KR101508007B1 - 엘라스틴 유사 인공세포외 기질에 형성된 3차원 세포 군집체를 이용한 체외독성시험방법 - Google Patents

엘라스틴 유사 인공세포외 기질에 형성된 3차원 세포 군집체를 이용한 체외독성시험방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엘라스틴 유사 인공세포외 기질에 형성된 3차원 세포 군집체를 이용한 체외독성시험방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포-세포간 상호작용을 고려한 체외 독성시험방법으로, 이로 인해 종래의 체외 독성시험보다 실제 체내 독성시험결과와 유사한 결과를 갖는 체외 독성시험방법에 관한 것이다.

Description

엘라스틴 유사 인공세포외 기질에 형성된 3차원 세포 군집체를 이용한 체외독성시험방법{Method of in-vitro toxicity test using 3 dimentional multicellular spheroids formed elastin-like multiblock biopolymers}
본 발명은 엘라스틴 유사 인공세포외 기질에 형성된 3차원 세포 군집체를 이용한 체외독성시험방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포-세포간 상호작용을 고려한 체외 독성시험방법으로, 이로 인해 종래의 체외 독성시험보다 실제 체내 독성시험결과와 유사한 결과를 갖는 체외 독성시험방법에 관한 것이다.
최근 식·의약품 등에 인체 유해가능물질의 혼입 가능성이 증가함에 따라 이들 물질에 대한 안전성 평가에 대한 필요가 절실해지고 있는 상황이다. 하지만 최근 세계적으로 동물복지에 대한 관심이 증대됨에 따라 동물실험이 반드시 수반되어야 하는 연구를 제외한 대부분의 연구에서 동물실험을 지양하고 있는 실정이다. 따라서 동물실험을 대체할 수 있는 체외(in vitro) 모델 개발에 대한 중요성이 대두되고 있다.
특히, 생물학적 제재 및 화학적 제재의 독성 시험의 경우, 동물실험을 제한하는 가장 대표적인 연구분야로 동물 실험을 대체할 수 있는 체외 독성 시험 모델 개발에 대한 중요성이 높아지고 있는 추세이다.
이와 관련하여, 최근의 동물세포의 배양기술을 이용한 생명공학 분야를 크게 셋으로 나누면 첫 번째로 유전자 재조합 세포주를 포함하는 여러 가지 동물세포의 대량배양을 통하여 유용물질을 생산하는 것으로서 여러 가지 항체나 백신，성장 호르몬， 면역조절인자(cytokines), 항생제 등의 의약품을 생산하는 것을 들 수 있다. 동물세포 배양공정은 미생물 배양공정보다 경제적이나 기술적으로 어려움이 크지만 그 생산품의 면역 특성과 부작용 등 약리작용면에서 우수하다고 할 수 있다.
두 번째 분야로는 동물의 세포나 조직 그 자체 생물자원(biomass)을 생산품으로서 이용하는 것으로 우선 골수 이식이나 인공 장기를 개발하여 이식하는 것으로 임상에 적용하는 경우와 다음으로 임상이 아닌 다른 목적，예로 조직의 발생원리나 기능에 대한 연구나 약리의 대사작용 연구 및 독성학적 시험법 등에 이용하는 응용적 분야가 있는 조직공학 (Tissue Engineering) 분야를 들 수 있다.
세 번째로는 위 두 가지의 접목으로 이루어질 수 있는 분야로 유전자 조작에 의하여 특정기능을 개선시킨 세포나 조직을 인체에 이식하는 기술로서 유전자 치료법(gene therapy) 또는 세포 치료법(cellular therapy)을 들 수 있다.
상술한 바와 같이, 동물세포를 배양하여 체외 독성실험을 진행함에 있어서, 종래의 체외 독성시험은 폴리 스티렌(poly styrene)이 코팅된 평면상에서 세포를 배양하여 독성물질을 처리하는 방법을 택하고 있다. 하지만 상기와 같이 배양된 세포의 경우, 소량의 독성 물질 처리에도 배양된 모든 세포표면에 고농도로 노출되어 실제 체내 독성에 비해 높은 독성을 나타낼 수 있는 가능성이 있어, 실제 체내에 미치는 독성보다 높은 독성을 나타내는 문제점이 있었다.
따라서, 좀 더 체내에서 나타나는 독성과 유사한 결과를 얻을 수 있는 체외 독성시험방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 세포-세포간 상호작용을 고려한 체외 독성시험방법으로, 이로 인해 종래의 체외 독성시험보다 실제 체내 독성시험결과와 유사한 결과를 갖는 체외 독성시험방법을 제공하려는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 실제 체내 독성시험결과와 유사한 결과를 갖는 체외 독성시험에 사용될 수 있는 체외 독성시험용 배지를 제공하려는데 목적이 있다.
