DE3784677T2

DE3784677T2 - Verfahren zur herstellung von l-sorbose und vorrichtung zur kultivierung von mikroorganismen.

Info

Publication number: DE3784677T2
Application number: DE8787311123T
Authority: DE
Inventors: Kazuhiko Kintaka; Katsumitsu Kishimoto; Hiroyuki Yoshinaga
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1986-12-25
Filing date: 1987-12-17
Publication date: 1993-06-17
Anticipated expiration: 2007-12-18
Also published as: IE873473L; ATE163969T1; EP0273648A2; CN1029322C; ES2039464T3; DK679087D0; DE3752177T2; EP0273648B1; DE3784677D1; US6284499B1; DE3752177D1; EP0273648A3; ATE86666T1; CN87108309A; DK173550B1; DK679087A; EP0477997B1; EP0477997A1; IE59996B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose unter Verwendung von Mikroorganismen und eine für solch ein Verfahren geeignete Apparatur zum Kultivieren von Mikroorganismen.

Hintergrund der Erfindung

L-Sorbose ist eine der natürlich vorkommenden Ketohexosen, die in Säften der Eberesche etc. enthalten ist und die eine wichtige Verbindung als Rohmaterial in der Vitamin-C-Synthese ist. L-Sorbose wird durch Fermentation hergestellt, wobei D-Sorbit durch Mikroorganismen, z. B. Bakterien der Gattung Gluconobacter, oxidiert wird.
In einer konventionellen Fermentationsproduktion von L-Sorbose beträgt die Ausbeute der Umwandlung des Rohmaterials, D-Sorbit, in L-Sorbose höchstens ungefähr 93 %, wobei beträchtliche Mengen an Nebenprodukten, wie z. B. 5-Ketofructose, D-Fructose, 2-Ketogluconsäure etc., gebildet werden. Um die Rohmaterialkosten von Vitamin C zu reduzieren, ist es erwünscht, die Ausbeute der Umwandlung von D-Sorbit in L-Sorbose auf mehr als in einem konventionellen Prozeß zu erhöhen und die Bildung der vorstehenden Nebenprodukte auf so wenig wie möglich zu hemmen.
In unserer Europäischen Patentanmeldung Nr. 233 050 (A2) ist offenbart, daß L-Sorbose in größerer Ausbeute aus D-Sorbit durch mikrobiologische Oxidation unter Verwendung eines Mikroorganismus, der der Gattung Gluconobacter angehört und der im Vergleich mit seinen Elternstämmen in der Fähigkeit verringert ist, mit D-Sorbit als die alleinige Kohlenstoffquelle zu wachsen, produziert werden kann.
Nebenbei werden sie, wenn die Konzentration von D-Sorbit in einem Kulturmedium ungefähr 5 % während und nach der Wachstumsphase der Mikroorganismen überschreitet, aufgrund der beiden hohen Konzentrationen des Substrates (D-Sorbit) und des Produktes (L-Sorbose) gehemmt, was die Verzögerung der Oxidationsgeschwindigkeit zur Folge hat. Demgemäß ist es notwendig, die Konzentration von D-Sorbit unter ungefähr 5 % zu halten. Wenn jedoch die Konzentration des Substrates Einfluß hat auf den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt, liegt ein Problem darin, daß die Bildung von Nebenprodukten (Fructose, 2-Ketogluconsäure, etc.) erhöht ist.
Zusätzlich wird in diesem Typ von Produktionsverfahren manchmal ein Kultur-Abgas, das Sauerstoff in einer hohen Konzentration enthält, durch einen Kompressor zurückgewonnen und im Kreislauf geführt und in einer Kulturflüssigkeit zum Sparen von Ressourcen wiederverwendet. In diesem Fall sammelt sich das durch die Atmung der Mikroorganismen gebildete Kohlendioxid-Gas in dem Abgas an und hemmt, wenn die Konzentration des Kohlendioxid- Gases auf über 10 % ansteigt, die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen und die Oxidationsgeschwindigkeit beträchtlich. Demgemäß werden in einem konventionellen Verfahren Kohlendioxid- Gas entfernende Mittel unter Verwendung eines Adsorbens, wie z.B. Natriumhydroxid, Aktivkohle etc., benutzt. Wenn jedoch solche Mittel verwendet werden, treten dabei viele Probleme auf, wie ein Ansteigen der Produktionskosten wegen der Notwendigkeit einer Adsorbtionskolonne, eines Adsorbens etc. und darüberhinaus die Notwendigkeit deren Wartung.
Das Japanische Patent Kokoku Nr. 61-5709 offenbart ein Verfahren und eine Apparatur zum Kultivieren von Mikroorganismen, wie z.B. Fungi. In dieser Veröffentlichung wird ein mit Sauerstoff angereichertes Gas aus Luft durch Adsorbieren des darin enthaltenen Stickstoffes hergestellt und sowohl zum Steuern des Partialdruckes des Kohlendioxid-Gases in einem Kulturbehälter als auch zum Steuern der Konzentration des gelösten Sauerstoffes in einer Kulturflüssigkeit verwendet.

Aufgaben der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die Umwandlungsgeschwindigkeit von D-Sorbit in L-Sorbose bei der Herstellung von L-Sorbose durch mikrobiologische Oxidation zu verbessern.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Ausbeute an L-Sorbose pro Ansatz durch richtige Kontrolle der Konzentration an D-Sorbit während und nach der Wachstumsphase zu erhöhen, um eine hohe Konzentration an D-Sorbit in L-Sorbose in einer kurzen Zeitspanne zu oxidieren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, Vorrichtungen und deren Wartung bei der Herstellung von L-Sorbose zu vereinfachen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die Produktionskosten von L-Sorbose durch Entfernung des Kohlendioxid-Gases in einem Kultur-Abgas zu verringern, um es ohne Verwendung eines Adsorbens zur Kontrolle des geeigneten Kohlendioxid-Gas-Partialdruckes wiederzuverwenden.
Sowohl diese Aufgaben als auch andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden Beschreibung in Zusammenhang mit den begleitenden Abbildungen ersichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Abbildung

