfahrens von Dickenson und Jacobsen (Chem. Commun. 1970, 1719) im Vergleich zu der Vergleichsprobe untersucht. Bei diesem Verfahren wurden 37 mg/1 Acetaldehyd in der verdünnten Probe gefunden (oder 1850 mg/1 vor der Verdünnung). Dieses Untersuchungsverfahren ist für die Aldehydgruppe hochspezifisch und wird in einem alkalischen Medium durchgeführt, in welchem der THAM/ Acetaldehyd-Komplex höchststabil ist. Die Tatsache, dass der Acetaldehyd in nahezu quantitativer Menge gefunden wurde, ist ein starker Hinweis dafür, dass zwischen dem THAM und dem Acetaldehyd keine Bindung ausgebildet wird.

Aus der obigen Beschreibung ergibt sich, dass die vorliegende Erfindung neue Massnahmen und Mittel zur Verfügung stellt für die enzymkatalysierte Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd. So werden bei der Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd durch Umsetzung des Äthanols in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase und ihres Cofaktors Nicotinamid-adenin-dinucleotid Massnahmen und Mittel zur Verfügung gestellt, um eine zweite Zone, die Äthanol oder ein Äthanol enthaltendes Substrat enthält, mit einer ersten Zone in Berührung zu bringen, die Alkoholdehydrogenase und Nicotinamid-adenin-dinucleotid enthält, wobei die Zonen durch eine semi-permeable Membrane getrennt sind, die

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geeignet ist, die Alkoholdehydrogenase in der ersten Zone zurückzuhalten, während sie eine freie Wanderung des Äthanols, des Cofaktors und der bei der Umsetzung erzeugten Produkte zwischen der ersten und der zweiten Zone gestattet. In weiteren Ausführungsformen werden Mittel und Massnahmen zur Behandlung lediglich der zweiten Zone zur Verfügung gestellt, um darin erhaltene Materialien zu regenerieren und/oder zu gewinnen, einschliesslich Belichtungs- und Oxidationsmittel und -massnahmen .

Im Hinblick auf die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, das heisst die Behandlung von Orangen-Essenz auf natürlichem Wege, um eine in situ-ErZeugung von darin enthaltenem Acetaldehyd aus Äthanol herbeizuführen, ergibt das enzymkatalysierte Reaktionsschema ein Flüchtigkeitsprofil des Essenzproduktes, das mit Ausnahme von Äthanol/Acetaldehyd im Vergleich zu dem Ausgangs- bzw. Quellenmaterial im wesentlichen unverändert geblieben ist. Diejenigen wenigen Einzelkomponenten der Essenz, bei denen Änderungen beobachtet werden, bewegen sich aber immer noch innerhalb der natürlich vorkommenden Bereiche für diese Bestandteile. In bestimmten frühen Experimenten wurde eine verringerte Konzentration an Äthylbutyrat in der Essenz als Folge des erfindungsgemässen Verfahrens beobachtet. Es wurde später jedoch festgestellt, dass diese unerwünschte Abnahme durch die Verwendung eines verunreinigten Katalaseenzyms (enthaltend Esteraseaktivität) und nicht durch ein inhärentes Merkmal oder eine inhärente Bedingung des Verfahrens per se verursacht wurde. '

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Leerseite

Claims

Patentansprüche

Verfahren für die enzymkatalysierte Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd, bei welchem Äthanol in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase und Nicotinamid-adenindinucleotid zu Acetaldehyd umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass man diese Umsetzung in Gegenwart von Tri-(hydroxymethyl)-methylamin unter solchen Bedingungen durchführt, bei denen der durch die Umsetzung gebildete Acetaldehyd mit dem Tri-(hydroxymethyl)-methylamin einen Anlagerungskomplex bildet, und den Acetaldehyd aus dem Anlagerungskomplex gewinnt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur im Bereich

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von etwa 18⁰C bis etwa 40⁰C und einem pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 9,0 durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Tri-(hydroxymethyl)-methylamin bei der Umsetzung in einer solchen Menge vorhanden ist, dass sich ein Molverhältnis von etwa 0,5:1 bis etwa 5,0:1, bezogen auf den bei der Umsetzung gebildeten Acetaldehyd, ergibt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20⁰C bis etwa 30⁰C und einem pH-Wert im Bereich von etwa 8,2 bis etwa 8,7 durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Tri-(hydroxymethyl)-methylamin bei der Reaktion in einer solchen Menge anwesend ist, dass sich ein Molverhältnis von etwa 1,5:1 bis etwa 2,5:1, bezogen auf den bei der Umsetzung gebildeten Acetaldehyd, ergibt.