본 발명은 (1) 엘라스틴 유사 인공세포외 기질(artificial elastin-like extracellular matrix)로 세포배양용기를 코팅하는 단계; (2) 코팅된 세포배양용기에 아세포를 배양하여 3차원 세포군집체를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 3차원 세포군집체에 독성물질을 첨가하여 독성을 측정하는 단계; 를 포함하는 체외 독성시험방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (1) 단계의 엘라스틴 유사 인공 세포외 기질은 하기 일반식 1로 표시되는 것을 사용할 수 있다.
[일반식 1]
TGPG[VGRGD(VGVPG)n]m
(이때, n은 2 ≤ n ≤ 10을 만족하는 정수이며, m은 10 ≤ m ≤ 30을 만족하는 정수임.)
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 (2) 단계의 아세포는 신경아세포, 혈관아세포, 근아세포, 골수아세포, 섬유아세포, 골아세포 및 연골아세포로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (2) 단계의 아세포는 N2a, SH-SY5Y, U937, Sk-Mel, A549, BEAS-2, HepG2, beta-TC, HIT-T15, HEK 293, adult stem cell 및 embryonic stem cell로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계의 독성물질은 무기 금속, 유기 금속, 유기염소계, 유기인계 및 카바마이트계로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계의 독성물질은 퍼플루오로옥타노익 엑시드(PFOA; Perfluorooctanoic Acid), 퍼플루오로옥탄 술포나이트(Perfluorooctane sulfonates; PFOS), 수은, 납, 메칠수은 및 사에칠납으로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (2) 단계의 코팅된 세포배양용기는 Eagle`s Minimum Essential Medium, 글루타민, 소듐 피루빈산(sodium pyruvate), 중탄산나트륨, 페니실린 및 스트렙토마이신을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계의 독성측정은 저해농도(inhibitory concentration; IC50), 세포 apoptosis 측정, 활성화산소 측정 및 cytokine 측정법으로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (1) 단계의 세포배양용기는 0.5 ~ 10 μM 농도의 엘라스틴 유사 인공세포외 기질을 세포배양용기에 코팅한 것을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 엘라스틴 유사 인공세포외 기질로 코팅된 3차원 세포군집체 배양용기; 및 상기 배양용기 상에 배양된 3차원 세포군집체; 를 포함하는 체외 독성시험용 배지를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 엘라스틴 유사 인공세포외 기질은 하기 일반식 1로 표시되는 것을 사용할 수 있다.
[일반식 1]
TGPG[VGRGD(VGVPG)n]m
(이때, n은 2 ≤ n ≤ 10을 만족하는 정수이며, m은 10 ≤ m ≤ 30을 만족하는 정수임.)
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 3차원 세포군집체는 신경아세포, 혈관아세포, 근아세포, 골수아세포, 섬유아세포, 골아세포 및 연골아세포로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함하는 세포주를 배양하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 세포주는 N2a, SH-SY5Y, U937, Sk-Mel, A549, BEAS-2, HepG2, beta-TC, HIT-T15, HEK 293, adult stem cell 및 embryonic stem cell로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 발명의 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM)"은 세포의 외부를 둘러싸고 있는 기질로서, 세포와 세포 사이를 차지하고 있으며, 주로 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 가지는 것을 의미하는 것이다.
또한, 본 발명의 "인공세포외 기질"은 세포의 부착, 이동, 분화 등에 중요한 역할을 하는 세포외 기질을 유전자 클로닝(Gene cloning) 기법을 이용하여 인공적으로 생산한 세포외 기질을 포함할 수 있으며, 엘라스틴 인공 단백질(Elastin mimetic protein)을 기본 구조(back bone)로 인테그린 중재적 상호작용(integrin mediated interaction)에 관여하는 마르기닐 글리실 아스파르트산(Arginyl Glycyl Aspartic acid; Arg-Gly-Asp (RGD)) 모티프(motif)를 포함하고 있는 인공단백질을 의미하는 것이다.
나아가, 본 발명의 "아세포"는 일반적으로 미분화된 세포 또는 여러번 분화하지 않고 왕성히 DNA합성을 행하고 있는 RNA가 풍부한 세포를 의미하는 것이다. 또한, 섬유아세포 등과 같이 분화되어 교원섬유를 합성 및 분비하고 있는 세포도 포함하는 세포를 의미한다.
