DE2241258B2

DE2241258B2 - Kontinuierliches verfahren zur umwandlung von methan in eiweisstoffe durch kontinuierliche kultivierung von methan verwertenden mikroorganismen

Info

Publication number: DE2241258B2
Application number: DE19722241258
Authority: DE
Inventors: Francis East Molesey Surrey Moran (Großbritannien); Myers, Philip Albert, Rambouillet (Frankreich)
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1971-08-24
Filing date: 1972-08-22
Publication date: 1978-02-02
Also published as: AT315109B; AU461750B2; DE2241258A1; NL7211549A; US3816252A; RO61625A; IT1056025B; JPS4828683A; AU4578672A; HU167418B; DE2241258C3; ES406391A1; BE787963A; GB1397735A

Description

Die Erfindung betrifft ein kontinuierliches Verfahren zur Umwandlung von Methan in Eiweißstoffe durch kontinuierliche Kultivierung von Methan verwertenden Mikroorganismen.

Für die Herstellung von Mikroorganismenzcllen wurden bereits Verfahren beschrieben, bei denen Mikroorganismen, die Methan verwerten, in einem wäßrigen Kulturmedium, das Nährsalze enthält, in Gegenwart von Methan und eines Gases, das freien Sauerstoff enthält, kultiviert werden. Bei diesen Verfahren werden Nitrate, Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat, oder Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd als Stickstoffquelle verwendet.

Aus der FR-OS 20 16 899 ist ein kontinuierliches Verfahren zur Umwandlung von Methan in ein Eiweißstoffe enthaltendes Zellmaterial bekannt, bei welchem ein pH zwischen ungefähr 6,0 und 7,5 und eine NH4 ⁺ -Konzentration innerhalb von ungefähr 100 mg und 5000 mg pro Liter aufrechterhalten wird.

Es wurde nun gefunden, daß bei kontinuierlichen Verfahren die Verwendung von Ammoniumionen als Stickstoffquelle zu einer Verlangsamung der Wachstumsgeschwindigkeit von Methan verwertenden Mikroorganismen führt, was schließlich das Verschwinden des Mikroorganismus zur Folge hat, wenn nicht die nachstehend beschriebenen, von der Anmelderin entwickelten Maßnahmen ergriffen werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein kontinuierliches Verfahren zur Umwandlung von Methan in Eiweißstol fe durch kontinuierliche Kultivierung von Methai verwertenden Mikroorganismen in einem wäßrige Kulturmedium, das Nährsalze und Ammoniumione enthält und dem ein wäßriges Nährmedium zugesetz wird, in Gegenwart von Methan und eines freiei Sauerstoff enthaltenden Gases, das dadurch gekenn zeichnet ist, daß man den pH-Wert des Kulturmedium im Bereich von 4,5 bis 8,0 und die Ammoniumionenkon zentration im Kulturmedium im Bereich von 2 bis 80 mg vorzugsweise 2 bis 50 mg pro Liter und die Produktions geschwindigkeit unter stationären Bedingungen be wenigstens 0,81 g (Trockengewicht) Mikroorgjnismu pro Liter und Stunde hält.

Dem Verfahren gemäß der Erfindung liegt dii Feststellung zugrunde, daß bei der kontinuierliche! Kultivierung mit hohen Produktionsgeschwindigkeiter beispielsweise im Bereich von 0,81 bis 5,0 g (Trockenge wicht) Mikroorganismus pro Liter und Stunde, dl· maximale Ammoniumionenkonzentration, die Methai verwertende Mikroorganismen im Kulturmedium tole rieren können, etwa 100 mg/1 beträgt. Es wurdi gefunden, daß bei Verfahren zur kontinuierlichei Kultivierung von Methan verwertenden Mikroorganis men bei gegebenen Verdünnungsraten die Anwesenhei von Ammoniumionen oberhalb bestimmter entschei dend wichtiger Konzentrationen im Kulturmedium ein< solche Erniedrigung der spezifischen Wachstumsge schwindigkeit zur Folge hat, daß die Kultur zurr

jo Verschwinden gebracht wird und der technische Erfolg ausbleibt.

Die Menge der Ammoniumionen wird im Bereich vor 2 bis 80 mg/1 gehalten. Man ist der Ansicht, dai. unterhalb von 2 mg/1 das Wachstum durch Mangel ar Ammoniakstickstoff begrenzt ist. Bei der Durchführung des Verfahrens wird der größte Teil der Ammoniumio nen, die dem wäßrigen Kulturmedium vorzugsweise all Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd zugesetzt wer den, unmittelbar durch die Mikroorganismen verwertet Die verbleibenden Ammoniumionen werden danr innerhalb des angegebenen Bereichs gehalten. In dei Praxis wird das Verfahren gewöhnlich bei einei Ammoniumionenkonzentration von etwa 10 bis 30 mg/ durchgeführt.

Die Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium kann durch Entnahme von Proben des Kulturmedi ums in bestimmten Abständen und anschließende quantitative chemische Bestimmung der Ammoniumionen ermittelt werden. Beispielsweise werden geeignete

so kolorimetrische Methoden auf der Grundlage dei Nesslerisierung von J. Paul (1958) in Analyst, 83 Seiten 37-42, und G. G. M e y η e 11 und E. M e y η e 1 (1965), Theory and Practice in Experimental Bacteriology, Cambridge University Press, beschrieben. Es ist auch möglich, eine Sonde, vorzugsweise eine »Ammoniaksonde«, in Kombination mit einem pH-Meßgerät zur kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Bestimmung der Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium zu verwenden.

Die Ammoniumionen werden vorzugsweise durch Zusatz von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd zum Kulturmedium eingeführt.

Das Verfahren kann zweckmäßig nach einer der folgenden Methoden durchgeführt werden:

a) Der pH-Wert des dem Kulturmedium zugesetzten wäßrigen Nährmediums wird so gewählt, daß zur Regelung der hiernach erhaltenen Wasserstoffio-

nenkonzentration im Kulturmedium innerhalb des pH-Bereichs von 4,5 bis 8,0 die Anwesenheit von nicht mehr als 80 mg Ammoniumionen/I erforderlich is L

b) Der pH-Wert des Kulturmediums wird durch Zusatz von Säure oder Alkali mit Ausnahme von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd im Bereich von 4,5 bis 8,0 und die Ammoniumkonzentration in Abhängigkeit von durch Apparaturen bestimmten Werten der Ammoniumkonzentration im Kulturmedium im Bereich von 2 bis 80 mg/1 gehalten.