Fig. 1 ist ein Diagramm, welches die Beziehung zwischen einer Ahfangs-Beladungs-Konzentration des D-Sorbits und einer spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit veranschaulicht;
Fig. 2 ist ein Diagramm, welches die Beziehung zwischen einer Konzentration des D-Sorbits und einer Produktionsgeschwindigkeit der L-Sorbose veranschaulicht;
Fig. 3 ist ein Diagramm, welches die Beziehung zwischen einem Kohlendioxid-Gas-Partialdruck und einer spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit veranschaulicht;
Fig. 4 ist ein Diagramm, welches die Beziehung zwischen einem Kohlendioxid-Gas, Partialdruck und einer Produktionsgeschwindigkeit der L-Sorbose veranschaulicht; und
Fig. 5 ist eine Übersichtsdarstellung eines bevorzugten Beispiels einer Kultivier-Apparatur der vorliegenden Erfindung.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose durch mikrobiologische Oxidation von D- Sorbit zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte des Hinzufügens von D-Sorbit zu einer Kulturflüssigkeit in einer solchen Konzentration, daß sie während und nach der Wachstumsphase des eingesetzten Mikroorganismus etwa 5 % in dem Kulturmedium nicht überschreitet,
während der Umlaufführung eines Kultur-Abgases, das mit Sauerstoff-Gas angereichert ist, um die Konzentration des gelösten Sauerstoffes zu steuern und des Abführens eines Teils des Abgases aus dem System heraus, um den Partialdruck des Kohlenstoffdioxid-Gases in dem Umlauf-Gas zu steuern.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Apparatur zum Kultivieren von Mikroorganismen mit L-Sorbose produzierenden Fähigkeiten zur Verfügung, umfassend
einen Kulturbehälter, der mit einem Rührer, einem im unteren Teil des Behälters angebrachten Gas-Einlaß und einem im oberen Teil des Behälters angebrachten Abgas-Auslaß ausgerüstet ist, zum Kultivieren des Mikroorganismus;
eine Substrat-Einspeisungsvorrichtung zum Einbringen eines Kultur-Substrats in den Kulturbehälter;
eine Sauerstoff-Einleitungsvorrichtung mit einem Vorratsbehälter für flüssigen Sauerstoff und einem Verdampfer zum Zuführen eines Kultur-Abgases, das mit Sauerstoff-Gas angereichert ist, in den Kulturbehälter;
einen Detektor für die Konzentration von gelöstem Sauerstoff zum Nachweis des gelösten Sauerstoffs in der Kulturflüssigkeit in dem Kulturbehälter, wobei ein Signal der Konzentration des gelösten Sauerstoffs ausgegeben wird;
ein Steuergerät für den gelösten Sauerstoff zum Steuern der Zufuhr von gelöstem Sauerstoff aufgrund des Nachweises des Signals der Konzentration des gelösten Sauerstoffs;
eine Meßvorrichtung für Kohlendioxid-Gas zur Messung des Partialdrucks des Kohlenstoffdioxid-Gases in einem Kultur-Abgas, das einer Abgasleitung aus dem Kulturbehälter zugeführt wird;
eine Abgas-Abführungsvorrichtung zum Abführen eines Teils des Kultur-Abgases aus dem System heraus aufgrund des Nachweises des Partialdrucks des Kohlenstoffdioxid-Gases;
eine Rohrleitung zur Umlaufführung des Restes des Kultur-Abgases in den Gas-Einlaß des Kulturbehälters; und
eine Luft-Einleitungsvorrichtung zum Zuführen von Luft in den Kulturbehälter.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Ausbeute an L-Sorbose, im Vergleich zu einem konventionellen Verfahren, erhöht werden. Das heißt, in einem konventionellen Verfahren ist die Ausbeute an L-Sorbose, basierend auf D-Sorbit, nicht mehr als etwa 93 %, während in der vorliegenden Erfindung die Ausbeute auf 2 % bis 3 % mehr als die des konventionellen Verfahrens erhöht werden kann.
Zusätzlich kann die Entstehung von Nebenprodukten wie D-Fructose, 2-Ketogluconsäure, 5-Ketofructose und ähnlichen, minimiert werden. Zusätzlich kann gemäß der vorliegenden Erfindung eine hohe Konzentration an D-Sorbit zu L-Sorbose innerhalb einer kurzen Zeitspanne oxidiert werden und die Ausbeute pro Ansatz erhöht werden, weil die Konzentration an D-Sorbit in einem Kulturmedium während und nach der Wachstumsphase gesteuert wird, so daß sie nicht 5 % überschreitet.
Außerdem wird in der Kultivierungsapparatur der vorliegenden Erfindung das Abgas zum Sparen von Ressourcen wiederverwendet, um seine ökonomischen Vorteile zu steigern. Ferner kann die Apparatur der vorliegenden Erfindung vereinfacht werden und ist vorteilhaft im Hinblick auf ihre Wartung, weil das Kohlendioxid- Gas in dem Abgas verdünnt wird und ein Teil des Abgases aus dem System abgelassen wird, anstelle der Verwendung eines Adsorbens wie in einer konventionellen Apparatur.
Aufgrund der verschiedenen vorstehenden Vorteile kann L-Sorbose, deren Kosten einen sehr großen Anteil der Rohmaterialkosten der Vitamin-C-Produktion in Anspruch nimmt, im Vergleich zu einem konventionellen Verfahren preiswert bereitgestellt werden und die Produktionskosten von Vitamin C, welches weitreichenden Nutzen in Medizin, Nahrungsmittel und ähnlichem besitzt, können daher verringert werden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose durch mikrobiologische Oxidation von D-Sorbit zur Verfügung, umfassend die Schritte
(1) des Hinzufügens von D-Sorbit zu einer Kulturflüssigkeit in einer solchen Konzentration, daß sie beim Kultivieren während und nach der Wachstumsphase des verwendeten Mikroorganismus etwa 5 % nicht überschreitet, während
(2) der Umlaufführung und Belüftung eines Kultur-Abgases, das mit Sauerstoff-Gas angereichert ist, um den Partialdruck des Sauerstoffes in der Kulturflüssigkeit zu erhöhen und um die Konzentration des gelösten Sauerstoffes zu steuern und
(3) des Abführens eines Teils des genannten Abgases aus dem System heraus, um den Partialdruck des Kohlendioxidgases in dem Umlaufgas zu steuern.
In dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann jeder Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, D-Sorbit in L- Sorbose zu oxidieren, verwendet werden. Beispiele für die Mikroorganismen beinhalten Bakterien der Gattung Gluconobacter, z. B. von Gluconobacter suboxidans oder Gluconobacter oxidans herrührende Stämme. Bestimmte Beispiele der Stämme sind z. B. Gluconobacter suboxidans IFO 3254, IFO 3257, IFO 12528, IFO 3255, IFO 3256, IFO 3258 oder IFO 3291 und weiterhin Gluconobacter oxidans IFO 3189. Diese Stämme sind aerobe und gram-negative Stäbchenbakterien, die selbständiges Bewegungsvermögen besitzen, bei saurem pH wachsen und Essigsäure aus Ethanol erzeugen und sind bekannte Stämme, die in der "List of Cultures, 1984, Seventh Edition", veröffentlicht durch das Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan, aufgeführt sind.
Zusätzlich können in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung Gluconobacter suboxidans BL-9 (IFO 14489, FERM BP-1241) und Gluconobacter suboxidans BL-115 (IFO 14490, FERN BP-1240), die in unserer vorstehend genannten Europäischen Patentanmeldung Nr. 233 050 (A2) offenbart sind, verwendet werden. Diese IFO- und FERN-Nummern bezeichnen Zugriffsnummern an dem Institute for Fermentation, Osaka (IFO) 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka, Japan und an dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRl), 1-3, Yatabemachi-higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan. Beide Stämme wurden am IFO am 21. Januar 1986 und am FRl am 1. Februar 1986 (umgewandelt zu Hinterlegungen unter dem Budapester Abkommen vom 22. Dezember 1986) hinterlegt.
Der hierin verwendete Begriff "Wachstumsphase" der vorstehend genannten Mikroorganismen bedeutet die Lag-Phase und eine Kultivierungsperiode bis zum Ende der logarithmischen Wachstumsphase beim Kultivieren der verwendeten Mikroorganismen. Die Wachstumsphase ist veränderlich entsprechend der jeweiligen Art des verwendeten Mikroorganismus, den Kultivierungsbedingungen und ähnlichem, kann aber ohne weiteres durch Aufstellen einer Wachstumskurve gemäß einem konventionellen Verfahren bestimmt werden. Im allgemeinen stimmt die Wachstumsphase mit der Kultivierungsperiode überein, die zum Verbrauch einer Stickstoffquelle in einem Kulturmedium benötigt wird und entspricht in vielen Fällen z. B. ungefähr 9 Stunden nach Starten des Kultivierens.