¹V_-,. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass der Acetaldehyd aus dem Anlagerungskomplex gewonnen wird, indem man den pH-Wert desselben in einen Bereich von etwa 6,0 bis etwa 6,8 absenkt und den Acetaldehyd im Vakuum abzieht. ' ·

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Äthanol in Form eines aus einem Fruchtprodukt erhaltenen wässrigen Destillats eingesetzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Äthanol in Form einer Orangen-Essenz eingesetzt wird.

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9. Verfahren zur Herstellung von stabilen Anlagerungskomplexen von Acetaldehyd in Lösung, wobei der Acetaldehyd keiner chemischen Umwandlung unterliegt und aus den Komplexen im wesentlichen quantitativ wiedergewonnen werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass man den Acetaldehyd mit Tri-(hydroxymethyl)-methylamin bei einer Temperatur von bis zu etwa 35°C, einem pH-Wert von etwa 7,0 bis etwa 9,0 und einem Molverhältnis von Tri-(hydroxy)-methylamin zu Acetaldehyd von wenigstens 0,5:1 zusammenbringt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur im Bereich von etwa 15°C bis etwa 35°C, der pH-Wert im Bereich von etwa 8,2 bis etwa 8,7 und das Molverhältnis im Bereich von etwa 1,5:1 bis etwa 2,5:1 liegt.

11. Stabile Acetaldehydlösung, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 9.

12. Verfahren zur enzymkatalysierten Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd in flüssiger Phase, dadurch gekennzeichnet, dass man

(■a). Äthanol in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase, Nicotinamid-adenin-dinucleotid und Tri-(hydroxymethyl ) -methylamin umsetzt unter Bildung der Reaktionsprodukte Acetaldehyd "in Form eines Anlagerungskomplexes mit Tri-(hydroxymethyl)-methylamin und reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid; und

(b) das reduzierte Nicotinamid-adenin-dinucleotid oxidiert, um zusätzliches Nicotinamid-adenindinucleotid für die Umsetzung mit Äthanol zur Verfügung zu stellen.

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13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidation in Stufe (b) die Umsetzung des reduzierten Nicotinamid-radenin-dinucleotids mit einem wasserlöslichen Oxidationsmittel umfasst, welches seinerseits bei dieser Umsetzung reduziert wird, wobei das Verfahren zusätzlich den Schritt umfasst, dass man

(c) das reduzierte Oxidationsmittel oxidiert, um zusätzliche Mengen an Oxidationsmittel für die Oxidation des reduzierten Nicotinamid-adenin-dinucleotids zur Verfügung zu stellen.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das in Stufe (b) eingesetzte Oxidationsmittel Flavinmononucleotid umfasst und die Oxidation in Stufe (b) in Gegenwart von Licht durchgeführt wird, und die Oxidation in Stufe (c) die Umsetzung des reduzierten Flavinmononucleotids mit Sauerstoff umfasst.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,dass die Umsetzung des reduzierten Plavinmononucleotids mit Sauerstoff .zur Bildung von Wasserstoffperoxid führt und das Wasserstoffperoxid anschliessend enzymatisch zu Wasser und Sauerstoff umgewandelt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Umwandlung des Wasserstoffperoxids die Umsetzung von Wasserstoffperoxid"in Gegenwart von Katalase umfasst.