Wenn Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd sowohl als Stickstoffquelle als auch als einziges Mittel zur Regelung des pH-Wertes des Kulturmediums nach der vorstehend beschriebenen Methode (a) verwendet wird, muß das dem Kulturmedium zugesetzte wäßrige Nährmedium einen pH-Wert von weniger als 7,5 haben, wobei der pH-Wert so weit unter dem pH-Wert des Kulturmediums liegen muß, daß eine solche Wasser-Stoffionenkonzentration im Kulturmedium erhalten wird, daß die Menge von Ammoniumionen, die zu jedem gegebenen Augenblick zur Einstellung des pH-Werts erforderlich ist, nicht über 80 mg/1 liegt.

Der pH-Wert des wäßrigen Nährmediums liegt gewöhnlich im Bereich von 1,0 bis 7,5 und für die meisten praktischen Zwecke im Bereich von 2,0 bis 3,5.

Das wäßrige Nährmedium kann aus beliebigen bekannten Medien, die für Fermentationen unter Verwendung von Methan als Kohlenstoffquelle verwen- jo det werden und aus denen die Stickstoffquelle teilweise oder ganz weggelassen worden ist, ausgewählt werden oder darauf basieren. Die Menge jedes Nährstoffs muß so eingestellt werden, daß gewährleistet ist, daß das Medium unbegrenztes Wachstum des Mikroorganismus Vi mit der gewünschten in der Erfindungsdefinition angegebenen Geschwindigkeit ermöglicht.

Der natürliche pH-Wert des Nährmediums hängt von der Zusammensetzung der Nahrsalzs ab und kann für die Zwecke der Erfindung zu hoch oder zu niedrig sein. Demzufolge kann eine Säure oder ein Alkali zur Einstellung des gewünschten pH-Wertes des Nährmediums erforderlich sein. Der pH-Wert eines Nährmediums, das Natrium- und/oder Kaliumphosphatsalze als Phosphatquelle enthält, kann zu hoch sein, so daß der Zusatz einer Säure, z. B. Schwefelsäure oder Phosphorsäure, notwendig ist. Andererseits kann der pH-Wert eines Nährmediums, das Phosphorsäure als Phosphatquelle enthält, zu niedrig sein, so daß der Zusatz von Alkali, z. B. von Natriumhydroxyd, erforderlich sein kann. Der erforderliche pH-Wert des Nährmediums hängt von der Zelldichte und vom pH-Wert ab, bei dem die Fermentation durchgeführt werden soll. Die Zelldichte kann beispielsweise abhängig sein von der Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeit, wobei Sauerstoff der begrenzende Nährstoff bei einer gegebenen Verdünnungsrate ist, oder von der Methanübertragungsgeschwindigkeit, wobei Methan der begrenzende Nährstoff ist. Der erforderliche genaue pH-Wert kann empirisch durch einfache Versuche für jede bestimmt.· bo Kombination von Fermentationsbedingungen bestimmt werden.

Zweckmäßig kann Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd dem Kulturmedium in Abhängigkeit von einer automatischen Titrationsapparatur zugesetzt werden. Diese Apparatur ist mit einer Elektrode zur Messung der pH-Wertänderung im Kulturmedium und Mitteln zum Zusatz von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd zum Kulturmedium in Abhängigkeit von diesen Änderungen versehen, so daß ein gewünschter pH-Wert während der Fermentation aufrechterhalten wird.

Die in dieser Weise zugesetzte Ammoniak- oder Ammoniumhydroxydmenge entspricht der Summe der Menge von Ammoniumionen, die für unbegrenztes Wachstum des Mikroorganismus erforderlich ist, und der Menge, die zur Regelung des pH-Wertes durch Neutralisation der überschüssigen Wasserstoffionen, die aus dem wäßrigen Nährmedium stammen, das dem Kulturmedium als Nährstoff zugesetzt wird, erforderlich ist.

Es kann auch nach der Methode (b) gearbeitet werden. Bei dieser Methode wird der pH-Wert des Kulturmediums durch Zusatz einer Säure oder eines Alkalis mit Ausnahme von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd im Bereich von 4,5 bis 8,0 und die Ammoniumionenkonzentration des Nährmediums vorzugsweise durch Zusatz von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd in Abhängigkeit von der Anzeige der Apparatur zur Bestimmung der Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium im Bereich von 2 bis 80 mg/1 gehalten. Die Ammoniumionenkonzentration des Nährmediums kann nach den vorstehend beschriebenen Methoden bestimmt werden.

Als Alkali, das mit Ausnahme von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd zur Regelung des pH-Wertes des Kulturmediums verwendet wird, eignen sich Alkalihydroxyde, z. B. Natriumhydroxyd. Als Säuren eignen sich beispielsweise Schwefelsäure und Phosphorsäure.

Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise erleichtert die Verwendung eines wäßrigen Nährmediums, das einen beliebigen pH-Wert hat, jedoch wird ein Medium mit einem pH-Wert unter 4,0 bevorzugt, um die Mineralsalze in Lösung zu halten. Bei Durchführung des Verfahrens nach einer der vorstehend beschriebenen Methoden liegt die obere Grenze des pH-Wertes des Kulturmediums zweckmäßig bei 7,5, vorzugsweise im Bereich von 5,0 bis 7,0.

Die Arbeitstemperatur kann im Bereich von 30 bis 48°C liegen. Bei Verwendung von Methylococcus capsulatus wird vorzugsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 7,0 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 42 bis 48°C gearbeitet.

Das Verfahren wird normalerweise bei Normaldruck durchgeführt, jedoch kann auch bei Drücken bis etwa 3,5 atü gearbeitet werden.

Normalerweise sollte bei Verwendung von Luft-Methan-Gemischen der Sauerstoffgehalt etwa 10 bis 19%, vorzugsweise etwa 16 bis 18 Vol.-°/o, und der Methangehalt etwa 10 bis 50%, vorzugsweise 15 bis 25 Vol.-%, betragen. Das Methan kann in methanhaltigen Gasen, z. B. Erdgas, vorhanden sein. Mit Sauerstoff angereicherte Gase, z. B. mit Sauerstoff angereicherte Luft, können verwendet werden.