또한, 본 발명의 "3차원 세포군집체"(3dimension cell cluster)는 3차원으로 세포가 모여있는 형상을 의미하는 것으로, cadherin 및 connexin 등과 같은 간극연접(gap junction) 단백질의 발현으로 인해 세포-세포 상호작용이 발생하여 생체 조직과 유사한 인공적으로 조성된 세포군집체를 의미한다. 2차원 배양세포와 비교했을 때, 3차원 세포군집체는 다층의 세포를 포함하고, 2차원 배양세포는 단층 세포로 3차원 세포군집체가 2차원 배양세포보다 단위면적당 세포 수가 많다.
종래 체외 독성시험은 소량의 독성 물질 처리에도 배양된 모든 세포표면에 고농도로 노출되어 실제 체내 독성효과를 유추하기 어려웠으나, 본 발명은 세포-세포간 상호작용을 고려한 체외 독성시험방법으로, 이를 통해 종래의 체외 독성시험보다 실제 체내 독성시험결과와 유사한 결과를 제공하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일구현예에 따른 체외 독성시험방법을 나타내는 흐름도이다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래의 체외 독성시험의 경우, 소량의 독성 물질 처리에도 배양된 모든 세포표면에 고농도로 노출되어 실제 체내 독성에 비해 높은 독성을 나타낼 수 있는 가능성으로 인해 실제 체내 독성효과를 유추하기 어려운 문제점이 있었다.
이에 본원 발명은 (1) 엘라스틴 유사 인공세포외 기질(artificial elastin-like extracellular matrix)로 세포배양용기를 코팅하는 단계; (2) 코팅된 세포배양용기에 아세포를 배양하여 3차원 세포군집체를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 3차원 세포군집체에 독성물질을 첨가하여 독성을 측정하는 단계; 를 포함하는 체외 독성시험방법을 제공함으로써, 종래 체외 독성시험보다 실제 체내에 미치는 독성과 유사한 결과를 나타내는 체외 독성시험방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일구현예에 따른 체외 독성시험방법을 나타내는 흐름도로서 이를 중심으로 본 발명의 체외 독성시험방법을 설명하면 다음과 같다.
먼저, (1) 단계는 엘라스틴 유사 인공세포외 기질(artificial elastin-like extracellular matrix)로 세포배양용기를 코팅하는 단계이다(S1). 본 발명의 엘라스틴 유사 인공세포외 기질은 세포배양용기에서 배양되는 세포간 결합을 향상시키기 위해 사용되는 것으로, 통상적으로 인공세포외 기질을 생산하는 방법으로 생산된 엘라스틴 유사 인공세포외 기질이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 다중 RGD 소재를 포함하는 엘라스틴 유사 인공세포외 기질을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하기 일반식 1로 표시되는 아미노 서열을 포함하는 엘라스틴 유사 인공세포외 기질일 수 있다.
[일반식 1]
TGPG[VGRGD(VGVPG)n]m
상기 엘라스틴 유사 인공세포외 기질이 상기 일반식 1로 표시되는 아미노 서열을 포함할 경우, 바람직하게는 n은 2 ≤ n ≤ 10을 만족하는 정수이며, m은 10 ≤ m ≤ 30을 만족하는 정수일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 n은 6이며, m은 20일 수 있다.
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 하기 표 1과 같이 약어로 기재하였다.
IUPAC-IUB 명명 약어 IUPAC-IUB 명명 약어 IUPAC-IUB 명명 약어
알라닌 A 글라이신 G 프롤린 P
아르기닌 R 히스티딘 H 세린 S
아스파라긴 N 이소루신 I 트레오닌 T
아스파라긴 D 루신 L 트립토판 Q
시스테인 C 리신 K 티로신 Y
글루탐산 E 메티오닌 M 발린 V
글루타민 Q 페닐알라닌 F
또한, 상기 세포배양용기의 소재는 통상적인 세포배양용기라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 폴리스티렌, 스텐레스스틸, 유리, 및 바이오폴리머로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 소재를 포함하는 것을 사용할 수 있으나 이에 제한하는 것은 않는다. 상기 바이오폴리머는 예를 들면, 셀룰로오스, 키틴, 헤파린, 실크, 폴리스티렌 또는 스텐레스스틸 등을 포함하는 것일 수 있다.
나아가, 상기 세포배양용기의 형상은 통상적인 세포배양용기의 형상이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 샬레(schale), 시험관, 세포배양 플라스크(Cell culture flask) 또는 세포배양 플레이트(Cell culture plate)를 사용할 수 있으나, 이에 제한하는 것을 아니다.