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,dass die Umsetzung in Stufe (a) bei einer Temperatur im Bereich von etwa 18⁰C bis etwa 40⁰C und einem pH-Wert im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 9,0 durchgeführt wird und das Tri-(hydroxymethyl)-methylamin in einer Menge

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vorliegt, die ausreicht, um ein Molverhältnis von wenigstens etwa 0,5:1, bezogen auf den bei der Umsetzung gebildeten Acetaldehyd, zu ergeben.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur im Bereich von etwa 2O⁰C bis etwa 30⁰G, der pH-Wert im Bereich von etwa 8,2 bis etwa 8,5 und das Molverhältnis im Bereich von etwa 1,5:1 bis etwa 2,5:1 liegen.

19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in Stufe (a) in Gegenwart von Zinkchlorid durchgeführt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Äthanol in Form eines aus einem Fruchtprodukt erhaltenen wässrigen Destillats eingesetzt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Äthanol in Form von Orangen-Essenz eingesetzt wird.

22. Verfahren zur enzymkatalysierten Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd in flüssiger Phase, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) eine erste Zone schafft, die Äthanol, Alkoholdehydrogenase, Nicotinamid-adenin-dinucleotid und Tr i-(hydroxymethyl)-methylamin enthält;

(b) eine zweite Zone schafft, die Äthanol, Nicotinamidadenin-dinucleotid und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin enthält, wobei Alkoholdehydrogenase in dieser zweiten Zone nicht anwesend ist;

und wobei die erste und die zweite Zone durch eine semipermeable Membrane mit solchen Abmessungen getrennt ist,

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dass die Alkoholdehydrogenase in der ersten Zone zurückgehalten und allen anderen Ausgangsmaterialien und aus diesen erhaltenen Reaktionsprodukten eine freie Wanderung zwischen der ersten und der zweiten Zone gestattet wird;

(c) die Umsetzung des Äthanols zu Aldehyd in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase, Nicotinamid-adenindinucleotid und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin in der ersten Zone durchführt; und

(d) aus der zweiten Zone den Anlagerungskomplex aus Acetaldehyd und Tri- (hydroxymethy 1)-triethylamin gewinnt, der sich bei der Umsetzung in der ersten Zone gebildet hat und durch die semi-permeable Membrane in die zweite Zone gewandert ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und die zweite Zone jeweils weiterhin ein Oxidationsmittel zum Oxidieren des reduzierten Nicotinamid-adenin-dinucleotids enthalten, das sich aufgrund der Reaktion des Äthanols gebildet hat, um das Nicotinamid-adenin-dinucleotid für die weitere Unterhaltung der Reaktion des Äthanols zu regenerieren.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Oxidationsmittel Flavinmononucleotid umfasst und dass die Oxidation des reduzierten Nicotinamid-adenin-dinucleotids mit demselben dadurch ausgeführt wird, dass man nur die Bestandteile der zweiten Zone* einer Beleuchtung aussetzt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestandteile der zweiten Zone solchen Bedingungen unterworfen werden, bei denen das reduzierte Flavinmononucleotid, das sich durch die Oxidation des reduzierten Nicotinamid-adenin-dinucleotids gebildet hat, oxidiert wird, um das Flavinmononucleotid zu regenerieren.

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26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass diese Bedingungen zur Oxidation des reduzierten Flavinmononucleotids die Zuführung von Sauerstoff nur zu den Bestandteilen der zweiten Zone umfassen.

27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasserstoffperoxid, das sich bei der Oxidation des reduzierten Flavinmononucleotids gebildet hat, zu Wasser und Sauerstoff umgewandelt wird.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung des Wasserstoffperoxids die Zersetzung des Wasserstoffperoxids in Gegenwart von Katalase in der zweiten Zone umfasst.

29. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Äthanol in Form eines aus einem Fruchtprodukt erhaltenen wässrigen Destillats eingesetzt wird.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Äthanol in Form von Orangen-Essenz eingesetzt wird.