Die Bedingungen, unter denen das Verfahren durchgeführt werden kann, sind selektiv für Mikroorganismen, die Methan verwerten. Es ist nicht notwendig, die Fermentation aseptisch durchzuführen. Hauptsächlich aus wirtschaftlichen Gründen wird nichtkeimfreies Arbeiten bevorzugt.

Die Mikroorganismen können vom Kulturmedium nach bekannten Verfahren, z. B. durch Zentrifugieren und/oder Filtration, die mit einer Ausflockungsstufe kombiniert werden können, abgetrennt werden.

Die Methan verwertenden Mikroorganismen können unter Anwendung beliebiger bekannter Isoliermethoden für diesen Typ von Mikroorganismen erhalten

werden. Geeignete Methoden werden von S h e e h a n und Johnson in »Applied Microbiology« 21, Nr. 3, 1971, Seiten 511—515, und von Whittenbury in Journal of General Microbiology 1970, 61, Seiten 205—218, beschrieben. Bevorzugt al:; Bakterium wird Methylococcus capsulatus. Methan verwertende Mikroorganismen sind auch durch öffentliche Hinterlegungsstellen für Mikroorganismen erhältlich (vgl. zum Beispiel DT-OS 19 18 705).

Beispiel 1
Stufe A

Methode zur Gewinnung einer Kultur
von Methan verwertenden Bakterien
für die Verwendung beim Verfahren

Jeweils 500 ml einer Aufschlämmung von methanhaltigem Schlamm aus stillstehenden Becken wurden in Abständen von einem Tag während einer Zeit von 5 Tagen zu einem belüfteten und gerührten Fermenter gegeben, der ein Arbeitsvolumen von 3,0 1 hatte und 3,0 1 eines wäßrigen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt:

10

KH₂PO₄

Na₂HPO₄-12 H₂O
NaNO₃
MgSO₄-7 H₂O
FeSO₄ -7 H₂O
Ca(NO₃)₂-4 H₂O
CuSO₄-5 H₂O
ZnSO₄-7 H₂O
MnSO₄ H₂O
Na₂MoO₄-2 H₂O
Entmineralisiertes und
entsalztes Wasser
pH-Wert

1600,0 mg/1

2928,0 mg/1

1180,0 mg/1

80,0 mg/1

14,0 mg/1

25,0 mg/1

4,0 mg/1

0,34 mg/1

0,30 mg/1

0,24 mg/1

bis 1000 ml
6,0

25

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45° C, einer Verdünnungsrate von 0,084/Stunde und einer Rührerdrehzahl von 1000 UpM gehalten.

Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 0,5 N-Natriumhydroxyd nach Bedarf bei 6,7 gehalten. Ein Gasgemisch aus 33 Vol.-% Methan, 64 Vol.-% Luft und 3 Vol.-°/o Kohlendioxyd wurde in den Eintritt des Fermenters in einer Menge von 20 V/V/Stunde eingeführt.

Eine Methan verwertende Bakterienpopulation wurde der natürlichen Entwicklung unter diesen selektiven Bedingungen überlassen.

Nach einer Betriebszeit von 7 Tagen unter Verwendung dieses Mediums unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen erreichte die Bakterienponulation eine Zelldichte von I₁Og Trockengewicht/l. Diese Population hatte die nachstehend genannte Zusammensetzung. Nur ein Methan verwertender Bakterienstamm konnte von dieser Population isoliert werden. Die anderen Bakterientypen waren nicht in der Lage, Methan zu verwerten. Der Anteil der Methan verwertenden Bakterien an den anderen Bakterientypen betrug zahlenmäßig etwa 90 bis 95%. Das Methan verwertende Bakterium war ein Coccus mit einem Durchmesser von etwa 1,1 bis 1,4 μ. Er war kapselbildend und konnte sowohl Methan als auch Methanol, aber keine Glucose verwerten. Auf einem festen Medium, hergestellt durch Zusatz von 1,0% (Gewicht/ Volumen) Agar zum eingangs beschriebenen Fermentationsmedium, hatten die Kolonien nach Bcbrülung für 3 bis 4 Tage bei 45°C unter einer Methan-Luft-Atmosphäre (Volumenverhältnis 1 : 1) die folgende Morphologie: Der Durchmesser betrug etwa 1 bis 2 mm, und das Aussehen war weiß, glatt und abgerundet. Diese Merkmale stimmen in jeder Hinsicht mit den Merkmalen eines Stammes von Methylococcus capsulatus überein, die von J. W. F ο s t e r und R. H. D a ν i s in Journal of Bacteriology, 91 (1966), Seite 1924, und von R. Whittenbury, K. C. Phillips und J. F. Wilkinson in Journal of General Microbiology, 61 (1970), Seite 205, beschrieben wurden. Das Methan verwertende Bakterium ist bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 19 069 erhältlich.

Stufe B

Zwischenstufe zum Aufbau der Zelldichte für den
Betrieb unter stationären Bedingungen

3,0 1 Kulturmedium, das die gemäß Stufe A erhaltene. Methan verwertende Bakterienpopulation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen, mit Rührer versehenen Fermenters verwendet, der ein Arbeitsvolumen von 3,0 1 hatte. Ein wäßriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt:

KH₂PO₄

Na₂HPO₄ 12 H₂O

NaNO₃

MgSO₄-7 H₂O

Ca(NO₃J₂-4 H₂O

CuSO₄-5 H₂O

FeSO₄-7 H₂O
J₅ ZnSO₄ZH₂O

MnSO₄ H₂O

CoCI₂-6 H₂O

Na₂MoO₄-2 H₂O

H₂SO₄ (3,6 N)
H NO₃ (13,6 N)

Entmineralisiertes und

entsalztes Wasser

pH-Wert

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45°C, einer Verdünnungsrate von 0,18 und einer Rührergeschwindigkeii von 150OUpM gehalten. Gas wurde dem Fermenter in einer Menge von 30 V/V/Stunde zugeführt. Das Gas bestand aus 20 Vol.-% Methan

so und 80 Vol.-% Luft. Nach den ersten wenigen Minuten, in denen der pH-Wert mit 1,0 N-NaOH geregelt wurde, wurde der pH-Wert durch Zusatz von 1,0 N-H₂SO₄ oder I₁ON-NaOH nach Bedarf aus einer automatischen Titrationsapparatur bei 6,0 gehalten. Die Fermentation wurde durchgeführt, bis die Zelldichte auf etwa 5,0 g/l (Trockengewicht) gestiegen war. Dann wurde auf ein Medium der folgenden Zusammensetzung übergegangen:

335,0	mg/1
277,5	mg/1
1193,8	mg/1
160,0	mg/1
90,0	mg/1
4,6	mg/1
14,5	mg/1
0,6	mg/1
0,8	mg/1
0,03	mg/1
0,3	mg/1
0,34	ml/1
3,1	ml/1
bis 1000 ml
1,3

60 H₃PO₄

MgSO₄-ZH₂O

KCl

FeSO₄-7 H₂O

CaCl₂
CuSO₄S H₂O

ZnSO₄-7 H₂O

MnSO₄ H₂O

Na₂MoO₄-2 H₂O

722,5 mg/1

375,0 mg/1

250,0 mg/1

37,5 mg/1

75,0 mg/1

15,0 mg/1

2,25 mg/1

0,75 mg/1

1,0 ms/1

CoCl₂-6 H₂O

NaOH

Entsalztes und

cntmineralisiertcs Wasser

pH-Wert

Stufe C

0,35 mg/l
250,0 mg/1

bis 1000 ml
3,0

Betrieb unter stationären Bedingungen unter

Verwendung von Ammoniumhydroxyd sowohl als

Stickstoffquelle als auch zur pH-Regelung

des Kulturmediums

Zeit	Zufuhr des	Zelldichte	Überschüssige
	Nährmediums		NHi ⁺-Konzentration
			im Kulturmedium
Std.	ml/Stunde	g/l	mg/l
0	510	4,9	16,2
12	510	5,1	7,5
24	510	4,9	12,3
36	510	5,0	10,9
48	510	5,2	9,2
60	510	5,1	20,3
72	510	4,9	31,7
84	510	5,0	25,5
96	510	5,0	18,4

lieh betriebenen Produktionsfermcnters mit einei Arbeitsvolumen von 3,01 verwendet. Ein wäßrige Medium der folgenden Zusammensetzung wurde der Fertnenter kontinuierlich zugeführt:

II)

Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 1,1 N-Ammoniumhydroxyd aus einer automatischen Titrationsapparatur in Abhängigkeit von den pH-Änderungen im Kulturmedium bei 6,0 gehalten. Die Fermentation wurde wenigstens 7 Tage unter stationären Bedingungen durchgeführt. Die Zelldichte unter diesen Bedingungen stabilisierte sich bei etwa 5,0 g/l, wobei Bakterienzellen mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,9 g (Trockengewicht) pro Liter und Stunde erhalten wurde. Der auf Methan bezogene Ausbeutefaklor, d.h. das Gewicht der Zellen (Trockengewicht), die pro Gewichtseinheit des bei der Fermentation verbrauchten Methans erzeugt wurde, betrug 0,66. Der auf Sauerstoff 2^r> bezogene Ausbeutefaktor betrug 0,21.

Die folgenden Ergebnisse sind typisch für die während des Versuchs erhaltenen Resultate:

Die überschüssige Ammoniumionenkonzentration wurde in 10-ml-Proben des Kulturmediums nach einer kolorimetrischen Methode bestimmt.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß durch Verwendung eines Mediums mit einem genauen pH-Wert, der speziell auf eine Fermentation unter ganz bestimmten stationären Bedingungen abgestimmt ist, die überschüssige Acidität im Kulturmedium auf eine Höhe begrenzt wird, die nur eine sehr begrenzte Neutralisation durch Ammoniumhydroxyd erfordert. ^r>5 Diese Ammoniumhydroxydmenge führt zu einer überschüssigen Anuiioniumioncnkonzcntration im Kulturmedium, die normalerweise zwischen 7,5 und 31,7 mg/l liegt. Die Hauptmenge des der Fermentation zugeführten AmmoniumhydiOxyds wurde sofort als Stickstoff- wi quelle für das Wachstum der Methan verwertenden Bakterienkultur ausgenutzt.

Beispiel 2

3,0 I eines Kulturmediums, das die Methan verwerten- b^r> de Baktcrienpopulation enthielt, die gemäß den Isolicr- und Zclldichtc-Aufbaustufen A und I? von Beispiel 1 erhalten wurde, wurden zum Anfahren eines kontiniiier-

KH₂PO₄	335,0 mg/l
Na₂HPO₄-12 H₂O	277,5 mg/l
MgSO₄ -7 H₂O	200,0 mg/l
CaCI₂	50,0 mg/l
NaSO₄ (wasserfrei)	500,0 mg/l
ZnSO₄? H₂O	5,0 mg/l
CuSO₄-5 H₂O	2,0 mg/l
MnSO₄H₂O	0,2 mg/l
NaMoO₄ ·2 HO	3,0 mg/l
CoCI₂-6 H₂O	0,01 mg/l
FeSO₄? H₂O	5,0 mg/l
H₂SO,	2,3 Milliäquiva-
	lent/l
Entmineralisiertes und
entsalztes Wasser	zur Auffüllung auf 1 1
pH	3,1

Stufe C

Betrieb unter stationären Bedingungen unter

Verwendung von Ammoniumhydroxyd sowohl

als Stickstoffquelle als auch zur pH-Regelung

des Kulturmediums

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur voi 45°C, einer Verdünnungsrate von 0,18 und eine Rührergeschwindigkeit von 1500UpM gehalten. Ga wurde dem Fermenter in einer Menge von 30 V/V/Stun de zugeführt. Das Gas bestand aus 20 Vol.-% Methai und 80 Vol.-% Luft.

Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 1,1 N-Ammo niumhydroxyd nach Bedarf bei 6,0 gehalten. Di( Fermentation wurde unter stationären Bedingungen fü eine Zeit von 7 Tagen durchgeführt. Die Zelldichti unter diesen Bedingungen betrug 4,5 g/l, wobei Bakte rienzellen in einer Menge von 0,31 g (Trockengewicht pro Liter und Stunde erzeugt wurden. Der auf Methai bezogene Ausbeutefaktor, d. h. das Gewicht der Zellet (Trockengewicht), das pro Gewichtseinheit des den Fermenter zugeführten Methans erzeugt wurde, belruj 0,66. Der auf Sauerstoff bezogene Ausbeutefaktoi betrug 0,21.