In der vorliegenden Erfindung wird eine Anfangs-Beladung des D- Sorbits auf 8 % - 25 % optimiert, um die Wachstumsgeschwindigkeit zu erhöhen, und das verbliebene D-Sorbit wird, wie vorstehend unter (1) beschrieben, kontinuierlich oder diskontinuierlich in solch einer Konzentration hinzugefügt, daß sie nicht auf über ungefähr 5 % während und nach der Wachstumsphase des verwendeten Mikroorganismus ansteigt, um eine Konzentration der End-Beladung von 40 % - 60 % zu erreichen.
Die Konzentration der Anfangs-Beladung des D-Sorbits beträgt vorzugsweise 8 % - 25 %. Das heißt, die beiliegenden Fig. 1 und 2 zeigen den Effekt der Konzentration der Anfangs-Beladung des D-Sorbits auf eine spezifische Wachstumsgeschwindigkeit und den Effekt der Konzentration des D-Sorbits auf eine spezifische Produktionsgeschwindigkeit von L-Sorbose. Wie in Fig. 1 und 2 gezeigt, ist die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit und die spezifische Produktionsgeschwindigkeit von L-Sorbose erhöht, wenn die Konzentration des D-Sorbits 8 % - 25 %, besonders 8 % - 20 %, beträgt.
Während und nach der Wachstumsphase wird die Konzentration der Beladung des D-Sorbits, wie vorstehend beschrieben, unter ungefähr 5 % gehalten, so daß die Oxidation des D-Sorbits in L-Sorbose wirksam fortschreitet. Im Gegensatz hierzu wird, wenn die Konzentration der Beladung des D-Sorbits auf über 5 % ansteigt, die Umwandlung in L-Sorbose verzögert und die Kultivierungszeit verlängert, weil die Mikroorganismen dazu neigen, durch das Substrat gehemmt zu werden.
In einem konventionellen Verfahren wird die Kultivierung unter Zufügen von allem D-Sorbitol auf einmal am Anfang der Kultivierung durchgeführt. Deshalb werden die Mikroorganismen durch das Substrat stark gehemmt, und eine lange Kultivierungszeit wird benötigt. Wenn jedoch das Zufügen des D-Sorbits wie in der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, wird die Kultivierungszeit verkürzt. In dieser Hinsicht wurde das Verfahren der vorliegenden Erfindung mit einem konventionellen Verfahren (einmalige Beladung) verglichen. Die Resultate sind Tabelle 1 zu entnehmen. Tabelle 1 Konzentration des D-Sorbits max. spez. Wachst.-geschwindigkeit max. Oxidationsgeschwindigkeit Zeitbed. z. Fermentation (h) 30 % (einm. Beladung) 50 % (vorl. Erfindung)
Wie der Tabelle 1 entnommen werden kann, benötigt die Kultivierung, falls eine 50 % Lösung des D-Sorbits geladen wird, 47 Stunden in dem konventionellen Verfahren, wohingegen sie nur 20 Stunden in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung benötigt.
Die Konzentration des D-Sorbits in dem vorstehenden Kulturmedium wird durch Berechnung einer theoretischen Menge an Sauerstoff, die zur Oxidation von D-Sorbit in L-Sorbose benötigt wird, gesteuert. Das bedeutet, daß die Menge des D-Sorbits nicht direkt bestimmt wird, und daß eine vorgeschriebene Menge (8 - 25 %) des D-Sorbits in das Medium geladen wird und das Kultivieren durch Versorgen der Kultur mit einer theoretischen Menge an Sauerstoff durchgeführt wird, so daß diese Menge 5 % oder weniger wird. Das Kultivieren wird dann, um der Zuführung von Sauerstoff zu begegnen, durch Regulieren der Zugabe von D-Sorbit fortgesetzt, so daß dessen Konzentration nicht auf über 5 % ansteigt.
In der vorliegenden Erfindung kann der Sauerstoff-Bedarf der Mikroorganismen in dem frühen Stadium des Kultivierens nur durch Sauerstoff aus der Luft erfüllt werden. Wenn jedoch, wie vorstehend unter (2) beschrieben, die Mikroorganismus-Konzentration und der Sauerstoff-Bedarf der Mikroorganismen während und nach der Wachstumsphase zunimmt, wird ein Kultur-Abgas, das, um den Sauerstoff-Partialdruck zu erhöhen, mit Sauerstoff-Gas, wie z. B. aus flüssigem Sauerstoff herrührend, angereichert ist (z. B. mit Sauerstoff angereichtertem Gas, in dem der Sauerstoffpartialdruck auf 21 % oder höher, vorzugsweise 21 % bis 50 %, gesteigert ist), in eine Kulturflüssigkeit hinein in Umlauf gesetzt, um den Mangel an Sauerstoff auszugleichen und die Konzentration des in dem Kulturmedium gelösten Sauerstoffs auf 0,7 ppm oder höher, vorzugsweise 1 bis 4 ppm, zu steuern.
Die Zufuhr des vorstehend genannten Sauerstoffs wird stöchiometrisch, ausgehend von dem vorstehend genannten D-Sorbit, bestimmt. Beim Kultivieren der vorliegenden Erfindung wird die Produktion der L-Sorbose, sogar wenn ein Überschuß an gelöstem Sauerstoff, der in der Reaktion nicht verwertet wird, in dem Kulturmedium vorhanden ist, in der Hauptsache nicht beeinträchtigt. Gleichwohl ist es wirtschaftlich, einen Kulturbehälter mit Sauerstoff in einer angemessenen Menge zu versorgen und, in der Praxis unter Berücksichtigung, daß Ungleichmäßigkeiten der Konzentration des in einem Kulturbehälter gelösten Sauerstoffs vorhanden sein können, die Konzentration des gelösten Sauerstoffs, wie vorstehend beschrieben, auf 0,7 ppm oder höher, vorzugsweise auf 1 bis 4 ppm, zu steuern.
In der vorliegenden Erfindung werden beim Kultivieren durch Umlaufführung eines Kultur-Abgases, welches wie vorstehend beschrieben einen erhöhten Sauerstoff-Partialdruck besitzt, während und nach der Wachstumsphase des Mikroorganismus in eine Kulturflüssigkeit hinein, Einsparungen gemacht. Es ist jedoch bekannt, daß, wenn ein Abgas durch Umlaufführung wiederverwendet wird, durch Atmung der Mikroorganismen entstandenes Kohlendioxid-Gas angereichert wird und Wachstum und Oxidationsaktivität der Mikroorganismen gehemmt werden. Das heißt, die begleitenden Figuren 3 und 4 zeigen den Effekt des Kohlendioxid- Gas-Partialdruckes auf die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit und die Produktionsgeschwindigkeit von L-Sorbose. Wie in Figuren 3 und 4 gezeigt, ist die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit stark gehemmt, wenn die Konzentration des Kohlendioxid-Gases 5 % übersteigt. Andererseits wird, wenn die Konzentration an Kohlendioxid-Gas 5 % überschreitet, die Produktionsgeschwindigkeit (Oxidationsgeschwindigkeit) der L-Sorbose ein wenig gehemmt, obgleich sie im Vergleich mit der spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit nicht so stark gehemmt wird und wird stark gehemmt, wenn die Konzentration des Kohlendioxid-Gases 10 % überschreitet. Deshalb wird in der vorliegenden Erfindung ein Teil des umlaufenden Abgases (5 % bis 10 %) in die Atmosphäre abgelassen, und Sauerstoff wird in einer solchen Menge zugefügt, daß es die abgelassene Menge des Sauerstoffs zuzüglich des durch die Mikroorganismen verbrauchten Sauerstoffs deckt, um die Konzentration des Kohlendioxid-Gases zu verdünnen. Dabei wird der Partialdruck des Kohlendioxid-Gases in dem umlaufenden Gas auf 10 % oder weniger, was die Produktionsgeschwindigkeit nicht negativ beeinträchtigt, geregelt. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird, wie vorstehend beschrieben, ein Adsorbens, welches in konventionellen Verfahren verwendet wird, nicht benötigt. Dies ist vorteilhaft aus den Gesichtspunkten der Wartung und Wirtschaftlichkeit. Zusätzlich kann, sogar wenn dieses Ablassen in die Atmosphäre angewendet wird, 60 % der zu verwendenden Menge an Sauerstoff durch Wiederverwendung des Abgases, welches den erhöhten Sauerstoff-Partialdruck besitzt, vermindert werden, was einen großen wirtschaftlichen Vorteil zur Folge hat.
Darüber hinaus wird in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Kulturmedium mit bestimmten Komponenten, wie z. B. ein synthetisches Medium oder ein halbsynthetisches Medium, als Produktionsmedium verwendet. Dabei wird das Medium stabilisiert, und die Rohmaterialkosten werden verringert. Das heißt, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird als Kohlenstoffquelle D-Sorbit als das Hauptrohmaterial verwendet und zusätzlich können D-Glucose, D-Fructose, D-Manit, Etanol, Zuckersirup, Stärke, Stärke-Hydrolysate und dergleichen hinzugefügt werden. Und als Stickstoffquellen können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie z. B. Aminosäuren, Harnstoff und dergleichen, zusätzlich zu anorganischen stickstoffhaltigen Verbindung, wie z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, wäßrige Ammoniumchloridlösung, Ammoniumphosphat, wäßrige Ammoniumlösung, Ammoniak-Gas und dergleichen, verwendet werden. Darüber hinaus können zusätzlich zu den vorstehenden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verschiedene Metalle, Vitamine, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Chinone und dergleichen, die notwendig sind für das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen, zu dem Kulturmedium hinzugefügt werden.