31. Verfahren zur kontinuierlichen enzymkatalysierten Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd in flüssiger Phase, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) einen ersten, kontinuierlich fliessenden, rezirkulierenden Strom schafft aus Äthärfol, Alkoholdehydrogenase, Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Flavinmononucleotid und Tri-(hydroxvmethyl)-methylamin;

(b) einen zweiten, kontinuierlich fliessenden Strom schafft aus Äthanol, Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Flavinmononucleotid und Tri-(hydroxymethyl)-methylamin, wobei dieser zweite Strom keine Alkoholodehydrogenase enthält, und wobei der erste und der zweite

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Strom durch eine semi-permeable Membrane von solchen Abmessungen getrennt sind, dass die Alkoholdehydrogenase in der ersten Zone zurückgehalten wird, während eine freie Wanderung aller anderen in dem ersten und in dem zweiten Strom enthaltenen Materialien, einschliesslich der aus ihnen erhaltenen Reaktionsprodukte, zwischen dem ersten und dem zweiten Strom möglich ist;

(c) die Ströme kontinuierlich auf solche Weise fliessen lässt, dass alle in ihnen enthaltenen Materialien

auf dem Wege der Durchdringung der semi-perraeablen

Membrane unter solchen Bedingungen miteinander in

Berührung gebracht werden, bei denen Äthanol zu Acetaldehyd umgewandelt wird und das Acetaldehyd mit dem Tri- (hydroxymethyl) -Diethylamin einen Anlagerungskomplex bildet;

(d) anschliessend den kontinuierlich fliessenden zweiten Strom einer Beleuchtung unterwirft, um darin enthaltenes reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid in Nicotinamid-adenin-dinucleotid umzuwandeln;

(e) anschliessend Sauerstoff zu dem kontinuierlich fliessenden zweiten Strom unter solchen Bedingungen hinzufügt, bei denen bei der Umwandlung in Stufe (d)

,^ reduziertes Flavxnmononucleotid regeneriert wird;

(f) anschliessend den kontinuierlich fliessenden zweiten Strom solchen Bedingungen unterwirft, bei denen Wasserstoffperoxid, das bei der Regenerierung in Stufe (e) gebildet wird, zu Sauerstoff und Wasser umgewandelt wird;

(g) anschliessend den zweiten Strom rezirkuliert, um ihn durch die semi-permeable Membrane hindurch mit dem ersten Strom in Berührung zu bringen, um eine weitere Umsetzung des Äthanols zu Acetaldehyd herbeizuführen, wobei der Anlagerungskomplex aus Acetaldehyd .und Tri-(hydroxymethyl)-methylairiin wenigstens periodisch

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aus dem zweiten Strom entfernt wird;

und die Materialien des ersten und des zweiten Stromes wenigstens periodisch mit den erforderlichen Mengen ergänzt werden, um die gewünschten Umsetzungen herbeizuführen und ausreichende Konzentrationsgradienten zu erzeugen, um die Durchdringung der Materialien zu und von den jeweiligen Strömen durch die semi-permeable Membrane hindurch zu verursachen.

32. Verfahren zur Umwandlung von Äthanol in Acetaldehyd in Gegenwart von Alkoholdehydrogenase und einem dafür geeigneten Cofaktor, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umwandlung in einer ersten Reaktionszone durchführt, in welcher Äthanol in Kontakt mit der Alkoholdehydrogenase und ihrem Cofaktor steht, und man eine zweite Zone vorsieht, die von der ersten Reaktionszone durch eine semi-permeable Membrane von solchen Abmessungen getrennt ist, dass die Alkoholdehydrogenase, jedoch nicht ihr Cofaktor, daran gehindert wird, in die zweite Zone zu gelangen, um die bei der Umsetzung erzeugten Produkte aufzunehmen.

33. Vorrichtung für die enzymkatalysierte Umwandlung von Äthanol zu Acetaldehyd, umfassend

(a) Mittel, die eine erste Reaktionszone bilden, um Äthanol, Alkoholdehydrogenase und einen Cofaktor für diese miteinander in Berührung zu bringen;

(b) Mittel, die eine zweite Zone bilden, um die bei der Umsetzung erzeugten Produkte zu sammeln;

(c) eine semi-permeable Membrane, um die erste Zone von der zweiten Zone zu trennen und die Alkoholdehydrogenase, jedoch nicht deren Cofaktor, daran zu hindern, in die zweite Zone zu gelangen; und

(d) Mittel zur Gewinnung des Acetaldehyds aus der zweiten Zone.

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