Durch Zusatz eines wäßrigen Nährmediums, dai einen pH-Wert von 3,1 hatte und 2,3 Milliäquivalen H₂SO₄/! enthielt, zum Kulturmedium bei einer Verdün nungsrate von 0,18/Stunde war die resultierendt Wasserstoffionenkonzentration in der wäßrigen Phase derart, daß die Ammoniumionenmenge, die in dei wäßrigen Phase in jedem gegebenen Augenblicl· erforderlich war, um den pH-Wert während de; kontinuierlichen Betriebs unter stationären Bedingun gen bei 6 zu halten, im Bereich von 5,0 bis 50 mg/ variierte. Das Ammoniumhydroxyd wurde sowohl al; Sticksloffquelle als auch als Mittel zur Regelung de; pH-Wertes des Kulturmediums verwendet.

Beispiel 3
Stufe B

5,0 I Kulturmedium, das die Methan verwertende und gemäß Stufe A von Beispiel I erhaltene Baktcriennonu-

ίο

lation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen, mit Rührer versehenen Fermenters verwendet, der ein Arbeitsvolumen von 5,0 I hatte. Ein wäßriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt:

KH₂PO₄

Na₂HPO₄-12 H₂O
NaNO₃
MgSO₄-7 H₂O
Ca(NO₃)₂-4H₂O
CuSO₄-5 H₂O
FeSO₄-7 H₂O
ZnSO₄-7 H ,O
MnSO₄-H₂O
CoCI₂-6H₂O
Na₂MoO₄-2 H₂O
H₂SO₄ (3,6 N)
HNO₃(13,6N)
Entmineralisiertes und
entsalztes Wasser
pH

782,0 mg/l

647,5 mg/l

2 785,5 mg/l

373,0 mg/l

210,0 mg/l

10,6 mg/l

33,8 mg/l

1.3 mg/l

1,8 mg/l

0,06 mg/l

0,75 mg/l

0,8 m!/l

7,3 ml/l

bis 1000 ml 1,3

wenigstens 7 Tage durchgeführt. Die Bakterienzellen wurden mit einer Geschwindigkeit von etwa 2,5 g (Trockengewicht) pro Liter und Stunde erzeugt. Die überschüssige Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium wurde nach der im Beispiel 2 beschriebenen Methode bestimmt. Die folgenden Ergebnisse sind typisch für die während des Versuchs erhaltenen Resultate:

Zufuhr von
Nährmedium

Std. ml/Std.

Zelldichte

g/l

Überschüssige

NH₄+ -Konzentration

im Kulturmedium

mg/l

20 0
12
24
36
48
60
72
84
96

820
820
820
820
820
820
820
820
820

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45°C, einer Verdünnungsrate von 0,18 h-' und einer Rührergeschwindigkeit von 3000 UpM betrieben. Gas wurde dem Eintritt des Fermenters in einer Menge von 66 V/V und Stunde zugeführt. Das Gas bestand aus 18,2 Vol.-% Methan und 81,8 Vol.-% Luft. Der pH-Wert wurde auf 6,1 eingestellt und anschließend durch Zusatz von 1,0 N-H₂SO₄ oder 1,0 N-NaOH nach Bedarf aus einer automatischen Tilrationsapparatur bei 6,1 gehalten.

Unter diesen Bedingungen stieg die Zelldichte allmählich auf etwa 14 g (Trockengewicht) pro Liter. In dieser Phase wurde auf ein Medium der folgenden Zusammensetzung übergegangen:

14,1	14,4	4
14,0	11,5
14,1	9,2
14,0	10,4
14,0	18,3
14,1	17.6
14,2	20,4
14,1	21,2
14,0	18,5
Beispiel
Stufe B

5,01 Kulturmedium, das die gemäß Stufe A von Beispiel 1 erhaltene, Methan assimilierende Baklerienpopulation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen, mit Rührer versehenen Fermenters verwendet, der ein Arbeitsvolumen von 5,0 I hatte. Ein wäßriges Medium der folgenden Zusammen-

KH₂PO₄	Stufe C	937,5 mg/l	Setzung wurde dem Fermentcr k(	Dntinuierlich zugefü
Na₂HPO₄-12 H₂O	Hotrinh iinlpr *it:ition:irnn Rnrlii	787,5 mg/l
MgSO., -7 H₂O	562,5 mg/l	id KH₂PO₄	782,0 mg/l
FcSO₄-7 H₂O	50,6 mg/l	Na^HPO₄-12 H₂O	647,5 mg/l
CaCI₂	112,5 mg/l	NaNO,	2 785,5 mg/l
CuSO₄-5 H₂O	20,5 mg/l	MgSO₄? H₂O	373,0 mg/l
ZnSO₄ 7 H₂O	2,5 mg/l	Ca(NO,)₂-4H₂O	210,0 mg/l
MnSO₄-H₂O	1,7 mg/l	« CuSO₄S H₂O	10,6 mg/l
Na₂MoO₄-2 H₂O	1,5 mg/l	FeSO₄-7 H₂O	33,8 mg/l
CoCI₂-OH₂O	0,5 mg/l	ZnSO₄-7 H₂O	1,3 mg/l
Na₂SO₄	225,0 mg/l	MnSO₄-H₂O	1,8 mg/l
H₂SO₄(3,6 N)	0,2 ml/l	CoCI₂-6H₂O	0,06 mg/l
Entmineralisiertes und		w Na₂MoO₄ 2H₂O	0,75 mg/l
entsalztes Wasser	bis 1000 ml	H₂SO₄(3,6N)	0,8 ml/1
pH	2,6	HNO,(13,6N)	7,3 ml/l
		Entmineralisiertes und
	entsalztes Wasser	bis 1000 ml
ηυιιηϊπΜΐ iinfcr	11 pH-Wert	1,3

Verwendung von Ammoniumhydroxyd sowohl als Stickstoffquelle als auch zur pH-Regelung

des Kulturmediums

Der pH-Wert des Kulturmediums wurde durch wi Zusatz von 1,1 N-NH₄OH-L.ösung aus einer automatischen Titrationsapparatur in Abhängigkeit von pH-Änderungen im Kulturmedium bei 6,1 gehalten. Das Ammoniumhydroxyd diente sowohl als Stickstoffquelle für das Wachstum als auch als Neutralisationsmiltel. hi

Die Zelldichte stabilisierte sich unter diesen Bedingungen bei etwa 14 g (Trockengewicht)/!. Die Fermentation wurde unter stationären Bedingungen für Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45°C, einer Verdünnungsrate von 0,10 h ' und einer Rührergeschwindigkeit von 3000 LJpM betrieben. Gas wurde dem Eintritt des Fermenters in einer Menge von 66 V/V/Stunde zugeführt. Das Gas bestand aus 18,2 Vol.-% Methan und 81,8 Vol.-% Luft. Der pH-Wert .viirde auf 6,1 eingestellt und dann durch Zusatz von 1,0 N-H₂SO₄ oder 1,0 N-NaOI l-l.ösung (nach Bedarf) aus einer automatischen Titrationsapparatur bei 6,1 gehalten.

