DK173550B1

DK173550B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose og apparat til anvendelse ved fremgangsmåden

Info

Publication number: DK173550B1
Application number: DK198706790A
Authority: DK
Inventors: Katsumitsu Kishimoto; Kazuhiko Kintaka; Hiroyuki Yoshinaga
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1986-12-25
Filing date: 1987-12-22
Publication date: 2001-02-19
Also published as: IE873473L; ES2039464T3; DE3752177D1; DE3784677D1; EP0477997A1; ATE86666T1; US6284499B1; IE59996B1; DE3752177T2; EP0273648A3; EP0273648A2; DE3784677T2; DK679087A; CN87108309A; EP0477997B1; DK679087D0; EP0273648B1; CN1029322C; ATE163969T1

Description

i DK 173550 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose under anvendelse af mikroorganismer samt et apparat til dyrkning af mikroorganis-5 mer der egner sig til brug ved nævnte fremgangsmåde.

L-sorbose er et af de naturligt forekommende keto-hexoser og den vindes i saft fra bl.a. rønnebær og er et vigtigt stof som råmateriale til syntese af vitamin C. L-sorbosé fremstilles ved gæring hvor D-sorbitol oxideres 10 af mikroorganismer, fx bakterier hørende til slægten Glu-conobacter.

Ved en konventionel gæringsfremstilling af L-sorbose opnås der ved omdannelse af råmaterialet D-sorbitol til L-sorbose et udbytte der i det højeste er ca. 93%, 15 hvor der dannes betydelige mængder biprodukter såsom fx 5-ketofruktose, D-fruktose og 2-ketoglukonsyre. For at nedsætte råmaterialeomkostningerne for vitamin C er det nødvendigt at forøge udbyttet ved omdannelse af D-sorbitol til L-sorbose til mere end det er ved en konventionel 20 proces og at hindre dannelse af de ovennævnte biprodukter så meget som muligt.

I europæisk patentansøgning nr. 233050 (A2) er det angivet at L-sorbose kan fremstilles i højere udbytte ud fra D-sorbitol ved mikrobiologisk oxidation ved hjælp af .25 en mikroorganisme som hører til slægten Gluconobacter og som i sammenligning med moderstammen har nedsat evne til at vokse med D-sorbitol som eneste kulstofkilde.

I europæisk patentansøgning nr. 199.548 omhandles en fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose ved 30 mikrobiel oxidation af D-sorbitol, ved hvilken man dyrker en kompetent mikroorganisme i et medium, hvori koncentrationen af opløst oxygen reguleres til at ligge i området fra ca. 1 til ca 5 ppm gennem hele vækstfasen af mikroorganismen. Der kan ved denne fremgangsmåde 35 opnås et udbytte på 97% L-sorbose.

2 DK 173550 B1

Det skal i øvrigt nævnes at når koncentrationen a£ D-sorbitol i et dyrkningsmedium overstiger ca. 5% under og efter mikroorganismernes vækstfase, inhiberes de på grund af både høje koncentrationer af substratet (D-sorbi-5 tol) og produktet (L-sorbose), hvilket fører til nedsættelse af oxidationshastigheden. Det er følgeligt nødvendigt at kontrollere koncentrationen af D-sorbitol så den er under cå.v5%. Når imidlertid koncentrationen af substratet tages som et hastighedsbestemmende trin, opstår der et 10 problem i og med at der sker forøget dannelse af biprodukter som fx fruktose og 2-ketoglukonsyre.

Det skal desuden nævnes at man ved denne type produktionsmetode undertiden ved hjælp af en kompressor udvinder en kultur-afgangsgas som indeholder oxygen i høj 15 koncentration og af økonomiske grunde recirkulerer og genvinder denne afgangsgas til en dyrkningsvæske. I dette tilfælde akkumuleres kuldioxidgas udviklet ved mikroorganismernes ånding i afgangsgassen, og når koncentrationen af kuldioxidgas går op over 10%, inhiberes mikroorganis-20 mernes væksthastighed og oxidationshastigheden kraftigt.

Ved konventionelle fremgangsmåder træffer man derfor foranstaltninger til at fjerne kuldioxidgas, fx ved hjælp af en adsorbent såsom natriumhydroxid eller aktiveret kul.

Når sådanne midler bruges opstår der imidlertid mange pro-25 blemer såsom forøgelse af produktionsomkostningerne på grund af nødvendigheden af en adsorptionskolonne og en adsorbent samt på grund af nødvendigheden af vedligeholdelse heraf.

Japansk patentskrift Kokoku nr. 61-5709 angiver en 30 fremgangsmåde og et apparat til dyrkning af mikroorganismer såsom svampe. Ifølge den nævnte publikation fremstilles der en gas som er beriget med oxygen ud fra luft ved adsorption af luftens nitrogen, og det bruges til beherskelse af partialtrykket af kuldioxidgas i en dyrknings-35 beholder såvel som til beherskelse af koncentrationen af opløst oxygen i en dyrkningstank.

3 DK 173550 B1

Det er opfindelsens formål, at der ved opfindelsen opnås en nedsættelse af omkostningerne ved fremstilling af L-sorbose ved mikrobiologisk oxidation ved at man i en afgangsgas fra dyrkningen, som skal genbruges, 5 fjerner kuldioxidgas uden at anvende nogen adsorbent til styring af partialtrykket af kuldioxidgas korrekt.

Det er endvidere opfindelsens formål at tilvejebringe en fremgangsmåde så der opnås højt udbytte af L-sorbose pr.* batch ved god styring af en koncentration 10 af D-sorbitol under og efter vækstfasen til oxidering af en høj koncentration af D-sorbitol til L-sorbose på kort tid.

Et led i opfindelsen er det også at forenkle apparaturet og dets vedligeholdelse ved fremstilling af 15 L-sorbose.

Opfindelsen skal i det følgende forklares nærmere, til dels under henvisning til tegningen, på hvilken fig. 1 er en graf der belyser relationen mellem den oprindelige koncentration af D-sorbitol og en specifik 20 væksthastighed, fig. 2 en graf der belyser relationen mellem koncentrationen af 1-sorbitol og produktiosnhastigheden af L-sorbose, fig. 3 en graf der belyser relationen mellem parti-25 altrykket af kuldioxidgas og specifik væksthastighed, fig. 4 en graf der belyser relationen mellem partialtrykket af kuldioxidgas og produktionshastighed af L-sorbose og fig. 5 et principskema for et dyrkningsapparat 30 ifølge opfindelsen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af L-sorbose ved mikrobiologisk oxidation af D-sorbitol er ejendommelig ved at man sætter D-sorbitol til en dyrk- 35 4 DK 173550 B1 ningsvseske i en sådan koncentration at den ikke overstiger ca. 5% ved dyrkningen under og efter den anvendte mikroorganismes vækstfase, og ved at man cirkulerer en med oxygengas beriget afgangsgas fra dyrkningen til styring af 5 koncentrationen af opløst oxygen og fjerner en del af denne afgangsgas fra systemet til styring af partialtrykket af kuldioxidgas i den cirkulerende gas.