Insbesondere sind in der vorliegenden Erfindung 0,04 bis 0,07 % von einer oder mehreren glycogenen Aminosäuren als eine Komponente zu dem Kulturmedium hinzugefügt worden, um die Oxidationsaktivität der Mikroorganismen zu erhöhen. Das Verhältnis zwischen einer lebensfähigen Zell-Zahl und einer Oxidationsgeschwindigkeit in dem Fall, daß verschiedene Aminosäuren zu dem Medium hinzugefügt worden sind, sowie die für die Vollendung der Fermentation benötigte Zeit im Falle, daß die Kultivierung unter Zufügung dieser Aminosäuren und Beladen einer 50 %-Lösung des D-Sorbits durchgeführt wird, sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Zahl d.lebensfähigen Zellen (x 10&sup8;/ml) Oxidationsgeschwindigkeit Zur Fermentation einer 50%-Lösung ben.Zeit Glycin Serin Threonin Alanin Valin Leucin Isoleucin Cystin Methionin Tryptophan Phenylalanin Tyrosin Prolin Asparaginsäure Glutaminsäure Lysin Histidin Arginin Asparagin Glutamin Ammoniumacetat Keine Zugabe Bemerkung: Alle Aminosäuren sind L-Formen.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, kann die Zahl der lebensfähigen Zellen durch Zufügen von glycogenen Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Glutamin, Alanin, Serin, Threonin, Asparagin, Asparaginsäure und dergleichen, erhöht werden, ohne daß die Oxidationsgeschwindigkeit durch die Zahl der lebensfähigen Zellen erniedrigt wird. Zusätzlich ist zu erkennen, daß, wenn das Kultivieren einer 50 %-Lösung unter Hinzufügung dieser Aminosäuren durchgeführt wird, die zur Beendigung der Fermentation benötigte Zeit verkürzt werden kann.
In der vorliegenden Erfindung sind andere als die vorstehend beschriebenen Kultivier-Bedingungen nicht besonders eingeschränkt. Das heißt, die Kultivier-Temperatur beträgt gewöhnlich 15º C bis 45º C, vorzugsweise 25º C bis 40º C. Der pH des Kulturmediums beträgt gewöhnlich 3,0 bis 8,0, vorzugsweise 3,5 bis 6,5. Die Kultivier-Zeit beträgt gewöhnlich 10 bis 100 Stunden, vorzugsweise 15 bis 40 Stunden.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung eine Apparatur zum Kultivieren von Mikroorganismen bereit, die zur Ausführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von L-Sorbose geeignet ist.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt eine Apparatur zum Kultivieren eines Mikroorganismus bereit, die die folgenden Komponenten umfaßt:
Einen Kulturbehälter, der mit einem Rührer, einem im unteren Teil des Behälters angebrachten Gas-Einlaß und einem im oberen Teil des Behälters angebrachten Abgas-Auslaß ausgerüstet ist, zum Kultivieren des Mikroorganismus;
eine Substrat-Einspeisungsvorrichtung zum Einbringen eines Kultur-Substrats in den Kulturbehälter;
eine Sauerstoff-Einleitungsvorrichtung mit einem Vorratsbehälter für flüssigen Sauerstoff und einem Verdampfer zum Zuführen eines Kultur-Abgases, das mit Sauerstoff-Gas angereichert ist, in den Kulturbehälter;
einen Detektor für die Konzentration von gelöstem Sauerstoff zum Nachweis des gelösten Sauerstoffs in der Kulturflüssigkeit in dem Kulturbehälter, wobei ein Signal der Konzentration des gelösten Sauerstoffs ausgegeben wird;
ein Steuergerät für den gelösten Sauerstoff zum Steuern der Zufuhr von gelöstem Sauerstoff aufgrund des Nachweises des Signals der Konzentration des gelösten Sauerstoffs;
eine Meßvorrichtung für Kohlendioxid-Gas zur Messung des Partialdrucks des Kohlendioxid-Gases in einem Kultur-Abgas, das einer Abgasleitung aus dem Kulturbehälter zugeführt wird;
eine Abgas-Abführungsvorrichtung zum Abführen eines Teils des Kultur-Abgases aus dem System heraus aufgrund des Nachweises des Partialdrucks des Kohlenstoffdioxid-Gases;
eine Rohrleitung zur Umlaufführung des Restes des Kultur-Abgases in den Gas-Einlaß des Kulturbehälters; und
eine Luft-Einleitungsvorrichtung zum Zuführen von Luft in den Kulturbehälter.
In der Kultivierungsapparatur der vorliegenden Erfindung wird ein Meßfühler für gelösten Sauerstoff, bestehend aus einer galvanischen Sauerstoffelektrode etc. als Detektor für die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in einer Kulturflüssigkeit eines Kulturbehälters verwendet und die Abweichung eines Luftfluß- Ventils oder eines Sauerstoff-Gas-Regel-Ventils wird gemäß dem Signal der Konzentration des gelösten Sauerstoffs durch die Regeleinheit für den gelösten Sauerstoff, die das Detektionssignal von dem Meßfühler für den gelösten Sauerstoff empfängt, geregelt. Dabei wird die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in einer Kulturflüssigkeit auf geeignete Bedingungen, das heißt auf 0,7 ppm oder höher, vorzugsweise 1 bis 4 ppm, geregelt.
Zusätzlich wird die Zufuhr des zu kultivierenden Substrates (D-Sorbit) zu dem Kulturbehälter durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Zugabe gemäß der Zufuhrgeschwindigkeit des Sauerstoffs zu dem Kulturbehälter während und nach der Wachstumsphase des Mikroorganismus durchgeführt, unter Verhindern, daß die Konzentration des D-Sorbits in der Kulturflüssigkeit 5 % überschreitet, so daß eine hohe Konzentration des D-Sorbits innerhalb einer kurzen Zeitspanne zu L-Sorbose oxidiert wird.
Zusätzlich spart die Apparatur der vorliegenden Erfindung Rohstoffe durch Zurückgewinnung des Abgases, welches einen erhöhten Sauerstoffpartialdruck besitzt, mit einem Kompressor zum Umlaufführen und Wiederverwenden, ein. Um den Partialdruck des Kohlenstoffdioxid-Gases in dem umlaufenden Abgas zu optimieren, wird eine Apparatur zum Messen des Kohlenstoffdioxid-Gas-Partialdruckes, wie z. B. ein Infrarotabsorptionsanalysegerät oder dergleichen, auf dem Weg des Abgases bereitgestellt. Gemäß dem durch die Meßapparatur gemessenen Kohlenstoffdioxid-Gas-Partialdruck wird die geeignete Menge des Abgases durch Regelung der Abweichung eines an dem Weg bereitgestellten Luftablaß-Ventils abgelassen und dabei der Kohlenstoffdioxid-Gas-Partialdruck in dem zu dem Kulturtank zurückkehrenden Abgas auf einen geeigneten Wert (10 % oder weniger) geregelt. Demgemäß werden in der vorliegenden Erfindung die Apparatur und Wartung durch Anwendung des Ablassens eines Teils des Abgases in die Atmosphäre anstelle eines Adsorbens, welches in einer konventionellen Apparatur zur Entfernung des Kohlendioxid-Gases verwendet wird, vereinfacht.
Außerdem wird in der Apparatur der vorliegenden Erfindung der Sauerstoff-Gas-Partialdruck in dem Abgas mittels Meßapparatur für den Sauerstoff-Gas-Partialdruck, gebildet aus einem Zirconiumdioxid-Analysegerät etc., gemessen, während der Sauerstoff-Partialdruck am Einlaß zu dem Kulturbehälter aus beidem, der Umlauf-Flußgeschwindigkeit und der Frischluft- Belüftungsgeschwindigkeit, berechnet wird, um den Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Die Menge des zu oxidierenden Substrates wird dann aus dem Sauerstoffverbrauch abgeschätzt.
Jetzt wird eine bevorzugte Ausführungsform der Apparatur der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der begleitenden Fig. 5 erläutert.
Fig. 5 zeigt eine Übersichtsdarstellung eines bevorzugten Beispiels einer Kultivier-Apparatur der vorliegenden Erfindung.
Die Apparatur der Fig. 5 faßt einen Behälter 1 zum Kultivieren eines Mikroorganismus, eine Substrat-Einspeisevorrichtung 2 zum Einbringen eines Kultur-Substrats (D-Sorbit) in den Kulturbehälter 1, eine Sauerstoff-Einleitungsvorrichtung 3 zur Versorgung des mit Kultur-Abgas gemischten Sauerstoffes, eine Luft-Einleitungsvorrichtung 4 zum Versorgen des Kulturbehälters 1 mit Luft, eine Gas-Abführungsvorrichtung 5 zum Abführen eines Teils des Abgases aus dem Kulturbehälter 1 in das System und einen Kompressor 6 zum Umlaufführen des Abgases in den Kulturbehälter 1.