Unter diesen Bedingungen stieg die Zelldichte allmählich auf etwa 25 g (Trockengewicht)/!. In dieser

Phase wurde auf ein Medium der folgenden Zusammensetzung übergegangen:

Fermenter hatte ein Arbeilsvolumen von 5,01 und enthielt 5,0 I eines wäßrigen Mediums der folgenden Zusammensetzung:

KH₂PO₄	1 875,0 mg/1	5	KH₂PO₄	1 600,0 mg/1
Na₂HPO₄ ■ 12 H₂O	1 575,0 mg/1		Na₂HPO₄ · 12H,O	2 928,0 mg/1
MgSO₄ · 7 H₂O	1 125,0 mg/1		NaNO₃	I 180,0 mg/1
FeSO₄ · 7 H₂O	101,4 mg/1		MgSO₄ · 7 H₂O	80,0 mg/1
CaCI₂	225,0 mg/1		FeSO₄ ■ 7 H₂O	14,0 mg/1
CuSO₄ · 5 H₂O	41,0 mg/1	IO	Ca(NO₃)₂ -4H₂O	25,0 mg/1
ZnSO₄ -7H₂O	5,0 mg/1		CuSO₄ · 5 H₂O	4,0 mg/1
MnSO₄ · H₂O	3,4 mg/1		ZnSO₄ · 7 H₂O	0,34 mg/1
Na₂MoO₄ · 2 H₂O	2,9 mg/1		MnSO₄ · H₂O	0.30 mg
CoCI₂ · 6 H₂O	1,0 mg/1		Na₂MoO₄ · 2 H₂O	0,24 mg/1
Na^SO₄	450,0 mg/1	15	Entmineralisiertes und
H₂SO₄ (36 N)	0,4 ml/1		entsalztes Wasser	zur Auffüllung
Entsalztes und				auf 1 Liter
entmineralisiertes Wasser	bis 1000 ml		pH-Wert	6,25
pH-Wert	2,3

Stufe C

Betrieb unter stationären Bedingungen unter

Verwendung von Ammoniumhydroxyd sowohl als

Stickstoffquelle aus auch zur pH-Regelung

des Kulturmediums

Der pH-Wert des Kulturmediums wurde durch Zusatz von 1,1 N-NH₄OH-Lösung aus einer automatischen Titrationsapparatur in Abhängigkeit von den pH-Änderungen im Kulturmedium bei 6,1 gehalten. Das Ammoniumhydroxyd diente sowohl als Stickstoffquelle für das Wachstum als auch als Neutralisationsmittel.

Die Zelldichte stabilisierte sich unter diesen Bedingungen bei etwa 25,0 g (Trockengewicht)/!. Die Fermentation wurde unter stationären Bedingungen für eine Zeit von wenigstens 7 Tagen durchgeführt. Die Erzeugung an Bakterienzellen betrug etwa 2,5 g (Trockengewicht) pro Liter und Stunde. Die überschüssige Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium wurde nach einer kolorimetri.chen Methode bestimmt. Die folgenden Ergebnisse sind typisch für die während des Versuchs erhaltenen Resultate:

Zufuhr von
Nährmedium

ml/Std

Zelldichte Überschüssige

NH₄+ -Konzentration im Kulturmedium

g/l

mg/1

O	415
12	415
24	415
36	415
48	415
60	415
72	415
84	415
96	415

25,0	21,6	5
25,0	22,0
24,5	18,0
25,0	19,5
25,5	17,2
25,0	22,0
24,5	25,0
24,5	30,2
25,0	30,0
Beispiel
Stufe Λ

Methode zur Gewinnung einer Kultur von Methan

verwertenden Bakterien für die Verwendung beim

Verfahren gemäß der Erfindung

Aufschlüminungcn von je 500 ml von niethanhaltigem Schlamm aus stehenden Hecken wurden in täglichen Abständen für eine Zeit von 5 Tagen zu einem belüfteten und gerührten Fermenter gegeben. Der Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45°C, einer Verdünnungsrate von 0,084/Stunde und einer Rührergeschwindigkeit von 1000 UpM gehalten.

Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 0,5 N-Natriumhydroxyd nach Bedarf bei 6,75 gehalten. Ein Gasgemisch, das aus 33 Vol.-% Methan, 64 VoI.-% Luft und 3 Vol.-% Kohlendioxyd bestand, wurde dem Eintritt des Fermenters in einer Menge von 20V/V/Stunde zugeführt.

Nach einer Betriebsdauer von 7 Tagen unter Verwendung dieses Mediums unter den vorstehend genannten Bedingungen erreichte die Bakterienpopulation eine Zelldichte von 1,10 g (Trockengewicht) pro Liter. Sie hatte die nachstehend genannte Zusammensetzung. Nur ein Methan verwertender Stamm von Bakterium konnte aus dieser Population isoliert werden. Die anderen Bakterienarten vermochten Methan nicht zu verwerten. Der Anteil der Methan verwertenden Bakterien an den anderen Bakterienarten betrug zahlenmäßig etwa 90 bis 95%. Das Methan verwertende Bakterium war ein Coccus mit einem Durchmesser von etwa 1,1 bis 1,4 μ. Er war kapselbildend und konnte sowohl Methan als auch Methanol, aber keine Glucose verwerten. Auf einem festen Medium, hergestellt durch Zusatz von 1,0% (Gew.-/Vol.) Agar zu dem zu Beginn beschriebenen Fermentationsmedium hatten die Kolonien nach einer Bebrütungsdauer von 3 bis 4 Tagen bei 45°C unter einer Atmosphäre von Methan und Luft (Volumenverhältnis 50 :50) die folgende Morphologie: Der Durchmesser betrug etwa 1 bis 2 mm, und das Aussehen war weiß, glatt und abgerundet. Diese Merkmale stimmen in jeder Hinsicht mit den Merkmalen eines Stammes von Methylococctis capsulatus übercin, der von ). W. Fo s t e r und R. H. D avis in J. Bact. Vol. 91,(1955) 1924, und R. W h i 11 e η b u ry , K. C. Phillips und |. F. Wilkinson in |. Gen. Microbiology, 61 (1970) 205, beschrieben wurde.