Opfindelsen angår også et apparat til fremstilling af L-sorbose ved mikrobiologisk oxidation af D-sorbi-10 tol, og dette apparat er ejendommeligt ved, at det har en dyrkningstank til dyrkning af mikroorganismen, udstyret med en omrører, en gasindgang i tankens nedre del og en ventilations-gasudgang i tankens øvre del; et substrat-tilførselsorgan til tilførsel af substrat til 15 dyrkningstanken; en tilførselssystem for oxygen, omfattende en lagertank for flydende oxygen og en evaporator til forsyning af dyrkningstanken med en dyrknings-afgangsgas, som er beriget med oxygengas; en detektor for koncentration af opløst oxygen til over-20 vågning af opløst oxygen i dyrkningstanken og afgivelse af et signal om koncentrationen af opløst oxygen; et kontrolorgan for opløst oxygen til kontrol af tilførslen af opløst oxygen ved modtagelse af nævnte oxygenkontrol signal; et kuldioxidgas-måleorgan til 25 måling af partialtrykket af kuldioxidgas i en afgangsgas fra dyrkningen, der føres til et afgangsgasrør fra dyrkningstanken; et afgangsgas-frigivelsesorgan til frigivelse af en del af afgangsgassen fra dyrkningen ved detektering af kuldioxidgassens partialtryk; en 30 ledning til cirkulering af resten af afgangsgassen fra dyrkningen til dyrkningstankens indgang; og et lufttilførselsorgan til tilførsel af luft til dyrkningstanken.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan dannelse af biprodukter som fx D-fruktose, 2-ketoglukonsyre og 35 5-ketofruktose nedbringes til et minimum. Desuden kan 5 DK 173550 B1 man ved den foreliggende fremgangsmåde oxidere en høj koncentration af D-sorbitol til L-sorbose på kort tid, og udbyttet pr. batch kan holdes højt fordi koncentrationen af D-sorbitol i dyrkningsmediet efter vækstfasen 5 kontrolleres på en sådan måde, at det ikke overstiger 5%.

Ved anvendelse af dyrkningsapparatet ifølge opfindelsen ^genbruger man afgangsgassen, hvorved man sparer resourcer så den økonomiske fordel ved frem-10 gangsmåden yderligere stiger. Apparatet ifølge opfindelsen kan endvidere forenkles og er fordelagtigt med hensyn til vedligeholdelse, fordi kuldioxidgassen i afgangsgassen fortyndes og en del af afgangsgassen slippes ud af systemet uden at man bruger noget adsorp-15 tionsmiddel som i de konventionelle apparater.

På grund af de forskellige fordele kan L-sorbose, hvis pris udgør en meget høj andel af råmaterialeomkostningerne ved produktion af vitamin C, leveres økonomisk i sammenligning med konventionelle fremgangsmåder, og pro-20 duktionsomkostningerne for vitamin C, der har bred anvendelse i bl.a. lægemidler og fødevarer, kan derfor nedsættes .

Den foreliggende fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose ved mikrobiologisk oxidation af D-sorbitol om-25 fatter følgende trin: (1) indføring af D-sorbitol i en dyrkningsvæske i en sådan koncentration at den ikke kommer til at overstige ca. 5% ved dyrkningen under og efter den anvendte mikroorganismes vækstfase, mens man 30 35 6 DK 173550 B1 (2) cirkulerer og lufter en afgangsgas fra dyrkningen, der er blevet beriget med hensyn til oxygengas for at forøge oxygenets partialtryk i dyrkningsvæsken til styring af koncentrationen af opløst oxygen, og 5(3) udtager en del af afgangsgassen fra dyrkningen af systemet for at kontrollere partialtrykket af kuldioxidgas i den cirkulerende gas.

- Vedvden foreliggende produktionsmetode kan man bruge en hvilken som helst mikroorganisme som har evne 10 til at oxidere D-sorbitol til L-sorbose. Eksempler på sådanne mikroorganismer er bl.a. bakterier af slægten Glu-conobacter, fx udsædsstammer af Gluconobacter suboxydans eller Gluconobacter oxydans. Særlige eksempler på sådanne stammer er bl.a. Gluconobacter suboxydans IFO 3254, 15 IFO 3257, IFO 12528, IFO 3255, IFO 3256, IFO 3258 og IFO 3291, samt desuden Gluconobacter oxydans IFO 3189. Disse stammer er aerobe og gramnegative ubevægelige stavbakterier som vokser ved surt pH og producerer eddikesyre ud fra ætanol; det er kendte stammer som er opført i "List 20 of Cultures, 1984, Seventh Edition" offentliggjort af Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan.

Endvidere kan man ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bruge Gluconobacter suboxydans BL-9 (IFO 14489, FERM BP-1241) og Gluconobacter suboxydans BL-115 (IFO 25 14490, FERM BP-1240) der er anført i ovennævnte europæiske patentansøgning nr. 233050 (A2). IFO- og FERM-numrene er accessionsnumre hos henholdsvis Institute for Fermentation Osaka (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodoga-wa-ku, Osaka, Japan? og Fermentation Research Institute, 30 Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI), 1-3, Yata-bemachi-higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan. Begge stammer blev deponeret hos IFO den 21. januar 1986 og hos FRI den 1. februar 1986, omdannet til deponeringer under 35 Budapest-traktaten den 22. december 1 986.

7 DK 173550 B1

Med betegnelsen "vækstfase" for de ovennævnte mikroorganismer menes i nærværende beskrivelse latensfasen og en dyrkningsperiode indtil afslutningen af den logaritmiske vækstfase ved dyrkning af de anvendte mikroorga-5 nismer. Vækstfasen varierer alt efter den særlige slags mikroorganisme der bruges, dyrkningsbetingelserne og deslige, men kan let bestemmes ved udarbejdelse af en vækstkurve -i· overensstemmelse med sædvanlige fremgangsmåde.

I almindelighed svarer vækstfasen til den dyrkningsperio-10 de der behøves til forbrug af en nitrogenkilde i dyrkningsmediet, og i mange tilfælde svarer den fx til ca. 9 timer efter dyrkningens begyndelse.

Ved den foreliggende fremgangsmåde optimeres en indledende koncentration af D-sorbitol til 8-25% for at 15 forbedre væksthastigheden, og som beskrevet under punkt (1) ovenfor, tilsættes den resterende mængde D-sorbitol kontinuerligt eller med mellemrum i en sådan koncentration at den ikke går op over ca. 5% under og efter vækstfasen af den anvendte mikroorganisme, for at nå op på en 20 sluttelig charge-koncentration på 40-60%.

Den indledende charge-koncentration af D-sorbitol er fortrinsvis 8-25%. Tegningens fig. 1 og 2 belyser henholdsvis virkningen af den indledende charge-koncentration af D-sorbitol på denne specifikke væksthastighed og 25 virkningen af koncentrationen af D-sorbitol på den specifikke produktionshastighed for L-sorbose. Som det ses af fig. 1 og ? forøges den specifikke væksthastighed og den specifikke produktionshastighed for L-sorbose når koncentrationen af D-sorbitol er 8-25%, navnlig 8-20%.