Im Inneren des vorstehenden Kulturbehälters 1 befindet sich ein Rührer 7, der mit einem Motor angetrieben ist. Der Einlaß 8a eines Gasversorgungsrohres 8 ist mit dem unteren Teil des Behälters verbunden, und der Abgasauslaß 9a eines Abgasrohres 9 ist mit dem oberen Teil verbunden. Eine Substrat-Einspeisungsvorrichtung 2 ist ebenfalls mit dem oberen Teil des Behälters durch eine Leitung 10 verbunden.
Die Substrat-Einspeisungsvorrichtung 2 umfaßt einen Substratbehälter 11, ein Substrat-Einspeisungsventil 12 und eine Substrat-Einspeisungspumpe 13, so daß ein Kultur-Substrat (D-Sorbit) aus dem Substratbehälter 11 in den Kulturbehälter 1 durch das Substrat-Einspeisungsventil 12, die Substrat-Einspeisungspumpe 13 und die Leitung 10 eingespeist wird. Das Einspeisen des D-Sorbits wird durch kontinuierliches oder diskontinuierliches Zugeben unter Verhindern, daß die Konzentration des D-Sorbits in der Kulturflüssigkeit während und nach der Wachstumsphase des Mikroorganismus in dem Kulturtank 1 nicht auf über etwa 5 % ansteigt, durchgeführt.
Der vorstehende Gaseinlaß 8 ist mit der Sauerstoff-Einleitungsvorrichtung 3, umfassend einen Vorratsbehälter 14 für flüssigen Sauerstoff, ein Notabschalteventil 15 und einem Verdampfer 16, durch eine Leitung 17 verbunden und Sauerstoff-Gas, das durch Verdampfen des flüssigen Sauerstoffs mit dem Verdampfer 16 gebildet wird, wird dem Kulturbehälter 1 unter Regeln der Zufuhr durch ein Sauerstoff-Gas-Regelventil 18, welches an der Leitung 17 zur Verfügung steht, zugeführt. In gleicher Weise ist das Gaseinleitungsrohr 8 mit der Lufteinspeisungs-Vorrichtung 4 durch eine Leitung 20 verbunden, und Luft wird dem Kulturbehälter 1 durch ein Luftfluß-Regelventil 21, welches an der Leitung 20 zur Verfügung steht, zugeführt.
Das Sauerstoff-Gas-Regelventil 18 und das Fluß-Regelventil 21, welche die Zufuhr des Sauerstoff-Gases und der Luft regeln, werden durch eine Regeleinrichtung 23 für den gelösten Sauerstoff, welcher ein Meßsignal von einem Detektor 22 für den gelösten Sauerstoff, der in dem Kulturtank 1 installiert ist, empfangen, geregelt. Der Detektor für den gelösten Sauerstoff besteht z. B. aus einer galvanischen Sauerstoffelektrode. Er weist die Konzentration des gelösten Sauerstoffes der Kulturflüssigkeit in dem Kulturbehälter nach, um ein Signal der Konzentration des gelösten Sauerstoffes an die Regeleinrichtung 23 für den gelösten Sauerstoff abzugeben, und die Abweichung des Sauerstoffgas-Regelventils 18 und Fluß-Regel-Ventils 21 werden durch die Regeleinrichtung 23 für den gelösten Sauerstoff, die das Signal ermittelt hat, geregelt.
Luft wird aus der Luft-Einleitungsvorrichtung 4 dem Kulturbehälter 1 zugeführt, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffes bis zur Wachstumsphase des Mikroorganismus ein konstantes Niveau besitzt. Während und nach der Wachstumsphase des Mikroorganismus wird die Zufuhr von Luft unterbrochen und Sauerstoff-Gas wird aus der Sauerstoff-Einspeisungsvorrichtung 3 dem Kulturbehälter 1 zun Regeln der Konzentration des gelösten Sauerstoffes auf 0,7 ppm oder höher, vorzugsweise 1 bis 4 ppm, zugeführt.
Der vorstehende Abgas-Auslaß 9 ist mit der Gas-Abführungsvorrichtung durch einen Tröpfchenabscheider 24 und eine Leitung 25 verbunden und ist ebenfalls mit dem Kompressor 6 durch eine Röhre 26 verbunden. Eine Meßapparatur 27 für den Sauerstoff- Partialdruck, bestehend aus einem Zirconiumdioxid-Analysegerät etc., und eine Meßapparatur für den Kohlendioxid-Gas-Partialdruck, wie ein Infrarotabsorptions-Analysegerät, etc., sind an der Leitung 25 vorgesehen. Der Kohlendioxid-Gas-Partialdruck in dem Abgas wird durch die Meßapparatur 28 für den Kohlendioxid- Partialdruck ermittelt und ein Signal des Detektors wird der Regeleinrichtung 29 für den Kohlendioxidgas-Partialdruck übermittelt. Eine Abweidung eines Luft-Ablaßventils 30 der Gas- Abführungsvorrichtung 5 wird durch die Regeleinrichtung 29 zum Ablaß eines Teiles des Kulturabgases aus dem System geregelt.
Andererseits ist der Kompressor 6 mit der Gaszuführ-Leitung 8 durch eine Röhre 32 zur Umlaufführung, die ein Belüftungs- Umlaufventil 31 zur Verfügung stellt, verbunden. Der Rest des Abgases, der nicht von der Gas-Abführungsvorrichtung 5 abgeführt wurde, wird durch den Kompressor 6 in Umlauf gesetzt, um es in den Kulturbehälter 1 durch das Gaszuführungsrohr 8 unter Regeln der Flußgeschwindigkeit durch das Umlauf-Belüftungsventil 31 zurückzuführen. Dieses Abgas wird gemeinsam mit dem Zuführen des reinen Sauerstoffgases während und nach der Wachstumsphase des Mikroorganismus im Umlauf geführt und wiederverwendet. Dabei wird das mit Sauerstoff angereichterte Gas, das eine Mischung aus Sauerstoffgas und dem Abgas ist, zu dem Kulturbehälter 1 in Umlauf gesetzt. Die Tätigkeit der vorstehenden Apparatur ist nachstehend der Reihe nach erläutert.
(a) Luft wird aus der Luft-Einleitungsvorrichtung 4 dem Kulturbehälter 1 unter Regeln der Abweichung des Fluß-Regelventils 21 durch den Regler 23 für den gelösten Sauerstoff zugeführt, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs der Kulturflüssigkeit in dem Kulturbehälter 1 ein vorgeschriebenes konstantes Niveau besitzt. Zu dieser Zeit wird z.B., wenn die anfängliche Beladungskonzentration des Substrates 20 % beträgt, Luft in den Kulturbehälter 1 eingeleitet, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs 2 ppm wird.
(b) Die Einspeisung des Substrates aus dem Substratbehälter 11 in den Kulturbehälter 1 wird zu der Zeit gestartet, wenn der Sauerstoffverbrauch 15 % Oxidation der Substratkonzentration entspricht, welches durch die Apparatur 27 zum Bestimmen des Sauerstoff-Partialdruckes berechnet wird.
(c) Wenn die Flußgeschwindigkeit aus der Luft-Einleitungsvorrichtung 4 zu dem Kulturbehälter 1 ein Maximum erreicht und die Konzentration an gelöstem Sauerstoff nicht auf dem vorgeschriebenen Niveau gehalten werden kann, wird das Sauerstoff-Gas- Regelventil 18 durch die Regeleinrichtung 23 für den gelösten Sauerstoff geöffnet, um den Kulturbehälter 1 mit Sauerstoff-Gas zu versorgen.
(d) Sofort nachdem mit der Regelung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs durch Sauerstoff-Gas begonnen wird, wird zum Umlaufführen des Abgases zu dem Kulturbehälter 1 das Umlauf- Belüftungsventil 31 geöffnet und der Kompressor 6 gestartet und das Fluß-Regelventil 21 wird geschlossen. Danach wird die Konzentration des gelösten Sauerstoffs nur durch Sauerstoff-Gas beibehalten.
(e) Wenn mit der Umlaufführung des Abgases begonnen wird, wird Kohlendioxid-Gas in dem lufthaltigen Gas angereichert. Demgemäß wird der Kohlendioxid-Gas-Partialdruck in dem Abgas durch die Meßapparatur 28 gemessen, und dann wird das Luft-Ablaßventil 30 zum Ablassen eines Teiles des Abgases in die Atmosphäre und zum Beibehalten des Kohlendioxid-Gas-Partialdruckes in dem lufthaltigen Gas unter einem konstanten Wert (10 %) durch die Regeleinrichtung 29 für den Kohlendioxid-Gas-Partialdruck geöffnet.
(f) Wenn die vorgeschriebene Menge des Substrates im Kulturbehälter 1 zugeführt wurde, wird die Zufuhr unterbrochen.
(g) Wenn die Fermentation in dem Kulturbehälter 1 fortschreitet und dem Ende entgegen geht, verringert sich die benötigte Menge an Sauerstoff. Demgemäß wird der Zufluß des Sauerstoffs in den Kulturbehälter 1 unterbrochen und der Kompressor gestoppt. Zusätzlich wird der Zufluß des Abgases in den Kulturbehälter 1 durch Schließen des Umlauf-Belüftungsventils 31 unterbrochen und die Luftzufuhr aus der Luft-Einleitungsvorrichtung 4 wird wieder geöffnet.
(h) Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Kulturbehälter 1 steigt durch die vorstehende Belüftung schnell an, und der Sauerstoff-Partialdruck steigt ebenfalls. Die Fermentation ist abgeschlossen, wenn der Sauerstoff-Partialdruck in dem Abgas einen vorgeschriebenen Wert (20 %) erreicht.
Die folgenden Beispiele erläutern ausführlich den Prozeß der vorliegenden Erfindung, sind aber nicht zur Beschränkung deren Umfangs anzusehen. In den folgenden Beispielen wurde die in Fig. 5 gezeigt Apparatur verwendet.