또한, 상기 세포배양용기의 크기는 통상적인 세포배양용기 크기라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 0.32 내지 20 ㎠인 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
나아가, 상기 세포배양용기를 코팅하는 엘라스틴 유사 인공세포외 기질의 양은 통상적으로 세포배양용기 코팅시 첨가하는 기질의 양이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 0.5 ~ 10 μM 농도의 엘라스틴 유사 인공세포외 기질, 더욱 바람직하게는 세포배양용기에 0.5 ~ 10 μM 농도의 엘라스틴 유사 인공세포외 기질을 10 ~ 100 ㎕를 첨가하여 코팅할 수 있다.
상기 엘라스틴 유사 인공세포외 기질 코팅시 사용할 수 있는 용매는 통상적으로 세포배양용기 코팅시 첨가하는 용매라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 인산완충용액(PBS) 또는 물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인산완충용액일 수 있다.
또한, 상기 엘라스틴 유사 인공세포외 기질의 코팅 두께는 통상적으로 세포배양용기 코팅시 사용되는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 0.001 ~ 10 ㎛인 것일 수 있다.
다음으로, (2) 단계는 코팅된 세포배양용기에 아세포를 배양하여 3차원 세포군집체를 형성하는 단계이다(S2). 상기 아세포는 통상적인 세포들로서 독성을 감지할 수 있으며, 배양하여 세포군집체를 형성할 수 있는 것이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 특히 각 기관별(organ) 독성시험 시에는 기관별 유래 세포를 시험에 사용할 수 있다. 하지만, 바람직하게는 신경아세포, 혈관아세포, 근아세포, 골수아세포, 섬유아세포, 골아세포 및 연골아세포로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 신경아세포일 수 있다.
또한, 상기 아세포가 신경아세포일 경우, 바람직하게는 N2a, SH-SY5Y, U937, Sk-Mel, A549, BEAS-2, HepG2, beta-TC, HIT-T15, HEK 293, adult stem cell 및 embryonic stem cell로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 N2a세포일 수 있다.
또한, 상기 세포배양용기에 파종(seeding)되는 아세포의 밀도는 통상적으로 세포배양시 파종되는 세포의 밀도라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 1 × 105 ~ 3 × 104 세포/웰(well)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 × 104 ~ 2.5 × 104 세포/웰(well)일 수 있다.
나아가, 아세포 배양의 조건은 통상적으로 세포배양시 사용되는 온도 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 20 ~ 45 ℃에서 12 내지 240 시간 동안 배양할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 30 ~ 40 ℃에서 24 내지 120 시간 동안 배양할 수 있다.
만약, 20 ℃ 미만에서 배양할 경우, 엘라스틴 유사 세포외 기질의 세포배양액 내로 용해되어 3차원 세포군집체가 잘 형성되지 않는 문제가 발생할 수 있으며, 45℃ 초과 온도에서 배양할 경우, 세포배양에 적절한 환경을 제공하지 못함에 따라 세포의 증식 및 3차원 군집체 형성이 저해되는 문제가 발생할 수 있다.
또한, 형성된 3차원 세포군집체의 평균 직경은 20 ~ 400 ㎛인 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 80 ~ 300 ㎛인 것일 수 있다.
다음, (3) 단계는 상기 3차원 세포군집체에 독성물질을 첨가하여 독성을 측정하는 단계이다(S3). 상기 독성물질은 통상적으로 동물의 체내에서 독성을 나타내는 물질이라면 특별히 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 무기 금속, 유기 금속, 유기염소계, 유기인계 및 카바마이트계로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 물질을 사용할 수 있다.
상기 독성물질이 무기금속 또는 유기금속 물질인 경우, 바람직하게는 퍼플루오로옥타노익 엑시드(PFOA; Perfluorooctanoic Acid), 퍼플루오로옥탄 술포나이트(Perfluorooctane sulfonates; PFOS), 수은, 납, 메칠수은 및 사에칠납으로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 물질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 퍼플루오로옥타노익 엑시드(PFOA; Perfluorooctanoic Acid) 또는 퍼플루오로옥탄 술포나이트(Perfluorooctane sulfonates; PFOS)일 수 있다.
또한, 상기 3차원 세포군집체에 첨가되는 독성물질의 양은 통상적인 세포배지에 독성물질을 첨가하여 독성 측정시험에 사용되는 양이라면 특별히 제한하지 않으나, 보다 바람직하게는 10 ~ 1500 μM을 첨가할 수 있다.