30 Under og efter vækstfasen, som beskrevet foran, holdes charge-koncentrationen af D-sorbitol under 5% så at oxidationen af D-sorbitol til L-sorbose skrider effektivt frem. På den anden side forsinkes omdannelsen til L- sorbose når charge-koncentrationen af D-sorbitol går op 35 8 DK 173550 B1 over 5% og dyrkningstiden forlænges fordi mikroorganismerne har tendens til at blive inhiberet af substratet.

Ved konventionelle fremgangsmåder udføres dyrkningen på en sådan måde at man har hele mængden af D-sor-5 bitol til stede straks ved dyrkningens begyndelse. Som følge heraf inhiberes mikroorganismerne kraftigt af substratet og der behøves en lang dyrkningstid. Når man imidlertid gennemfører tilførsel af D-sorbitol i henhold til den foreliggende fremgangsmåde, afkortes dyrkningstiden.

10 Man har til belysning heraf sammenlignet fremgangsmåden ifølge opfindelsen med den konventionelle fremgangsmåde (hvor hele mængden af D-sorbitol tilføres straks). Resulterne fremgår af nedenstående tabel 1.

15 20 25 30 35 9 DK 173550 B1

Tabel 1

Samlet Maksimal Maksimal Tidsforbrug mængde specifik oxidati- til gæringen, af D-sorbitol vækstha- onsha- t stighed stighed 5 30% (tilført _1 straks) 0,22 (t ) 24,2 (g/l.t) 19 35% (tilført straks) .0,17 22,7 24 40% (tilført * 10 straks) * 0,12 21,3 28 50% (tilført straks) 0,05 15,7 47 50% (tilført i henhold til opfindelsen) 0,28 29, 1 20.

15

Som det ses af tabel 1 behøver dyrkningen 47 timer ved den konventionelle fremgangsmåde når der bruges en 50%s opløsning af D-sorbitol, mens der kun behøves 20 timer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

20 Koncentrationen af D-sorbitol i ovennævnte dyrk ningsmedium kontrolleres ved beregning af en teoretisk mængde oxygen der behøves til oxidation af D-sorbitol til L-sorbose. Det betyder at mængden af D-sorbitol ikke bestemmes direkte, og der indfyldes en forud bestemt mæng-25 de (8-25%) D-sorbitol i mediet ved begyndelsen hvorefter dyrkningen udføres ved tilførsel til kulturen af en teoretisk mængde oxygen på en sådan måde at denne mængde andrager 5% eller derunder. Derefter fortsættes dyrkningen ved regulering af D-sorbitol til at passe til tilførslen 30 af oxygen på en sådan måde at koncentrationen deraf ikke går op over 5%.

Ved den foreliggende fremgangsmåden kan mikroorganismens oxygenbehov kun tilfredsstilles af oxygen fra luft i dyrkningens tidlige trin. Som beskrevet foran under (2) 35 gælder det imidlertid at når mikroorganismekoncentrationen og mikroorganismens oxygenbehov forøges under og efter c 10 DK 173550 B1 vækstfasen, så reguleres en afgangsgas fra dyrkningen, som er blevet beriget med oxygengas, fx fra flydende oxygen, til forøgelse af partialtrykket af oxygen (fx oxygen-5 beriget gas hvis oxygen-partialtryk er forøget til 21% eller derover, fortrinsvis 21-50%) til dyrkningsvæsken for at kompensere for den utilstrækkelige mængde oxygen til styring af,koncentrationen af i dyrkningsmediet opløst r oxygen til -0,7 ppm eller derover, fortrinsvis 1-4 ppm.

10 Tilførslen af oxygen bestemmes støkiometrisk på basis af D-sorbitol. Ved dyrkningen ifølge opfindelsen påvirker det i princippet ikke produktionen af L-sorbose selv om der er overskud af opløst oxygen til stede i dyrkningsmediet, et overskud som ikke udnyttes ved reaktio-15 nen. Det er imidlertid mest økonomisk at forsyne dyrkningstanken med oxygen i den korrekte mængde, navnlig i en mængde på ikke under 0,5 ppm, og i praksis under hensyn til at koncentrationen af opløst oxygen i dyrkningsme diet kan være ujævn, styres koncentrationen af opløst 20 oxygen til 0,7 ppm eller derover, fortrinsvis til 1-4 ppm som beskrevet ovenfor.

Ved den foreliggende opfindelse økonomiseres dyrkningen ved recirkulation af en afgangsgas fra dyrkningen med forøget oxygen-partialtryk som beskrevet foran, idet 25 recirkulationen sker til dyrkningsvæsken under og efter mikrooranismens vækstfase. Det er imidlertid kendt at når en afgangsgas genanvendes ved recirkulation, så akkumuleres kuldioxidgas som er udviklet ved mikroorganismernes respiration, og mikroorganismernes vækst og oxidationsak-30 tivitet inhiberes. Fig. 3 og 4 belyser virkningerne af partialtrykket af kuldioxidgas på henholdsvis den specifikke væksthastighed og produktionshastighed for L-sorbose. Som det fremgår af fig. 3 og 4 inhiberes den specifikke væksthastighed kraftigt når koncentrationen af kuldioxid over-35 stiger 5%. På den anden side gælder det at omend produk- 11 DK 173550 B1 tionshastigheden (oxidationshastigheden) for L-sorbose ikke inhiberes så stærkt som den specifikke væksthastighed, inhiberes den noget når koncentrationen af kuldioxidgas overstiger 5%, og den inhiberes kraftigt når koncentra-5 tionen af kuldioxidgas overstiger 10%. Ifølge den foreliggende opfindelse frigiver man derfor en del af afgangsgassen fra dyrkningen (5-10%) til atmosfæren, og der tilføres oxygengas i» e.n sådan mængde at den svarer til den frigivne mængde oxygen plus oxygen forbrugt af mikroorganismerne, hvor-10 ved man fortynder koncentrationen af kuldioxidgas. Partialtrykket af kuldioxidgas i den cirkulerende gas kontrolleres herved til 10% eller derunder, hvilket ikke i ugunstig retning påvirker produktionshastigheden. Ved udnyttelse af den foreliggende opfindelse behøver man ikke 15 nogen adsorbent, i modsætning til hvad tilfældet er ved de konventionelle metoder som beskrevet foran. Dette er fordelagtigt med hensyn til vedligeholdelse af apparaturet og processens økonomi. Selv om man frigiver en del af afgangsgassen fra dyrkningen til atmosfæren på denne måde, 20 kan man dog spare 60% af den til anvendelse kommende mængde oxygen ved at genvinde en del af nævnte afgangsgas og forhøje dens oxygen-partialtryk, hvilket er en stor økonomisk fordel.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfin-25 delse bruger man endvidere et dyrkningsmedium indehol- . dende visse bestemte komponenter, fx et syntetisk medium eller semisyntetisk medium, som produktionsmedium. Derved stabiliseres mediet og råmaterialeomkostningerne holdes lavt. Som kulstofkilder ved fremgangsmåden ifølge op-30 findelsen bruger man D-sorbitol som hoved-råmateriale, og derudover kan der tilsættes D-glukose, D-fruktose, D-man-nitol, ætanol, melasse, stivelse, stivelseshydrolysater og lignende organiske forbindelser. Som nitrogenkilde kan man bruge organiske nitrogenholdige forbindelser såsom 35 12 DK 173550 B1 aminosyrer og urinstof, og desuden kan man bruge uorganiske nitrogenholdige forbindelser såsom ammoniumsulfat, ammoniumnitrat, ammoniumacetat, vandig ammoniumkloridopløsning, ammoniumfosfat, ammoniakvand, ammoniakgas og lig-5 nende nitrogenkilder. Desuden kan man foruden de ovennævnte kulstof- og nitrogenkilder tilføre forskellige metaller, vitaminer, aminosyrer, nukleinsyrer, quinoner og lignende-forbindelser som er nødvendige bestanddele af dyrkningsmediet* for at sikre mikroorganismens vækst.