Beispiel 1

Gluconobacter suboxidans IFO 3254 wurde in 10 Liter eines Kulturmediums, enthaltend 20 % D-Sorbit, 0,2 % Natriumglutamat, 0,018 % Calciumcarbonat, 0,003 % Nicotinamid, 0,003 % Calciumpantothenat, 0,0001 % Vitamin B&sub2;, 0,0001 % p-Aminobenzoesäure, 0,047 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,03 % Hefeextrakt, 0,01 % Magnesiumsulfat, 0,00015 % Eisen(II)-sulfat, 0,00001 % Mangansulfat und 0,0005 % Actocol, eingeimpft und bei 30º C für 24 Stunden bebrütet. Dieses wurde als Saat zu 49 Litern eines Kulturmediums, enthaltend 20 % D-Sorbit, 0,06 % Ammoniumacetat, 0,102 % Natriumglutamat, 0,06 % Calciumcarbonat, 0,006 % Nicotinamid, 0,0005 % Calciumpantothenat, 0,0002 % Vitamin B&sub2;, 0,00002 % p-Aminobenzoesäure, 0,04 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,02 % Magnesiuinsulfat, 0,0003 % Eisen(II)-sulfat und 0,00002 % Mangansulfat, überführt.
Dieses wurde bei 30º C bebrütet, und nach dem Beginnen des Kultivierens wurden die Belüftungsmenge aus der Luft-Einleitungsvorrichtung 4 und der Innendruck des Kulturbehälters im Bereich zwischen 0,1 bis 0,6 vvm bzw. 0,1 bis 1,8 kg/cm²G eingeregelt, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Bereich von 2,5 ± 0,5 ppm beibehalten wurde. Nachdem der Maximalwert der Belüftung und der innere Druck 0,6 vvm bzw. 1,8 kg/cm²G erreichte, wurde Sauerstoff-Ggas, gebildet durch Verdampfen von flüssigem Sauerstoff in der Sauerstoff-Einleitungsvorrichtung 3, in den Gaseinlaß 8 eingebracht und dann durch den Kulturbehälter 1 durchperlen gelassen, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs 2,5 ± 0,5 ppm betrug. Zur selben Zeit wurde die Belüftung unterbrochen, und der Kompressor 6 wurde zum Zurückgewinnen des Abgases gestartet. Das Abgas wurde zu dem Kulturbehälter 1 in Umlauf gesetzt. Danach wurde ein Teil der umlaufenden Luft (0,03 vvm) durch die Abgas-Abführungsvorrichtung 5 in die Atmosphäre abgeführt, um die Ansammlung des Kohlendioxid- Gases zu verhindern. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wurde durch das Perlen des Sauerstoff-Gases aufrechterhalten. Da die Luftmenge unzureichend zum Aufrechterhalten des internen Druckes ist, wurde Luft aus einer Quelle eingeleitet.
Andererseits wurde mit der Zugabe von D-Sorbit, das mit dem Voranschreiten des Kultivierens oxidiert wurde, durch den Substrateinspeiser 2 zu dem Kulturbehälter 1 zu der Zeit begonnen, nachdem deren Konzentration in der Kulturflüssigkeit 5 % betrug, und das Kultivieren wurde unter Zufügung von 51 Litern einer 60 w/w%-wäßrigen D-Sorbit-Lösung über im ganzen 20 Stunden durchgeführt.
Gemäß dem vorstehenden Kultivieren wurde es möglich gemacht, die Kultivierung mit einer Beladungskonzentration von 50 w/v% D- Sorbit pro Ansatz in 20 Stunden durchzuführen und L-Sorbose in einer Ausbeute von 95 %, ausgehend von D-Sorbit, anzureichern.