나아가, 상기 독성을 측정하는 방법은 통상적으로 물질의 독성을 측정하는데 사용되는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 저해농도(inhibitory concentration; IC50), 세포 apoptosis 측정, 활성화산소 측정 및 cytokine 측정법으로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 방법으로 측정할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 저해농도(inhibitory concentration; IC50) 측정으로 수행할 수 있다.
상술한 방법에서 사용되는 체외 독성시험용 배지는 엘라스틴 유사 인공세포외 기질로 코팅된 3차원 세포군집체 배양용기; 및 상기 배양용기 상에 배양된 3차원 세포군집체;를 포함한다.
상기 엘라스틴 유사 인공세포외 기질은 세포배양용기에서 배양되는 세포간 결합을 향상시키기 위해 사용되는 것으로, 통상적으로 인공세포외 기질을 생산하는 방법으로 생산된 엘라스틴 유사 인공세포외 기질이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 다중 RGD 소재를 포함하는 엘라스틴 유사 인공세포외 기질을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하기 일반식 1로 표시되는 아미노 서열을 포함하는 엘라스틴 유사 인공세포외 기질일 수 있다.
[일반식 1]
TGPG[VGRGD(VGVPG)n]m
상기 엘라스틴 유사 인공세포외 기질이 상기 일반식 1로 표시되는 아미노 서열을 포함할 경우, 바람직하게는 n은 2 ≤ n ≤ 10을 만족하는 정수이며, m은 10 ≤ m ≤ 30을 만족하는 정수일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 n은 6이며, m은 20일 수 있다.
또한, 상기 배지에 포함되는 엘라스틴 유사 인공세포외 기질의 양은 통상적으로 세포배양용기에 첨가하는 기질의 양이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 0.5 ~ 10 μM 농도의 엘라스틴 유사 인공세포외 기질, 더욱 바람직하게는 세포배양용기에 0.5 ~ 10 μM 농도의 엘라스틴 유사 인공세포외 기질을 10 ~ 100 ㎕를 포함할 수 있다.
나아가, 상기 세포배양용기의 소재는 통상적인 세포배양용기라면 특별히 제한하지 않는다.
또한, 상기 3차원 세포군집체의 평균 직경은 20 ~ 400 ㎛인 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 80 ~ 300 ㎛인 것일 수 있다.
나아가, 상기 3차원 세포군집체는 통상적인 세포들로서 독성을 감지할 수 있으며, 배양하여 세포군집체를 형성할 수 있는 세포주를 배양하여 수득한 것이라면 특별한 제한없이 사용할 수 있으며, 특히 각 기관별(organ) 독성시험 시에는 기관별 유래 세포를 시험에 사용할 수 있다. 바람직하게는 신경아세포, 혈관아세포, 근아세포, 골수아세포, 섬유아세포, 골아세포 및 연골아세포로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함하는 세포주를 배양하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 신경아세포를 배양하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 세포주가 신경아세포일 경우, 바람직하게는 N2a, SH-SY5Y, U937, Sk-Mel, A549, BEAS-2, HepG2, beta-TC, HIT-T15, HEK 293, adult stem cell 및 embryonic stem cell로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 N2a세포일 수 있다.
본 발명의 3차원 세포군집체는 통상의 방법을 사용하여 2차원으로 배양한 배양세포보다 세포-세포간 상호작용을 고려할 수 있어 이를 체외 독성시험에 사용할 경우, 종래의 체외 독성시험보다 실제 체내 독성시험결과와 유사한 결과를 얻을 수 있는 놀라운 장점이 있다(실험예 1 및 2 참조).
또한, 천연적으로 체내 세포외기질을 구성하는 물질은 Collagen type I, IV, Fibronectin, Laminin 등이 있다. 본 발명과 같이 엘라스틴 유사 인공세포외 기질을 코팅하는 것이 아닌 상기와 같은 다른 종류의 기질을 코팅한 세포배양용기를 사용할 경우, 3차원 세포군집체가 형성되지 않는 문제점이 있다. 만일, 상기와 같은 다른 종류의 기질을 코팅한 세포배양용기를 사용하여 3차원 세포군집체가 형성된다 하더라도, 형성되는 3차원 세포군집체의 양이 적어 낮은 효율로 인해 체외 독성시험에 사용하기 힘들 것으로 예상된다.
나아가, 본 발명의 엘라스틴 유사 인공세포외 기질은 엘라스틴 유사 단백질의 소수성(hydrophobic)의 성질로 인해 세포가 바닥에 부착되지 않고 부유상태로 배양이 가능한 장점이 있다. 또한, 엘라스틴 유사 인공세포외 기질이 포함하고 있는 RGD motif와 세포의 인테그린 수용체(integrin receptor)의 결합(binding)을 통해 세포 신호 전달통로를 동시에 자극함으로 세포의 활성도는 높이면서 세포-세포 상호간의 신호전달을 촉진하여 3차원 세포군집체 형성이 촉진되는 장점이 있다.