10 Specielt bruger man ifølge opfindelsen med fordel 0,04-0,07% af en eller flere glykoken-aminosyrer som komponent i dyrkningsmediet for at forøge mikroorganismens oxidationsaktivitet. Reaktion mellem det levedygtige antal celler og oxidationshastigheden ved tilsætning af for-15 skellige aminosyrer til mediet samt den tid der behøves til fuldførelse af gæringen når dyrkningen udføres under tilsætning af disse aminosyrer og bruger en ialt 50%s mængde af D-sorbitol fremgår af tabel 2.

20 25 30 35 13 DK 173550 B1

Tabel 2

Antal levedygtige Oxidati- Tidsfor- celler (*108/ml> °nshastig- ned gæring at en ialt 50%s op-

Max. Min. (g/l.t) løsning (t) 5 Glycin 0,78 0,78 6,9 33

Serin- 3,2 3,2 19,8 19,5

Threon-in 2,6 2,6 17,6 20,5

Alanin 4,5 4,5 20,3 18,5

Valin 4,2 1,7 13,7 28 ^ q Leucin 4,9 0,77 12,6 29

Isoleucin 1,9 1,1 15,2 26

Cystin 3,5 0,54 11,7 31

Methionin 3,9 3,9 17,5 22

Tryptofan 3,4 1,9 16,5 24 .J5 Fenylalanin 3,2 0,85 14,0 27

Tyrosin 0,4 0,19 8,2 32

Prolin 3,1 1,5 16,6 24

Asparaginsyre 4,0 4,0 18,0 20,5

Glutaminsyre 4,4 4,4 21,3 18 2Q- Lysin 3,5 1,8 15,1 25

Histidin 1,5 0,26 10,5 28,5

Arginin 3,3 2,2 11,4 30

Asparagin 3,5 3,4 18,3 20

Glutamin 4,6 3,9 20,9 18,5 2g Ammoniumacetat 3,4 1,0 17,7 21

Ingen tilsætning 0,93 0,77 4,4 35 NB: Alle aminosyrer er i L-form.

30 35 DK 173550 B1 14

Som det fremgår af tabel 2 kan antallet af levedygtige celler forøges uden nedsættelse af oxidationshastigheden pr. antal levende celler ved tilsætning af glykogen-aminosyrer såsom glutaminsyre, glutamin, alanin, serin, 5 threonin, asparagin, asparaginsyre og lignende aminosyrer.

Det konstateres desuden at den tid der behøves til udførelse af gæringen kan forkortes når der udføres dyrkning af 50% opløsning ved tilsætning af disse aminosyrer.

Ved udnyttelse af den foreliggende fremgangsmåde 10 er andre dyrkningsbetingelser end de ovenfor beskrevne ikke specielt begrænsede. Dvs. at dyrkningstemperaturen generelt er 15-45°C, fortrinsvis 25-40°C. Dyrkningsmediets pH-værdi er i almindelighed 3,0-3,8 og fortrinsvis 3,5- 6,5. Dyrkningstiden er i almindelighed 10-100 timer, 15 navnlig 15-40 timer.

Opfindelsen angår også et apparat til udøvelse af den foran beskrevne fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose.

Apparatet til fremstilling af L-sorbose ifølge 20 opfindelsen er forsynet med en dyrkningstank til dyrkning af mikrooranisrnen, udstyret med en omrører, en gasindgang i tankens nedre del og en ventilations-gasudgang i tankens øvre del, 25 et substrat-tilførselsorgan til tilførsel af et dyrkningssubstrat (D-sorbitol) til dyrkningstanken, et tilførselsorgan for oxygen, omfattende en lagertank for flydende oxygen og en evaporator til forsyning af dyrkningstanken med en dyrknings-afgangsgas som er ble-30 vet beriget med oxygengas, en detektor for koncentration af opløst oxygen til detektering af opløst oxygen i en dyrkningsvæske i dyrkningstanken og afgivelse af et signal om koncentrationen af opløst oxygen, 35 et kontrolorgan for opløst oxygen til kontrol af tilførslen af opløst oxygen ved detektering af nævnte signal om koncentration af opløst oxygen, 15 DK 173550 B1 et kuldioxidgas-måleorgan til måling a£ partialtrykket af kuldioxidgas i en dyrknings-afgangsgas som går til et afgangsgasrør fra dyrkningstanken, et afgangsgas-frigivelsesorgan til frigivelse af 5 en del af dyrknings-afgangsgassen ud af systemet ved detektering af partialtrykket af kuldioxidgassen, en ledning til cirkulering af resten af dyrkningsafgangsgassen til .dyrkningstankens gasindgang, og et lufttilførselsorgan til forsyning af dyrknings-10 tanken med luft.

I dyrkningsapparatet ifølge opfindelsen bruges der en sensor for opløst oxygen, fx bestående af Galvanis oxygenelektrode som er en detektor for koncentration af opløst oxygen i en dyrkningsvæske i dyrkningstanken, og 15 strømmen gennem en luftstrømningsventil eller en oxygen-gas-kontrolventil styres i overensstemmelse med det signal om koncentrationen af opløst oxygen gennem kontrolorganet for opløst oxygen, der modtager detektionssignalet fra sensoren for opløst oxygen. Derved styres koncentra-20 tionen af opløst oxygen i dyrkningsvæsken til de korrekte betingelser, dvs. til 0,7 ppm eller derover, fortrinsvis 1-4 ppm.

Endvidere udføres tilførsel af dyrkningssubstrat (D-sorbitol) til dyrkningstanken ved at det kontinuer-25 ligt eller intermitterende tilsættes i overensstemmelse med en tilførselshastighed for oxygen til dyrkningstanken under og efter mikroorganismens vækstfase, og således at man forhindrer at koncentrationen af D-sorbitol i dyrkningsvæsken går op over 5%, hvorved det opnås at en stor 30 mængde D-sorbitol oxideres til L-sorbose på kort tid.