Beispiel 2

Gluconobacter suboxidans IFO 3254 wurde in 10 Liter eines Kulturmediums, enthaltend 20 % D-Sorbit, 0,2 % Natriumglutamat, 0,018 % Calciumcarbonat, 0,003 % Nicotinamid, 0,003 % Calciumpantothenat, 0,0001 % Vitamin B&sub2;, 0,0001 % p-Aminobenzoesäure, 0,047 Kaliumdihydrogenphosphat, 0,03 % Hefeextrakt, 0,01 % Magnesiumsulfat, 0,00015 % Eisen(II)-sulfat, 0,00001 % Mangansulfat und 0,0005 % Actocol, eingeimpft und bei 30º C für 24 Stunden bebrütet. Dieses wurde als Saat zu 54 Litern eines Kulturmediums, enthaltend 25 % D-Sorbit, 0,08 % Ammoniumacetat, 0,067 % Alanin, 0,06 % Calciumcarbonat, 0,006 % Nicotinamid, 0,0005 % Calciumpantothenat, 0,0002 % Vitamin B&sub2;, 0,00002 % p-Aminobenzoesäure, 0,04 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,02 % Magnesiumsulfat, 0,0003 % Eisen(II)-sulfat und 0,00002 % Mangansulfat, transferiert.
Dieses wurde bei 30º C bebrütet, und nach dem Beginnen des Kultivierens wurden die Belüftungsmenge aus der Luft-Einleitungsvorrichtung 4 und der Innendruck des Kulturbehälters im Bereich zwischen 0,1 bis 0,6 vvm bzw. 0,1 bis 1,8 kg/cm²G eingeregelt, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Bereich von 2,5 ± 0,5 ppm beibehalten wurde. Nachdem der Maximalwert der Belüftung und der innere Druck 0,6 vvm bzw. 1,8 kg/cm²G erreichte, wurde Sauerstoff-Gas, das durch Verdampfen von flüssigem Sauerstoff in der Sauerstoff-Einleitungsvorrichtung 3, in den Gaseinlaß 8 eingebracht und dann durch den Kulturbehälter 1 durchperlen gelassen, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs 2,5 ± 0,5 ppm betrug. Zur selben Zeit wurde die Belüftung unterbrochen, und der Kompressor 6 wurde zum Zurückgewinnen des Abgases gestartet. Das Abgas wurde zu dem Kulturbehälter 1 in Umlauf gesetzt. Danach wurde ein Teil der umlaufenden Luft (0,03 vvm) durch die Abgas-Abführungsvor richtung 5 in die Atmosphäre abgeführt, um die Ansammlung des Kohlendioxid-Gases zu verhindern. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wurde durch das Perlen des Sauerstoff-Gases aufrechterhalten. Da die Luftmenge unzureichend zum Aufrechterhalten des internen Druckes ist, wurde Luft aus einer Quelle eingeleitet.
Andererseits wurde mit der Zugabe von D-Sorbit, das mit dem Voranschreiten des Kultivierens oxidiert wurde, durch den Substrateinspeiser 2 zu dem Kulturbehälter 1 zu der Zeit begonnen, nachdem deren Konzentration in der Kulturflüssigkeit 5 % betrug, und das Kultivieren wurde unter Zufügung von 51 Litern einer 60 w/w%-wäßrigen D-Sorbit-Lösung über im ganzen 20 Stunden durchgeführt.
Gemäß dem vorstehenden Kultivieren wurde es möglich gemacht, die Kultivierung mit einer Beladungskonzentration von 50 w/v% D-Sorbit pro Ansatz in 20 Stunden durchzuführen und L-Sorbose in einer Ausbeute von 95 %, ausgehend von D-Sorbit, anzureichern.

Beispiel 3

Gluconobacter suboxidans BL-9 (IFO 14489, FERN BP-1241) wurde in 10 Liter eines Kulturmediums, enthaltend 20 % D-Sorbit, 0,3 % Glycerin, 0,2 % Natriumglutamat, 0,018 % Calciumcarbonat, 0,003 % Nicotinamid, 0,003 % Calciumpantothenat, 0,0001 % Vitamin B&sub2;, 0,0001 % p-Aminobenzoesäure, 0,047 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,01 % Magnesiumsulfat, 0,00015 % Eisen(II)-sulfat, 0,00001 % Mangansulfat und 0,0005 Actocol, eingeimpft und bei 30º C für 24 Stunden bebrütet. Dieses wurde als Saat zu 49 Litern eines Kulturmediums, enthaltend 20 % D-Sorbit, 0,05 % Glutaminsäure, 0,06 % Ammoniumacetat, 0,102 % Natriumglutamat, 0,06 % Calciumcarbonat, 0,006 % Nicotinamid, 0,0005 % Calciumpantothenat, 0,0002 % Vitamin B&sub2;, 0,00002 % P-Aminobenzoesäure, 0,04 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,02 % Magnesiumsulfat, 0,0003 % Eisen(II)-sulfat und 0,00002 % Mangansulfat, überführt.
Dieses wurde bei 30º C bebrütet, und nach dem Beginnen des Kultivierens wurden die Belüftungsmenge aus der Luft-Einleitungsvorrichtung 4 und der Innendruck des Kulturbehälters im Bereich zwischen 0,1 bis 0,6 vvm bzw. 0,1 bis 1,8 kg/cm²G eingeregelt, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Bereich von 2,5 ± 0,5 ppm beibehalten wurde. Nachdem der Maximalwert der Belüftung und der innere Druck 0,6 vvm bzw. 1,8 kg/cm²G erreichte, wurde Sauerstoff-Gas, gebildet durch Verdampfen von flüssigem Sauerstoff in der Sauerstoff-Einleitungsvorrichtung 3, in den Gaseinlaß 8 eingebracht und dann durch den Kulturbehälter 1 durchperlen gelassen, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs 2,5 ± 0,5 ppm betrug. Zur selben Zeit wurde die Belüftung unterbrochen, und der Kompressor 6 wurde zum Zurückgewinnen des Abgases gestartet. Das Abgas wurde zu dem Kulturbehälter 1 in Umlauf gesetzt. Danach wurde ein Teil der umlaufenden Luft (0,03 vvm) durch die Abgas-Abführungsvorrichtung 5 in die Atmosphäre abgeführt, um die Ansammlung des Kohlendioxid-Gases zu verhindern. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wurde durch das Perlen des Sauerstoff-Gases aufrechterhalten. Da die Luftmenge unzureichend zum Aufrechterhalten des internen Druckes ist, wurde Luft aus einer Quelle eingeleitet.
Andererseits wurde mit der Zugabe von D-Sorbit, das mit dem Voranschreiten des Kultivierens oxidiert wurde, durch den Substrateinspeiser 2 zu dem Kulturbehälter 1 zu der Zeit begonnen, nachdem deren Konzentration in der Kulturflüssigkeit 5 % betrug, und das Kultivieren wurde unter Zufügung von 51 Litern einer 60 w/w%-wäßrigen D-Sorbit-Lösung über im ganzen 20 Stunden durchgeführt.
Gemäß dem vorstehenden Kultivieren wurde es möglich gemacht, die Kultivierung mit einer Beladungskonzentration von 50 w/v% D-Sorbit pro Ansatz in 20 Stunden durchzuführen und L-Sorbose in einer Ausbeute von 97,5 %, ausgehend von D-Sorbit, anzureichern.