Stufe B

Zwischenstufe zum Aufbau der Zelldichtc für den
Betrieb unter stationären Bedingungen

5 1 Kulturmedium, das die in der voi stehend beschriebenen Weise erhaltene, Methan verwertende Bakterienpopulalion enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen Prodiiktionsfermenters

mit einem Arbeitsvolumen von 5,01 verwendet. Ein wäßriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt:

KH₂PO₄	937,5 mg/l
Na₂HPO₄ 12H₂O	787,5 mg/l
MgSO₄ ■ 7 H₂O	562,5 mg/l
H₂SO₄	706,0 mg/l
CaCl₂ (wasserfrei)	112,5 mg/l
FeSO₄ ·7Η₂Ο	42,7 mg/l
Na₂SO₄ (wasserfrei)	225,0 mg/l
CuSO₄ · 5 H₂O	20,5 mg/l
ZnSO₄ · 7 H₂O	2,5 mg/l
Na₂MoO₄ · 2 H₂O	1,5 mg/l
MnSO₄ · H₂O	1,7 mg/l
CoCl₂ ■ 6 H₂O	0,5 mg/l
Wasser	zur Auffüllung
	auf 1 1
pH-Wert	etwa 2,6

IO

20

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45°C, einer Verdünnungsrate von 0,18 und einer Rührergeschwindigkeit von 3000 UpM betrieben. Gas in einer Menge von 66 V/V/Std. wurde dem Eintritt des Fermenters zugeführt. Das Gas bestand aus 18,2 Vol-% Methan und 81,8 Vol.-% Luft. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 6,5 eingestellt und anschließend bei 6,5 gehalten, indem 1,0 N-NaOH nach Bedarf aus einer automatischen Titrationsapparatur zugesetzt wurde.

Der Stickstoff wurde als Ammoniumhydroxyd (1,1 N) jo zugeführt, das in den Fermenter in allmählich steigender Menge so eingeführt wurde, daß eine Zelldichte von etwa 10 g (Trockengewicht) aufgebaut wurde. Die »überschüssige« Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium wurde ermittelt, indem alle 10 Minuten j-, 10 ml Kulturmedium entnommen wurden und dann die Ammoniumionenkonzentration nach der kolorimetrischen Methode bestimmt wurde, die von ]. Paul in Analyst 83 (1958) 37-42 (oder G. G. Maynell und E. M a y η e 11 »Theory and Practice of Experimental Bacteriology, Cambridge University Press), beschrieben wird. Es ist auch möglich, die Ammoniumionenkonzentration mit einer »Ammoniaksonde« in Kombination mit einem pH-Meßgerät zu bestimmen. Der »Überschuß« der Ammoniumionen im Kulturmedium wurde bei einer Konzentration von 5 — 10 mg/l gehalten, indem die Menge, in der das Ammoniumhydroxyd in den Fermenter gepumpt wurde, von Hand geregelt wurde.

Stufe C

Betrieb unter stationären Bedingungen unter Verwendung von Ammoniumhydroxyd als Stickstoffquelle mit einer unabhängigen pH-Regelung unter
Verwendung von Natriumhydroxyd

Als die Zelldichte des Fermenters in der Stufe B 13,5 g/l erreicht hatte, wurde mit dem Betrieb unter stationären Bedingungen begonnen, wobei unter den gleichen Fermentationsbedingungen, wie sie für die Stufe B beschrieben wurden, gearbeitet wurde. Der mi »Überschuß« an Ammoniumionen wurde mit Hilfe einer der oben beschriebenen Methoden bei einer Konzentration zwischen 5 und 10 mg/l gehalten. In dieser Phase war die Menge pro Zeiteinheit, in der das Ammoniumhydroxyd in den Fermenter gepumpt wurde, mit h^r> Ausnahme von kleinen Korrekturen praktisch konstant.

Die Fermentation wurde unter stationären Bedingungen 17 Tage durchgeführt. Die Zclldichtc unter den vorstehend genannten Bedingungen betrug 13,5 g/l bei einer Produktionsgeschwindigkeit an Bakterienzellen von 13,5-0,18 g (Trockengewicht) pro Liter und Stunde. Die auf Methan bezogene Ausbeute, d. h. das Gewicht der Zellen (Trockengewicht), die pro Gewichtseinheit des dem Fennenter zugeführien Methans erzeugt wurden, betrug 0,63. Die auf Sauerstoff bezogene Ausbeute betrug 0,23.

Beispiel 6
Stufe B

3,01 Kulturmedium, das die gemäß Stufe A von Beispiel 1 erhaltene. Methan verwertende Bakterienpopulation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich unter Rühren betriebenen Fermenters mit einem Arbeitsvolumen von 3,01 verwendet. Ein wäßriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt:

KH^PO₄	335,0 mg/l
Na₂HPO₄ · 12H₂O	277,5 mg/l
MgSO₄ · 7 H₂O	160,0 mg/l
FeSO₄ · 7 H₂O	14,5 mg/l
CaCI₂	40,0 mg/l
CuSO₄ · 5 H₂O	4,55 mg/l
ZnSO₄ · 7 H₂O	0,55 mg/l
MnSO₄ · H₂O	0,75 mg/l
Na₂MoO₄ · 2 H₂O	0,32 mg/l
CoCl₂ ■ 6 H₂O	0,023 mg/l
H₂SO₄ (3,6 N)	0,125 ml/1
Entmineralisiertes und
entsalztes Wasser	zur Auffüllung
	auf 1000 ml
pH-Wert	2,6

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45°C, einer Verdünnungsrate von 0,18 und einer Rührergeschwindigkeit von 1500 UpM betrieben. Ein aus 20 VoL-⁰Zb Methan und 80 Vol.-% Luft bestehendes Gas wurde dem Fermenter in einer Menge von 30 V/V/Std. zugeführt.