Apparatet ifølge opfindelsen økonomiserer endvidere med resourcerne ved at genvinde afgangsgassen med forhøjet partialtryk af oxygen ved hjælp af en kompressor til cirkulering og genanvendelse. For at optimere partialtrykket 35 af kuldioxidgas i den cirkulerende afgangsgas er der indskudt et apparat til måling af kuldioxidgassens partialtryk, fx et analyseapparat for infrarød absorption eller 16 DK 173550 B1 et lignende apparat, indskudt i afgangsgassens vej. I overensstemmelse med det partialtryk af kuldioxidgas, der måles med måleapparatet, frigives en passende mængde afgangsgas fra systemet ved styring af strømmen gennem en luftaf-5 givelsesventil indskudt i recirkulationssystemet for af- . gangsgassen, hvorved partialtrykket af kuldioxidgas i den afgangsgas som faktisk recirkuleres til dyrkningstanken kontrolleres til en passende værdi (10% og derunder).

- · ► %

Ved den foreliggende opfindelse forenkles apparatet og 10 driften ved at man udnytter bortledning af en del af afgangsgassen til atmosfæren i stedet for at bruge en adsorbent som man gør i konventionelle apparater til fjernelse af kuldioxidgas.

I apparatet ifølge opfindelsen måles partialtrykket 15 af oxygengas i afgangsgassen ved hjælp af et måleapparat for partialtrykket af oxygengas, fx bestående af en zirkoniaanalysator, mens partialtrykket af oxygen ved indgangen til dyrkningstanken beregnes ud fra både strømningshastighed for cirkulationsgassen og tilførselshastigheden 20 for frisk luft til bestemmelse af oxygenforbrug. Derefter anslås den mængde substrat som skal oxideres ud fra oxygenforbruget.

En foretrukken udførelses form for apparatet ifølge opfindelsen er vist i fig. 5, der viser et principskema for en fore-25 trukken udførelsesform for dyrkningsapparatet ifølge opfindelsen.

Apparatet ifølge opfindelsen har en tank 1 til dyrkning af mikroorganismer, et tilførselsorgan 2 til tilførsel af dyrkningssubstrat (D-sorbitol) til dyrkningstanken 1, et 30 tilførselssystem 3 til tilførsel af oxygen blandet med en afgangsgas fra dyrkningen, et lufttilførselsorgan 4 til forsyning af dyrkningstanken 1 med luft, et gasfrigivelsesorgan 5 til frigivelse af en del af afgangsgassen fra dyrkningstanken 1 fra systemet og en kompressor 6 til cir-35 kulation af afgangsgassen til dyrkningstanken 1.

Inde i dyrkningstanken 1 er der en omrører 7 som drives af en motor. Et gastilførselsrør 8 har en indmun- 17 DK 173550 B1 ding 8a i den nedre del af tanken, og et gasafgangsrør 9 er forbundet med en ventilations-gasudgang 9a i tankens øvre del. Substrat-tilførselsorganet 2 er også forbundet med tankens øvre del via en ledning 10.

5 Substrat-tilførselsorganet 2 omfatter en substrat tank 11, en substrattilførselsventil 12 og en substratfø-depumpe 13 så at der føres dyrkningssubstrat (D-sorbitol) fra substrattanken 11 til dyrkningstanken 1 gennem sub-stratfødeventilen 12, substratfødepumpen 13 og ledningen 10 10. Tilførsel af D-sorbitol udføres ved at den tilføres kontinuerligt eller intermitterende og således at man forhindrer at koncentrationen af D-sorbitol i dyrkningsvæsken går op over 5% under og efter mikroorganismens vækstperiode i dyrkningstanken 1.

15 Forannævnte gasindgangsledning 8 er forbundet med oxygentilførselssystemet 3, der har en lagertank 14 for flydende oxygen, en sikkerhedsventil 15 og en evaporator 16 som er indskudt i en ledning 17, og oxygengas der dannes ved fordampning af flydende oxygen i evaporatoren 16 20 føres til dyrkningstanken 1 under styring af tilførslen ved hjælp af en oxygenkontrolventil 18 også indskudt i ledningen 17. På samme måde er gastilførselsrøret 8 forbundet med lufttilførselsorganet 4 via en ledning 20, og luft føres til dyrkningstanken 1 gennem en kontrolventil 21 for 25 luftstrømmen, indskudt i ledningen 20.

Oxygenkontrolventilen 18 og luftkontrolventilen 21, der styrer tilførslen af oxygengas og luft, styres af et kontrolorgan 23 for opløst oxygen, og dette kontrolorgan 23 modtager et detektionssignal fra en detektor 22 for op-30 løst oxygen, installeret i dyrkningstanken 1. Detektoren 22 for opløst oxygen består fx af en Galvanis oxygenelektrode. Den detekterer koncentrationen af opløst oxygen i dyrkningsvæsken i dyrkningstanken for at afgive et signal om koncentrationen af opløst oxygen til kontrolorga-35 net 23 for opløst oxygen, og åbninger og lukninger af oxygenkontrolventilen 18 og luftkontrolventilen 21 styres af 18 DK 173550 B1 kontrolorganet 23 for opløst oxygen, der har detekteret nævnte signal.

Luft føres fra lufttilførselsorganet 4 til dyrkningstanken 1 så at koncentrationen af opløst oxygen får 5 konstant niveau indtil mikroorganismes vækstfase. Under ·· og efter mikroorganismens vækstfase standses tilførslen af luft og der tilføres oxygengas fra oxygentilførselssystemet til dyrkningstanken 1 således at koncentrationen af opløst oxygen styres til 0,7 ppm eller derover, for-10 trinsvis 1-4 ppm.

Ovennævnte afgangsledning 9 fra dyrkningstanken 1 er forbundet med frigivelsesorganet 5 via en tågeseparator 24 og en ledning 25, og er endvidere forbundet med kompressoren 6 via en ledning 26. Et måleapparat 27 til måling 15 af partialtrykket af oxygen, fx bestående af en zirkonia-analysator, og et måleapparat til måling af partialtrykket af kuldioxidgas, som fx er en infrarød absorptionsanalysator, befinder sig i ledningen 25. Partialtrykket af kuldioxidgas i afgangsgassen detekteres ved hjælp af et apparat 28 20 for partialtrykket af kuldioxidgas, og et signal fra denne detektor føres til et kontrolorgan 29 for kuldioxid-partialtryk. En gasafgangsventil 30 i gasfrigivelsesorganet 5 styres af kontrolorganet 29 til frigivelse ud ad systemet af en del af afgangsgassen fra dyrkningen.

25 På den anden side er kompressoren 6 forbundet med-gastil førselsledningen 8 via en recirkulationsledning 32 som er forsynet med en luftnings-cirkulationsventil 31. Den del af afgangsgasen fra dyrkningstanken, der ikke frigives til atmosfæren via gasfrigivelsessystemet 5, cirkuleres 30 ved hjælp af kompressoren 6 til recirkulering af den til dyrkningstanken 1 gennem gastilførselsledningen 8 under styring af strømningshastigheden ved hjælp af luftningscirkulationsventilen 31. Denne afgangsgas cirkuleres og genbruges sammen med tilførsel af ren oxygengas under og 35 efter mikroorganismens vækstfase. På denne måde føres der til dyrkningstanken 1 en oxygenberiget gas som er en blanding 19 DK 173550 B1 af rent oxygen og den recirkulerede del af afgangsgassen fra tanken.