이하, 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 엘라스틴 유사 인공세포외 기질의 합성 및 세포배양용기 코팅
엘라스틴 유사 인공세포외 기질인 TGPG[VGRGD(VGVPG)6]20의 합성을 위하여 4 올리고핵산염을 마련하였다. 이후 마련된 4 올리고핵산염을 7 펜타팹타이드 VGRGD(VGVPG)6의 단위체 유전자 형성을 위하여, 화학적으로 합성하고 강화하며 바인딩하였다. 즉 복제 단계에서 4 올리고핵산염을 유전자 조작하여 7 펜타팹타이드 VGRGD(VGVPG)6 단위체 유전자를 형성하였다. 이후 유전자 조작한 TGPG[VGRGD(VGVPG)6]20은 조작한 pUC19 플라스미드 내에서 되풀이되는 지향성 결합에 의하여 구성되며, 궁극적으로 조작한 pET-25(+)-1 플라스미드(미국에 소재한 Novagen사 제품)로 복제하였다.
이후 복제가 완료된 TGPG[VGRGD(VGVPG)6]20은 40리터 TB(Terrific Broth) 내에서 세포 성장된 E. coli BLR(DE3)로 표출되는 표출과정을 거쳤다. 상기 표출 이후, PBS(Phosphate-buffered saline; 제조사: 미국에 소재한 Gibco) pH 7.2 안에서 역상전이를 통해 정제한 엘라스틴 유사 인공세포외 기질인 TGPG[VGRGD(VGVPG)6]20를 수득하였다. 이후 엘라스틴 유사 인공세포외 기질인 TGPG[VGRGD(VGVPG)6]20은 REP로 기재하였다.
상기에서 수득한 REP를 인산완충용액(phosphate buffered saline; PBS)에 첨가하여 10μM 농도의 REP 용액을 제조하였다. 이후 96-웰 폴리스티렌 배양용기(well polystyrene plates) 각각에 10μM 농도의 REP 용액 50 ㎕ 씩을 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 이후 배양용기의 상층액은 제거하여 REP로 코팅한 배양용기를 제조하였다.
실시예 2. 3차원 세포군집체 배양
상기 실시예 1에서 제조한 REP로 코팅한 배양용기(이하, 'REP-배양용기')에 N2a 세포(미국 ATCC의 CCL-131 제품)를 5 × 105 세포수/웰의 밀도로 파종(seeding)하였다. 상기 배양용기에서 사용한 세포배양배지는 Eagle`s Minimum Essential Medium(EMEM)에 2 mM의 글루타민, 1 mM의 소듐 피루빈산(sodium pyruvate), 1.5 g/ℓ의 중탄산나트륨, 100 단위/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였다. 이후 N2a 세포가 파종된 REP-배양용기는 37 ℃, 95% 습도 및 5% CO2 환경에서 3일 동안 배양하여 3차원 세포군집체를 수득하였다.
비교예 1. 세포 배양
세포배양용기를 REP로 코팅하지 않은 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 세포를 배양하여 배양세포를 수득하였다.
실험예 1. 독성시험
실시예 1-1: PFOA 독성시험
실시예 2에서 수득한 세포군집체 또는 비교예 1의 배양세포에 5μM, 20μM, 50μM, 100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μM, 600μM, 700μM, 800μM, 900μM, 1,000μM 또는 2,000μM 농도의 퍼플루오로옥타노익 엑시드(PFOA; Perfluorooctanoic Acid, 분자량 414.1 g/mol, 미국 Sigma-Aldrich사 제품 171468-5G, 96%) 용액을 첨가하였다. PFOA 용액을 첨가하고 3시간, 24시간 또는 48시간이 지난 후 세포 카운팅 키트-8(일본 도진도(dojindo)사 제품 CCK-8)을 사용하여 세포증식 어세이를 진행하였다.
상기 PFOA 용액은 디메틸 설폭시화물(dimethyl sulfoxide; DMSO, 미국 Sigma-Aldrich사 제품)에 PFOA를 녹여 최종 농도가 5μM, 20μM, 50μM, 100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μM, 600μM, 700μM, 800μM, 900μM, 1,000μM 또는 2,000μM로 PFOA 용액을 제조하여 사용하였다.