Beispiel 4

Gluconobacter suboxidans BL-115 (IFO 14490, FERN BP-1240) wurde in 10 Liter eines Kulturmediums, enthaltend 20 % D-Sorbit, 0,3 % Glycerin, 0,2 % Natriumglutamat, 0,018 % Calciumcarbonat, 0,003 % Nicotinamid, 0,003 % Calciumpantothenat, 0,0001 % Vitamin B&sub2;, 0,0001 % p-Aminobenzoesäure, 0,047 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,01 % Magnesiumsulfat, 0,00015 % Eisen(II)-sulfat, 0,00001 % Mangansulfat und 0,0005 % Actocol, eingeimpft und bei 30º C für 24 Stunden bebrütet. Dieses wurde als Saat zu 54 Litern eines Kulturmediums, enthaltend 25 % D-Sorbit, 0,05 % Glycerin, 0,08 % Ammoniumacetat, 0,067 % Alanin, 0,06 % Calciumcarbonat, 0,006 % Nicotinamid, 0,0005 % Calciumpantothenat, 0,0002 Vitamin B&sub2;, 0,00002 % p-Aminobenzoesäure, 0,04 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,02 % Magnesiumsulfat, 0,0003 % Eisen(II)- sulfat und 0,00002 % Mangansulfat, überführt.
Dieses wurde bei 30º C bebrütet, und nach dem Beginnen des Kultivierens wurden die Belüftungsmenge aus der Luft-Einleitungsvorrichtung 4 und der Innendruck des Kulturbehälters im Bereich zwischen 0,1 bis 0,6 vvm bzw. 0,1 bis 1,8 kg/cm²G eingeregelt, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Bereich von 2,5 ± 0,5 ppm beibehalten wurde. Nachdem der Maximalwert der Belüftung und der innere Druck 0,6 vvm bzw. 1,8 kg/cm²G erreichte, wurde Sauerstoff-Gas, gebildet durch Verdampfen von flüssigem Sauerstoff in der Sauerstoff-Einleitungsvorrichtung 3, in den Gaseinlaß 8 eingebracht und dann durch den Kulturbehälter 1 durchperlen gelassen, so daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs 2,5 ± 0,5 ppm betrug. Zur selben Zeit wurde die Belüftung unterbrochen, und der Kompressor 6 wurde zum Zurückgewinnen des Abgases gestartet. Das Abgas wurde zu dem Kulturbehälter 1 in Umlauf gesetzt. Danach wurde ein Teil der umlaufenden Luft (0,03 vvm) durch die Abgas-Abführungsvorrichtung 5 in die Atmosphäre abgeführt, um die Ansammlung des Kohlendioxid- Gases zu verhindern. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wurde durch das Perlen des Sauerstoff-Gases aufrechterhalten. Da die Luftmenge unzureichend zum Aufrechterhalten des internen Druckes ist, wurde Luft aus einer Quelle eingeleitet.
Andererseits wurde mit der Zugabe von D-Sorbit, das mit dem Voranschreiten des Kultivierens oxidiert wurde, durch den Substrateinspeiser 2 zu dem Kulturbehälter 1 zu der Zeit begonnen, nachdem deren Konzentration in der Kulturflüssigkeit 5 % betrug, und das Kultivieren wurde unter Zufügung von 51 Litern einer 60 w/w%-wäßrigen D-Sorbit-Lösung über im ganzen 20 Stunden durchgeführt.
Gemäß dem vorstehenden Kultivieren wurde es möglich gemacht, die Kultivierung mit einer Beladungskonzentration von 50 w/v% D-Sorbit pro Ansatz in 20 Stunden durchzuführen und L-Sorbose in einer Ausbeute von 97,3 %, ausgehend von D-Sorbit, anzureichern. Beimpfungsverhältnis: 10 %

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose durch mikrobiologische Oxidation von D-Sorbit, umfassend die Schritte

des Hinzufügens von D-Sorbit zu einer Kulturflüssigkeit in einer solchen Konzentration, daß sie beim Kultivieren während und nach der Phase des Wachstums des eingesetzten Mikroorganismus etwa 5 % nicht überschreitet, während

der Umlaufführung eines Kultur-Abgases, das mit Sauerstoff-Gas angereichert ist, um die Konzentration des gelösten Sauerstoffs zu steuern, und des Abführens eines Teils des Abgases aus dem System heraus, um den Partialdruck des Kohlenstoffdioxid-Gases in dem Umlauf-Gas zu steuern.

2. Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose nach Anspruch 1, worin die Konzentration der Anfangs-Beladung des D- Sorbits 8 bis 25 % betragt und D-Sorbit in einer solchen Konzentration hinzugefügt wird, daß sie während und nach der Phase des Wachstums des eingesetzten Mikroorganismus etwa 5 % nicht überschreitet, um eine Konzentration der End-Beladung von 40 bis 60 % zu erreichen, wobei während und nach der Phase des Wachstums das mit Sauerstoff-Gas angereicherte Abgas im Kreislauf geführt wird, um die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in dem Kulturmedium so zu steuern, daß sie nicht kleiner als 0,5 ppm ist, und ein Teil des umlaufenden Abgases aus dem System heraus abgeführt wird, um den Partialdruck des Kohlenstoffdioxid-Gases in dem Belüftungs-Gas so zu steuern, daß sie nicht höher als 10 % ist.

3. Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose nach Anspruch 1, worin 0,04 bis 0,07 % einer glykogenen Aminosäure als Komponente in dem Kulturmedium zugesetzt wird.

4. Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Apparatur zum Kultivieren des Mikroorganismus verwendet wird, die die folgenden Komponenten umfaßt:

Einen Kulturbehälter, der mit einem Rührer, einen im unteren Teil des Behälters angebrachten Gas-Einlaß und einen im oberen Teil des Behälters angebrachten Abgas- Auslaß ausgerüstet ist, zum Kultivieren des Mikroorganismus;

eine Substrat-Einspeisungsvorrichtung zum Einbringen eines Kultur-Substrats in den Kulturbehälter;

eine Sauerstoff-Einleitungsvorrichtung mit einem Vorratsbehälter für flüssigen Sauerstoff und einem Verdampfer zum Zuführen eines Kultur-Abgases, das mit Sauerstoff-Gas angereichert ist, in den Kulturbehälter, einen Detektor für die Konzentration von gelöstem Sauerstoff zum Nachweis des gelösten Sauerstoffs in der Kulturflüssigkeit in dem Kulturbehälter, wobei ein Signal der Konzentration des gelösten Sauerstoff ausgegeben wird;

ein Steuergerät für den gelösten Sauerstoff zum Steuern der Zufuhr von gelöstem Sauerstoff aufgrund des Nachweises des Signals der Konzentration des gelösten Sauerstoffs;

eine Meßvorrichtung für Kohlendioxid-Gas zur Messung des Partialdrucks des Kohlenstoffdioxid-Gases in einem Kultur-Abgas, das einer Abgasleitung aus dem Kulturbehälter zugeführt wird;

eine Abgas-Abführungsvorrichtung zum Abführen eines Teils des Kultur-Abgases aus dem System heraus aufgrund des Nachweises des Partialdrucks des Kohlenstoffdioxid- Gases;

eine Rohrleitung zur Umlaufführung des Restes des Kultur-Abgases in den Gas-Einlaß des Kulturbehälters; und

eine Luft-Einleitungsvorrichtung zum Zuführen von Luft in den Kulturbehälter.