Driften af det beskrevne apparat skal nu forklares.

(a) Luft føres fra lufttilførselsorganet 4 til dyrk- 5 ningstanken 1 under styring af åbningen af strømningskontrolventilen 21 ved hjælp af kontrolorganet 23 for opløst oxygen på en sådan måde at koncentrationen af opløst oxygen i ’dyrkningsvæsken i dyrkningstanken 1 antager et forudbestemt konstant niveau. På det tidspunkt, fx når den 10 indledende koncentration af substratet (D-sorbitol) er 20%, styres lufttilførslen til dyrkningstanken på en sådan måde at koncentrationen af opløst oxygen bliver 2 ppm.

(b) Tilførsel af substrat fra substrattanken 11 går i gang på det tidspunkt hvor et oxygenforbrug svarende til 15 oxidering af 15% af substratkoncentrationen er beregnet af apparatet 27 til måling af partialtrykket af oxygen i ledningen 25.

(c) Når hastigheden af luftstrømmen fra lufttilførselsorganet 4 til dyrkningstanken 1 når op på et maximum og 20 koncentrationen af opløst oxygen ikke kan opretholdes på det forudbestemte niveau, åbnes oXygenkontrolventilen 18 af kontrolorganet 23 for opløst oxygen for at sikre tilførsel af oxygengas til tanken 1.

(d) Straks efter at styringen af koncentrationen af op-25 løst oxygen ved hjælp af oxygengas går igang, åbnes luftnings-cirkulationsventilen 31 og kompressoren 6 sættes i-gang til recirkulation af afgangsgas til dyrkningstanken 1, mens luftkontrolventilen 21 lukkes. Derefter opretholdes koncentrationen af opløst oxygen udelukkende ved 30 hjælp af oxygengas.

(e) Når cirkulationen af afgangsgassen er gået igang, akkumuleres kuldioxidgas i den fra tanken gennem ledningen 9 afgående gas. Partialtrykket af kuldioxidgas i afgangsgassen måles ved hjælp af måleorganet 28, og 35 derpå åbnes afgangsventilen 30 af kontrolorganet 29 for partialtrykket af kuldioxidgas til frigivelse af en del af afgangsgasen til atmosfæren og opretholde et partial- 20 DK 173550 B1 tryk af kuldioxid i den recirkulerede gas på under en forudbestemt værdi (10%) - (f) Når den forudbestemte mængde substrat (D-sorbitol) er indført i dyrkningstanken 1, stoppes tilførslen.

5 (g) Når gæringsprocessen i dyrkningstanken 1 nærmer sig sin afslutning, går den mængde oxygen ned, som behøves. Følgelig standses indstrømningen af oxygen i dyrkningstanken 1 og kompressoren 6 standses. Desuden standses indstrømningen af afgangsgas i dyrkningstanken 1 ved at 10 recirkulationsventilen 31 lukkes og lufttilførslen fra lufttilførselsorganet 4 genåbnes.

(h) Koncentrationen af opløst oxygen i dyrkningstanken 1 stiger hurtigt i kraft af denne luftning, hvorved oxygenets partialtryk også stiger. Gæringen fuldføres når 15 partialtrykket af oxygen i afgangsgassen når op på en forudbestemt værdi (20%).

De følgende eksempler belyser fremgangsmåden ifølge opfindelsen mere udførligt. I disse eksempler er der anvendt et apparat som vist i fig. 5 og beskrevet foran.

20

Eksempel 1

Gluconobacter suboxydans IFO 3254 podedes i 10 liter af et dyrkningsmedium indeholdende 20% D-sorbitol, 25 0,2% natriumglutamat, 0,018% kalciumkarbonat, 0,003% nikotinamid, 0,003% kalciumpantothenat, 0,0001% vitamin B2, 0,0001% p-aminobenzoesyre, 0,047% kaliumdihydrogenfosfat,. 0,03% gærekstrakt, 0,01% magnesiumsulfat, 0,00015% ferro-sulfat, 0,00001% mangansulfat og 0,0005% actocol, og der 2Q inkuberedes ved 30°C i 24 timer. Denne kultur overførtes som udsædskultur til 49 liter dyrkningsmedium indeholdende 20% D-sorbitol, 0,06% ammoniumacetat, 0,102% natriumglutamat, 0,06% kalciumkarbonat, 0,006% nikotinamid, 0,0005% kalciumpantothenat, 0,0002% vitamin B2, 0,00002% 35 p-aminobenzoesyre, 0,04% kaliumdihydrogenfosfat, 0,02% magnesiumsulfat, 0,0003% ferrosulfat og 0,0002% mangansulfat.

21 DK 173550 B1

Der inkuberedes ved 30°C og efter dyrkningens begyndelse holdtes luftningen fra lufttilførselsorganet 4 inden for området 0,1-0,6 rrm (rumfang pr. rumfang pr. minut) og trykket i dyrkningstanken inden for området 0,1-5 1,8 kg/cm2G så at koncentrationen af opløst oxygen hold tes inden for området 2,5+0,5 ppm. Da den maximale grad af luftning var nået op på 0,6 rrm og trykket i tanken på 1,8 kg/cm G indførtes oxygengas dannet ved fordampning af flydende*oxygen i oxygentilførselsorganet 3 gennem gas-10 tilførselsledningen 8 og bobledes herfra op gennem dyrkningstanken 1 på en sådan måde at koncentrationen af opløst oxygen blev 2,5+0,5 ppm. Samtidig standsedes tilførslen af luft fra organet 4 og kompressoren 6 blev sat igang til opsamling af den fra tanken afgående gas. Afgangsgassen 15 recirkuleredes til dyrkningstanken 1. Derefter blev en del af den cirkulerende luft (0,03 rrm) frigivet til atmosfæren gennem frigivelsesorganet 5 for afgangsgas, for at forhindre akkumulering af kuldioxidgas. Koncentrationen af opløst oxygen opretholdtes ved indbobling af 20 oxygengas. Da mængden af luft var utilstrækkelig til at opretholde det indre tryk i tanken, blev der suppleret med luft· På den anden side blev tilførsel af D-sorbitol til erstatning for D-sorbitol oxideret med dyrkningens fremad-25 skriden, sat igang gennem substrattilførselsorganet 2 til dyrkningstanken 1 på et tidspunkt da koncentrationen af D-sorbitol i dyrknings væsken blev 5%, og dyrkningen udførtes med tilsætning af 51 liter 6 0 vægt%s vandig D-sorbi-tolopløsning i 20 timer ialt.

30 På denne dyrkningsmåde var det muligt at udføre dyrkningen med en tilførsel af en samlet mængde på 50% v/r (vægt/rumfang, dvs. forhold mellem enheder af væske og enheder af fast stof som mellem gram og ml) D-sorbitol i den samlede portion gæret på 20 timer, og L-sorbose blev ak-35 kumuleret i et udbytte på 95%, regnet på mængden af D-sorbitol.