Stufe C

Betrieb unter stationären Bedingungen unter Verwendung von Ammoniumhydroxyd als Stickstoffquclle mit unabhängiger pH-Regelung unter Verwendung
von Natriumhydroxyd

Der pH-Wert wurde durch Zusatz von 1,ON-Natriumhydroxyd aus einer automatischen Titrationsapparatur in Abhängigkeit von pH-Werländcrungen im Kulturmedium bei 6,6 gehalten. Eine 1,1 N-Ammoniumhydroxydlösung wurde mit einer Pumpe zugesetzl, wobei die Menge gemäß der bestimmten Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium eingestellt wurde. Die Ammoniumionenkonzcnlration wurde nach einer kolorimetrischen Methode bestimmt, die in Beispiel 5 (Stufe B) genannt ist. Die Fermentation wurde für eine Mindestzeit von 7 Tagen durchgeführt. Die Zclldichtc unter diesen Bedingungen betrug etwa 5,0 g/l entsprechend einer Erzeugung von Bakterienzellen von etwa 0,9 g (Trockengewicht) pro Liter und Stunde. Die folgenden Ergebnisse sind typisch für die während des Versuchs erhaltenen Resultate;

15

Zeit

Sid.

Einsatz des
Nährmediums

ml/Std.

Aufnahme von 1,0 N-NaOH gem. Titration

ml/Stunde Zelldichte

g/l

Überschüssige

N H₄+ -Konzentration

im Kulturmedium

mg/1

0
12
24
36
48
60
72
84
96

500
500
500
500
500
500
500
500
500

3,0
3,0
2,9
3,0
3,1
2,9
3,0
3,0
2,9

4,9
5,0
5,0
4,9
4,9
5,0
5,0
4,8
5,0

15,0

8,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

16,0

15,0

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß durch Zuführung von Ammoniumhydroxyd mit einer Pumpe in Abhängigkeit von der überschüssigen NH₄ + -Ionenkonzentration im Kulturmedium eine Fermentation unter stationären Bedingungen durchgeführt werden kann. Durch Neutralisation mit Natriumhydroxyd wird der pH-Wert des Kulturmediums konstant gehalten.

Beispiel 7

Stufe B
Zwischenstufe zum Aufbau der Zelldichte

5,01 Kulturmedium, das die gemäß Stufe A von Beispiel 1 erhaltene, Methan verwertende Bakterienpopulation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen, mil Rührer versehenen Fermenters mit einem Arbeitsvoll.men von 5,01 verwendet. Ein wäßriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt:

JO

HjPO₄	• 7 H₂O	6H₂O	I 098,0 mg/1
MgSO₄		825,0 mg/1
KCI		275,0 mg/1
Na₂SO₄	7H₂O	210,0 mg/1
FeSO₄ ·		54,4 mg/1
CaCI₂	■ 5 H₂O	75,0 mg/1
CuSO₄	■ 7 H₂O	20,6 mg/1
ZnSO₄	• H₂O	2,9 mg/1
MnSO₄	Na₂MoO₄ · 2 H₂O	0,8 mg/1
	CoCI₂ ·	1,5 mg/1
0,5 mg/1

45

50 Entmineralisiertes und
entsalztes Wasser

pH-Wert

zur Auffüllung auf 1000 ml 2,25

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur voi 45°C, einer Verdünnungsrate von 0,18 h-' und eine Rührergeschwindigkeit von 3000 UpM betrieben. Eil aus 18,2 Vol.-% Methan und 81,8 Vol.-% Luf bestehendes Gas wurde dem Eintritt des Fermenters ii einer Menge von 66 V/V/Std. zugeführt.

Eine 1,1 N-Ammoniumhydroxydlösung wurde mi einer Pumpe in den Fermenter eingeführt. Di< zugeführte Menge wurde nach der Ammoniumionen konzentration im Kulturmedium unter Anwendung dei in Beispiel 5 beschriebenen Bestimmungsmethodf geregelt. Der pH-Wert wurde durch Zusatz vor 1,0 N-NaOH-Lösung aus einer automatischen Titra tionsapparatur in Abhängigkeit von pH-Wertänderun gen im Kulturmedium bei 6,2 gehalten.

Stufe C

Betrieb unter stationären Bedingungen unter Verwendung von Ammoniumhydroxyd als Sticksloffquelle bei unabhängiger pH-Regelung unter Verwendung von Natriumhydroxyd

Die Zelldichte unter diesen Bedingungen stabilisierte sich bei etwa 14 g (Trockengewicht) pro Liter. Di« Fermentation wurde wenigstens 7 Tage unter stationä ren Bedingungen durchgeführt. Die Erzeugung ar Bakterien betrug etwa 2,5 g (Trockengewicht) pro Litei und Stunde.

Die folgenden Ergebnisse sind typisch für die während des Versuchs erhaltenen Resultate.

Zeit

Std.

Zufuhr des
Nährmediums

ml/Std.

Aufnahme von 1,0 N-NaOH gem. Titration

ml/Stunde Zelldichte

g/l

Überschüssige

N H₄+ -Konzentration

im Kulturmedium

mg/1

0	815	5,3	13,9	15,0
12	815	5,5	14,0	12,5
24	815	5,7	14,3	10,0
36	815	5,8	14,4	9,5
48	815	5,5	14,0	10,0
60	815	5,7	14,1	8,0
72	815	5,1	14,3	7,5
84	815	5,6	14,0	7,8
96	815	5,7	14,4	9,5

709 585/18;

Claims

Patentansprüche:

1. Kontinuierliches Verfahren zur Umwandlung von Methan in Eiweißstoffe durch kontinuierliche Kultivierung von Methan verwertenden Mikroorganismen in einem wäßrigen Kulturmedium, das Nährsalze und Ammoniumionen enthält und dem ein wäßriges Nährmedium zugesetzt wird, in Gegenwart von Methan und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Kulturmediums im Bereich von 4,5 bis 8,0 und die Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium im Bereich von 2 bis 80, vorzugsweise 2 bis 50 mg pro Liter, und die Produktionsgeschwindigkeit unter stationären Bedingungen bei wenigstens 0,81 g (Trockengewicht) Mikroorganismus pro Liter und Stunde hält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des dem Kulturmedium zuzusetzenden wäßrigen Nährmediums so gewählt wird, daß zur Regelung des nach diesem Nährmediumzusatz erhaltenen pH's des Kulturmediums innerhalb des pH-Bereiches von 4,5 bis 8,0 nicht mehr als 80 mg Ammoniumionen pro Liter erforderlich sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Kulturmediums durch Zusatz von Säure oder Alkali mit Ausnahme von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd im Bereich von 4,5 bis 8,0 und die Ammoniumionenkonzentration in Abhängigkeit von durch Apparaturen bestimmten Werten der Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium im Bereich von 2 bis 80 mg pro Liter hält.