상기 세포증식 어세이는 450 ㎚ 파장에서 amicroplate reader Multiskan(미국 소재 thermo사 제품)로 사용하여 흡광도(OD)를 측정하였다. 이후 TOXCALC 5.0 (미국 소재 Tidepool Scientific Software사 제품)을 사용하여 저해농도(inhibitory concentration; IC50)값을 결정하였다.
PFOA 용액을 첨가하고 3시간, 24시간 또는 48시간 후 상기에서 결정한 IC50값은 하기 표 2에 나타냈다.
하기 IC50는 세포 증식을 50% 저해하는 결과를 보일 때의 독성물질 농도로, 만약 IC50값이 낮으면 적은 양의 독성물질로도 세포 증식을 억제할 수 있는 것이고, 만약 IC50값이 높으면 많은 양의 독성물질을 사용해야 세포 증식을 억제할 수 있는 것이다.
구분 IC50(μM)
3시간 후 24시간 후 48시간 후
실시예 2의 세포군집체(A) 632.15 495.09 423.2
비교예 1의 배양세포(B) 511.19 388.52 309.66
A/B 1.24 1.27 1.37
상기 표 2에서 확인되는 바와 같이, 비교예 1 배양세포에서의 IC50이 실시예 2 세포군집체에서의 IC50보다 약 1.4배 높은 것을 확인할 수 있었으며, 이는 실시예 2의 세포군집체가 비교예 1의 배양세포보다 독성물질에 대해 감수성이 낮아 실시예 2의 세포군집체가 체외 독성시험용으로 더욱 적합한 것을 확인한 결과이다.
실험예 1-2: PFOS 독성시험
실시예 2에서 수득한 세포군집체 또는 비교예 1의 배양세포에 5μM, 20μM, 50μM, 100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μM, 600μM, 700μM, 800μM, 900μM, 1,000μM 또는 2,000μM 농도의 퍼플루오로옥탄 술포나이트(Perfluorooctane sulfonates; PFOS, 분자량 538.2, 미국 Sigma-Aldrich사 제품 77282-10G, ≥98.0 (T)) 용액을 첨가하였다. PFOS 용액을 첨가하고 3시간, 24시간 또는 48시간이 지난 후 세포 카운팅 키트-8(일본 도진도(dojindo)사 제품 CCK-8)을 사용하여 세포증식 어세이를 진행하였다.
상기 PFOS 용액은 디메틸 설폭시화물(dimethyl sulfoxide; DMSO, 미국 Sigma-Aldrich사 제품)에 PFOA를 녹여 최종 농도가 5μM, 20μM, 50μM, 100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μM, 600μM, 700μM, 800μM, 900μM, 1,000μM 또는 2,000μM로 PFOS 용액을 제조하여 사용하였다.
상기 세포증식 어세이는 450 ㎚ 파장에서 amicroplate reader Multiskan(미국 소재 thermo사 제품)로 사용하여 흡광도(OD)를 측정하였다. 이후 TOXCALC 5.0 (미국 소재 Tidepool Scientific Software사 제품)을 사용하여 저해농도(inhibitory concentration; IC50)값을 결정하였다.
PFOS 용액을 첨가하고 3시간, 24시간 또는 48시간 후 상기에서 결정한 IC50값은 하기 표 3에 나타냈다.
구분 IC50(μM)
3시간 후 24시간 후 48시간 후
실시예 2의 세포군집체(A) 471.17 354.7 300.00
비교예 1의 배양세포(B) 195.9 218.75 219.88
A/B 2.41 1.62 1.37
상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 비교예 1 배양세포에서의 IC50이 실시예 2 세포군집체에서의 IC50보다 약 1.4배 내지 2.4배 높은 것을 확인할 수 있었으며, 이는 실시예 2의 세포군집체가 비교예 1의 배양세포보다 독성물질에 대해 감수성이 낮아 실시예 2의 세포군집체가 체외 독성시험용으로 더욱 적합한 것을 확인한 결과이다.
실시예, 비교예 및 실험예를 통해 확인했던 것과 같이, 본원 발명의 체외 독성시험방법은 세포-세포간 상호작용을 고려한 체외 독성시험방법으로, 종래의 체외 독성시험보다 실제 체내 독성시험결과와 유사한 특징을 갖는 체외 독성시험방법을 제공할 수 있다.