22 DK 173550 B1

Eksempel 2

Gluconobacter suboxydans IFO 3254 podedes i 10 liter af et dyrkningsmedium indeholdende 20% D-sorbitol, 5 0,2% natriumglutamat, 0,018% kalciumkarbonat, 0,003% niko tinamid, 0,003% kalciumpantothenat, 0,0001% vitamin Bj, 0,0001% p-aminobenzoesyre, 0,047% kaliumdihydrogenfos-fat, 0,03% gærekstrakt, 0,01% magnesiumsulfat, 0,00015% ferros-ulfati, 0,00001% mangansulfat og 0,0005% actocol og « _ 1 q der inkuberedes ved 30°C i 24 timer. Den således dannede kultur overførtes som udsædskultur til 54 liter dyrkningsmedium indeholdende 25% D-sorbitol, 0,08% ammoniumacetat, 0,067% alanin, 0,06% kalciumkarbonat, 0,006% nikotinamid, 0,0005% kalciumpantothenat, 0,0002% vitamin E^, 15 0,00002% p-aminobenzoesyre, 0,04% kaliumdihydrogenfosfat, 0,02% magnesiumsulfat, 0,0003% ferrosulfat og 0,00002% mangansulfat.

Der inkuberedes ved 30°C og efter dyrkningens begyndelse styredes mængden af luft fra lufttilførselsorga-20 net 4 til området 0,1-0,6 rrm og trykket i tanken til 0,1- 1,8 kg/cm^G, hvorved koncentrationen af opløst oxygen blev 2,5+0,5 ppm. Efter at maximumsgraden af luftning " 2 havde nået 0,6 rrm og det indre tryk i tanken 1,8 kg/cm G, bobledes der oxygengas dannet ved fordampning af 25 flydende oxygen i oxygentilførselsorganet 3 gennem gasindgangsledningen 8 og dens indmunding 8a gennem dyrkningstanken således at koncentrationen af opløst oxygen holdtes på 2,5+0,5 ppm. Samtidig standsedes lufttilførslen fra kilden 4 og kompressoren 6 blev sat igang for at op-2Q samle gas der afgik fra tanken gennem ledningen 9; Afgangsgassen recirkuleredes til dyrkningstanken 1. Derefter blev en del af den cirkulerende luft (0,03 rrm) frigivet til atmosfæren gennem afgangsgas-frigivelsesorganet 5 for at forhindre kuldioxid i at akkumulere sig i denne af-gangsgas. Koncentrationen af opløst oxygen opretholdtes ved gennembobling af oxygengas. Da luftmængden var utilstrækkelig til at opretholde det interne tryk, supplere- 23 DK 173550 B1 des der med luft.

På den anden side blev D-sorbitol som var oxideret ved dyrkningens fremadskriden remplaceret ved tilsætning af D-sorbitol fra substrat-tilførselsorganet 2 til dyrk-5 ningstanken 1, idet denne tilførsel begyndte på det tidspunkt hvor koncentrationen af D-sorbitol i dyrkningsvæsken var gået ned på 5%, og dyrkningen fortsattes med tilsætning af 50 liter 60 vægt%s vandig D-sorbitolopløsning i løbet af 'ialt 20 timer.

10 På denne dyrkningsmåde kunne man gennemføre dyrk ning af en portion på 50% v/r D-sorbitol tilført ialt i løbet at de 20 timer som det tog at forgære portionen. L-sor-bose akkumuleredes i et udbytte på 95%, regnet ud fra den tilførte mængde D-sorbitol.

15

Eksempel 3

Gluconobacter suboxydans BL-9 (IFO 14489, FERM BP-1241) podedes i 10 liter dyrkningsmedium indeholdende 2Q 20% D-sorbitol, 0,3% glycerol, 0,2% natriumglutamat, 0,018% kalciumkarbonat, 0,003% nikotinamid, 0,003% kalci-umpantothenat, 0,0001% vitamin Bj, 0,0001% p-aminobenzoe-syre, 0,047% kaliumdihydrogenfosfat, 0,01% magnesiumsulfat, 0,00015% ferrosulfat, 0,00001% mangansulfat og 0,0005% actocol, og der inkuberedes ved 30°C i 24 timer. Denne kultur overførtes som udsædsmedium til 49 liter kulturmedium indeholdende 20% D-sorbitol, 0,05% glutaminsyre, 0,06% ammoniumacetat, 0,102% natriumglutamat, 0,06% kalciumkarbonat, 0,006% nikotinamid, 0,0005% kalciumpanto-2Q thenat, 0,0002% vitamin B2, 0,00002% p-aminobenzoesyre, 0,04% kaliumdihydrogenfosfat, 0,02% magnesiumsulfat, 0,0003% ferrosulfat og 0,00002% mangansulfat.

Der inkuberedes ved 30°C og efter dyrkningens begyndelse styredes luftningsgraden fra lufttilførselsorga-25 net 4 til dyrkningstanken 1 til at være inden for området 0,1-0,6 rrm og trykket i tanken styredes til 0,1 til 1,8 kg/cm G således at koncentrationen af opløst oxygen hold- 24 DK 173550 B1 tes i området 2,5+0,5 ppm. Efter at den maximale grad af luftning havde nået 0,6 rrm og det indre tryk i tanken 2 havde nået 1,8 kg/cm G, indførtes der oxygengas, dannet ved fordampning af flydende oxygen i oxygentilførselsorga-5 net 3, gennem gastilførselsledningen 8 og den bobledes op fra indmundingen 8a gennem dyrkningstanken på en sådan måde at koncentrationen af opløst oxygen blev 2,5+0,5 ppm. Samtidig standsedes luftningen og kompressoren 6 sattes igang til opsamling af den fra tanken 1 afgående gas.

10 Den afgående gas recirkuleredes til dyrkningstanken 1.

En del af den cirkulerende luft (0,03 rrm) blev derefter afgivet til atmosfæren gennem frigivelsesorganet 5 for at forhindre akkumulering af kuldioxidgas. Koncentrationen af opløst oxygen opretholdtes ved at oxygengas fortsat 15 bobledes gennem tanken. Da luftningen ikke var tilstrækkelig til at opretholde det indre tryk i tanken, suppleredes der med luft.

Tilsætning af D-sorbitol fra substrat-tilførselstanken 2 til dyrkningstanken 1 blev sat igang, til rempla-20 cering af oxideret D-sorbitol under dyrkningens fremad-skriden, på det tidspunkt da koncentrationen af D-sorbitol i dyrknings væsken var gået ned til 5%, og dyrkningen udførtes under tilsætning af 51 liter 60 vægt%s vandig D-sorbitolopløsning i løbet af 20 timer ialt.

25 På den beskrevne dyrkningsmetode kunne man gennem føre dyrkningen med en charge på ialt 50% v/r i løbet af de 20 timer, og der akkumuleredes L-sorbose i et udbytte på 97,5%, regnet på mængden af D-sorbitol.

30 Eksempel 4

Gluconobacter suboxydans BL-115 (IFO 14490, FERM BP-1240) podedes i 10 liter dyrkningsmedium indeholdende 20% D-sorbitol, 0,3% glycerol, 0,2% natriumglutamat, 0,018% kalciumkarbonat, 0,003% nikotinamid, 0,003% kal-ciumpantothenat, 0,0001% vitamin B2, 0,0001% p-aminoben-zoesyre, o,047% kaliumdihydrogenfosfat, 0,01% magnesium- 25 DK 173550 B1 : sulfat, 0,00015% ferrosulfat, 0,00001% mangansulfat og 0,0005% actocol, og der inkuberedes ved 30°C i 24 timer. Inkubatet overførtes som udsædsmedium til 54 liter dyrkningsmedium indeholdende 25% D-sorbitol, 0,05% glycerol, 5 0,08% ammoniumacetat, 0,067% alanin, 0,06% kalciumkarbo- .

nat, 0,006% nikotinamid, 0,0005% kalciumpantothenat, 0. 0002% vitamin B2, 0,00002% p-aminobenzoesyre, 0,04% ka-liumdihydrogenfosf at, 0,02% magnesiumsulfat, 0,0003% fer- • · l· rosulfat og 0,00002% mangansulfat.

10 Der inkuberedes ved 30°C, og efter dyrkningens be gyndelse styredes tilførslen af luft fra lufttilførselsorganet 4 til området 0,1 til 0,6 rrm og det indre tryk i dyrkningstanken til 0,1 til 1,8 kg/cm G, således at koncentrationen af opløst oxygen blev 2,5+0,5 ppm.' Efter 15 at den maximale luftningsgrad var nået op på 0,6 rrm og det indre tryk på 1,8 kg/cm G, tilførtes der gennem ledningen 8 oxygengas dannet ved fordampning af flydende oxygen i oxygentilførselsorganet 3, og den bobledes fra ind-mundingen 8a gennem dyrkningstanken 1 således at koncentra-20 tionen af opløst oxygen nåede 2,5+0,5 ppm. Samtidig standsedes luftningen og kompressoren 6 blev sat igang for at opsamle afgangsgas fra udgangen 9a gennem ledningen 9. Afgangsgassen recirkuleredes til dyrkningstanken 1. Derefter blev en del af den cirkulerende gasblanding 25 (0,03 rrm) frigivet til atmosfæren gennem afgangsgas-frigi velsesorganet 5 for at forhindre akkumulering af kuldioxid i den cirkulerende gasblanding. Koncentrationen af opløst oxygen opretholdtes ved gennembobling af oxygengas.

Da mængden af luft var utilstrækkelig til at opretholde 30 det indre tryk i tanken, suppleredes der med luft.

Efterhånden som D-sorbitol blev oxideret med dyrkningens fremadskriden, blev der tilført frisk D-sorbitol fra substratfødeorganet 2 til dyrkningstanken 1, og denne tilførsel begyndte på det tidspunkt hvor koncentrationen 35 af D-sorbitol var gået ned til 5%, hvorefter dyrkningen udførtes under tilsætning af 51 liter 60 vægt%s vandig D- 26 DK 173550 B1 sorbitolopløsning i løbet af ialt 20 timer.

På denne dyrkningsmåde var det muligt at gennemføre dyrkningen med 50% v/r D-sorbitol tilført pr. dyrkningsportion på 20 timer, og der vandtes L-sorbose i et udbyt-5 te på 97,3%, regnet på mængden af D-sorbitol.

10 1 5 20 25 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose ved mikrobiologisk oxidation af D-sorbitol, kendete g-5 n e t ved at man sætter D-sorbitol til en under forgæring værende kulturvæske i en sådan mængde at koncentrationen ikke går op over ca^ 5% ved dyrkningen under og efter vækstfasen af den anvendte mikroorganisme, mens man 10 cirkulerer en med oxygen beriget afgangsgas fra dyrkningen til beherskelse af koncentrationen af opløst oxygen og sender en del af nævnte afgangsgas ud af systemet til beherskelse af partialtrykket af kuldioxidgas i den cirkulerende gas.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved at koncentrationen af D-sorbitol ved dyrkningens indledning er 8-25% og der tilsættes D-sorbitol i en sådan koncentration (mængde) at koncentrationen ikke går op over ca. 5% under og efter den anvendte organismes vækstfase 20 til opnåelse af en endelig charge-tilførsel på 40-60%, hvorhos den med oxygen berigede afgangsgas fra dyrkningen recirkuleres til opretholdelse af en koncentration af opløst oxygen i dyrkningsmediet på ikke under 0,5 ppm og en del af den cirkulerende afgangsgas sendes ud af systemet 2 5 til sikring af,at partialtrykket af kuldioxid i luftningsgassen ikke overstiger 10%.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at der i dyrkningsmediet indgår 0,04-0,07% af en gly-kogenisk aminosyre.

4. Apparat til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1-3 til fremstilling af L-sorbose ved mikrobiologisk oxidation af D-sorbitol, kendetegnet ved, at det har en dyrkningstank (1) til dyrkning af mikroorganis-35 DK 173550 B1 men, udstyret med en omrører (7), en gasindgang (8a) i tankens nedre del og en ventilations-gasudgang (9a) i tankens øvre del, et substrat-tilførselsorgan (2) til tilførsel af 5 substrat til dyrkningstanken, et tilførselssystem (3) for oxygen, omfattende en lagertank (14) for flydende oxygen og en evaporator (16) til forsyning til·dyrkningstanken af en dyrknings-afgangs- »· « V — gas som er bé'riget med oxygengas, 10 en detektor (22) for koncentration af opløst oxy gen til overvågning af opløst oxygen i dyrkningstanken og afgivelse af et signal om koncentrationen af opløst oxygen, et kontrolorgan (23) for opløst oxygen til kontrol 15 af tilførslen af opløst oxygen ved modtagelse af nævnte oxygenkontrolsignal, et kuldioxidgas-måleorgan (28) til måling af partialtrykket af kuldioxidgas i en afgangsgas fra dyrkningen, der føres til et afgangsgasrør fra dyrkningstanken, 20 et afgangsgas-frigivelsesorgan (5) til frigivelse af en del af afgangsgassen fra dyrkningen ved detektering af kuldioxidgassens partialtryk, en ledning (32) til cirkulering af resten af afgangsgassen fra dyrkningen til dyrkningstankens indgang, 25 og et lufttilførselsorgan (4) til tilførsel af luft til dyrkningstanken.

5. Apparat ifølge krav 4, kendetegnet ved at det er et lufttilførselsrør (20) mellem lufttilførsels-30 organet (4) og dyrkningstanken via en luftstrømningskontrolventil, og at luftstrømningskontrolventilen kontrolleres af kontrolorganet (23) for opløst oxygen på en sådan måde at koncentrationen af opløst oxygen styres til konstant niveau ved regulering af luftstrømmen ved hjælp af 35 kontrolorganet for opløst oxygen indtil mikroorganismen har nået vækstfasen.