Claims (10)

  1. (1) RGD(아르기닌-글라이신-아스파라긴) 및 VGVPG(발린-글라이신-발린-프롤린-글라이신)의 반복적인 융합을 통해 이루어진 엘라스틴 유사 인공세포외 기질(artificial elastin-like extracellular matrix)로 세포배양용기를 코팅하는 단계;
    (2) 코팅된 세포배양용기에 아세포를 배양하여 3차원 세포군집체를 형성하는 단계; 및
    (3) 상기 3차원 세포군집체에 독성물질을 첨가하여 독성을 측정하는 단계;를 포함하고,
    상기 (3) 단계의 독성물질은 퍼플루오로옥타노익 엑시드(PFOA; Perfluorooctanoic Acid), 퍼플루오로옥탄 술포나이트(Perfluorooctane sulfonates; PFOS), 수은, 납, 메칠수은 및 사에칠납으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 독성물질의 체외 독성시험방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 RGD(아르기닌-글라이신-아스파라긴) 및 VGVPG(발린-글라이신-발린-프롤린-글라이신)의 반복적인 융합을 통해 이루어진 엘라스틴 유사 인공세포외 기질은 하기 일반식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 독성물질의 체외 독성시험방법.
    [일반식 1]
    TGPG[VGRGD(VGVPG)n]m
    (이때, n은 2 ≤ n ≤ 10을 만족하는 정수이며, m은 10 ≤ m ≤ 30을 만족하는 정수이며, T는 트레오닌, G는 글라이신, P는 프롤린, V는 발린, R은 아르기닌, D는 아스파라긴을 의미함.)
  3. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 아세포는 신경아세포, 혈관아세포, 근아세포, 골수아세포, 섬유아세포, 골아세포 및 연골아세포로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함하는 독성물질의 체외 독성시험방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 아세포는 N2a, SH-SY5Y, U937, Sk-Mel, A549, BEAS-2, HepG2, beta-TC, HIT-T15, HEK 293, adult stem cell 및 embryonic stem cell로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함하는 독성물질의 체외 독성시험방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계는 0.5 ~ 10 μM 농도의 RGD(아르기닌-글라이신-아스파라긴) 및 VGVPG(발린-글라이신-발린-프롤린-글라이신)의 반복적인 융합을 통해 이루어진 엘라스틴 유사 인공세포외 기질을 세포배양용기에 코팅하는 것을 특징으로 하는 독성물질의 체외 독성시험방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 독성측정은 저해농도(inhibitory concentration; IC50), 세포 apoptosis 측정, 활성화산소 측정 및 cytokine 측정법으로 이루어진 군 중 어느 하나 이상의 방법으로 측정하는 것인 독성물질의 체외 독성시험방법.
  7. 세포의 3차원 군집체가 형성될 수 있도록 RGD(아르기닌-글라이신-아스파라긴) 및 VGVPG(발린-글라이신-발린-프롤린-글라이신)의 반복적인 융합을 통해 이루어진 엘라스틴 유사 인공세포외 기질이 코팅되어 있는 독성물질의 체외 독성시험용 배양용기로서,
    상기 독성물질이 퍼플루오로옥타노익 엑시드(PFOA; Perfluorooctanoic Acid), 퍼플루오로옥탄 술포나이트(Perfluorooctane sulfonates; PFOS), 수은, 납, 메칠수은 및 사에칠납으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 독성물질의 체외 독성시험용 배양 용기.
  8. 제7항에 있어서, 상기 RGD(아르기닌-글라이신-아스파라긴) 및 VGVPG(발린-글라이신-발린-프롤린-글라이신)의 반복적인 융합을 통해 이루어진 엘라스틴 유사 인공세포외 기질은 하기 일반식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 독성물질의 체외 독성시험용 배양 용기.
    [일반식 1]
    TGPG[VGRGD(VGVPG)n]m
    (이때, n은 2 ≤ n ≤ 10을 만족하는 정수이며, m은 10 ≤ m ≤ 30을 만족하는 정수이며, T는 트레오닌, G는 글라이신, P는 프롤린, V는 발린, R은 아르기닌, D는 아스파라긴을 의미함.)
  9. 제7항에 있어서, 상기 3차원 세포군집체는 신경아세포, 혈관아세포, 근아세포, 골수아세포, 섬유아세포, 골아세포 및 연골아세포로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함하는 세포주를 배양하여 제조된 것을 특징으로 하는 독성물질의 체외 독성시험용 배양 용기.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포주는 N2a, SH-SY5Y, U937, Sk-Mel, A549, BEAS-2, HepG2, beta-TC, HIT-T15, HEK 293, adult stem cell 및 embryonic stem cell로 구성된 군 중 어느 1종 이상을 포함하는 세포주를 배양하여 제조된 것을 특징으로 하는 독성물질의 체외 독성시험용 배양 용기.
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