DE2307692A1

DE2307692A1 - Verfahren zur umwandlung von methan und elementarem stickstoff in proteinmaterial

Info

Publication number: DE2307692A1
Application number: DE19732307692
Authority: DE
Inventors: Patrick Gould; Francis Moran; Philip Albert Myers
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1972-02-16
Filing date: 1973-02-16
Publication date: 1973-08-30
Also published as: AU5223773A; IT977384B; NL7302193A; BE795566A; GB1421135A; FR2172313A1; FR2172313B1; JPS4892590A

Description

DR.-ING. VON KKEISLER DK.-ING. SCHDNWALO DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAHOlA KELLER DR.-ING. KLDPSCK DIPL-ING. SELTING

5 KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den I3.2.I973 Kl/Ax

The British Petroleum Company Limited,

Britannic House, Moor Lane, London« EC2Y 9BU (England).

^von Methan und elementarem Stickstoff in Proteinmaterial

Die Erfindung betrifft ein Fermentationsverfahren zur Umwandlung von Methan und elementarem Stickstoff, z.B. in der luft vorhandenem Stickstoff, in Proteinmaterial.

Verfahren zur Umwandlung von Methan in Proteinmaterial sind bereits vorgeschlagen worden. Bei diesen Verfahren werden Methan verwertende Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium in Gegenwart von Methan als Kohlenstoffquelle, Stickstoff in gebundener Form als Stickstoffquelle und eines Gases, das freien Sauerstoff enthält, kultiviert. Der im wässrigen Mhrmediura vorhandene gebundene Stickstoff ist gewöhnlich ein Ammonium- oder Nitration, und als sauerstoffhaltiges Gas wird Luft verwendet. Der gebundene Stickstoff wird dem Fermenter in einer Menge zugeführt, die zu einem "Überschuß¹¹ im Nähimediura über die Menge führt, die erforderlich ist, um den gesamten ätickstoffbedarf de3 Mikroorganismus zu decken. Über die Fähigkeit wenigstens eines Methan verwertenden Mikroorganismus, den in der Luft vorhandenen elementaren Stickstoff zu binden, wurde bereits berichtet. Aus der Literatur ist jedoch zu entnehmen, daß

309838/0942

angesichts der sehr niedrigen Wachstumsgeschwindigkeitfjn,. die angegeben wurden, die Fähigkeit zur Bindung von elementarem Stickstoff bei dieser Art von Mikroorganismen nur von akademischem Interesse ist.

Es wurde nun bei kontinuierlichen Verfahren zur Kultivierung von Methan verwertenden Mikroorganismen bei Verwendung von Luft als sauerstoffhaltiges Gas überraschenderweise gefunden, daß die dem Fermenter zugeführte Menge an gebundenem Stickstoff verringert werden kann, bis die aus dem Fermenter in Form von Rohprotein gewonnene Stickstof fmenge größer ist als die Stickstoffmenge, die dem Fermenter als gebundener Stickstoff zugeführt wird. Schließlich wurde festgestellt, daß das Rohprotein auch in Abwesenheit von gebundenem Stickstoff gebildet wird.

Gemäß einem ersten Aspekt ist die Erfindung demgemäß auf die Umwandlung von Methan und elementarem Stickstoff in Proteinmaterial nach einem Verfahren gerichtet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in einem Fermenter einen elementaren Stickstoff und Methan verwertenden Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium, das Nährsalze enthält, in Gegenwart von Methan als Kohlenstoffquelle, eines freien Sauerstoff und elementaren Stickstoff enthaltenden Gases kontinuierlich kultiviert, wobei die Menge des dem Fermenter als gebundener Stickstoff zugeführten Stickstoffs geringer ist als die Sticlcotoffmenge, die aus dem Fermenter als Rohprotein gewonnen wird, oder wobei kein gebundener Stickstoff dem Feroienter zugeführt wird.

Unter dem hier gebrauchten Ausdruck "Rohprotein" ist der Gesaratstickstoffgehalt der Mikrobienzellen multipliziert mit einem Faktor von 6,25 zu verstehen.

Bei Verwendung von Luft als Gas, das freien Sauerstoff enthält, und bei Verringerung der Menge an Stickstoff, der dem Fermenter als gebundener Stickstoff zugeführt wird,

bleiben überraschenderweise die spezifische V/achstumsge-309835/0942

schwindigksit und die Produktivität ausreichend für den kontinuierlichen kommerziellen Betrieb zur Großherstellung von Proteinmaterial.

Sowohl der elementare Stickstoff als auch der freie Sauerstoff können dem Fermenter vorteilhaft als Luft zugeführt werden. Normalerweise werden Luft-Methan-Gemische verwendet. Der Methangehalt des Gemisches kann im Bereich von 10 bis 50J» liegen und beträgt vorzugsweise 15 bis 25 Vol.-56. Der Sauerstoffgehalt kann im Bereich von 10,5 bis 18,9^6 lie£?en und beträgt vorzugsweise 16 bis 17 Vol.-^ Der Stickstoffgehalt kann 40 bis 72$ betragen. Diese Luft-Methan-Gemische können durch Zusatz von reinem Sauerstoff angereichert werden. Als Methanquelle kann Erdgas verwendet werden.

Die Bedingungen, unter denen das Verfahren durchgeführt werden kann, sind selektiv für methanverwertende Mikroorganismen. Bei Durchführung des Verfahrens unter Verwendung nur von elementarem Stickstoff pflegt die biologische Selektivität des Systems zu steigen, so daß die ausschließliche Bildung von methanverwertenden Mikroorganismen begünstigt wird. Es ist demzufolge nicht notwendig, aseptische Fermentationsverfahren anzuwenden, und nichtaseptischer Betrieb wird hauptsächlich aus wirtschaftlichen Gründen auch bevorzugt.

Die Fermentation kann bei Drücken oberhalb von Normaldruck durchgeführt werden. Beispielsweise sind Drücke bis etwa 3 bis 4 Atmosphären anwendbar.

Im Verlauf des Prozesses wird ein wässriges Kährmediuui, das Nährsaize enthält, dem Permentationssystem in einer solchen Men^e zugeführt, daß die Zusammensetzung des Nährmediums konstant bleibt.

Das wässrige Uährmedium kann aus beliebigen bekannten Nährmedien, die bei Methanfen::entationen verwendet wer-309835/09/*,

den, und aus denen die Stickstoffquelle weggelassen oder mengenmäßig verringert worden ist, ausgewählt v/erden oder darauf basieren. Die Menge jedes Nährstoffs muß so eingestellt werden, daß gewährleistet iet, daß das Medium unbegrenztes Wachstum des Mikroorganismus mit der gewünschten Geschwindigkeit ermöglicht.

Der pjj-Wert des Nährmediums wird normalerweise im Bereich von 4,5 bis 8,0, vorzugsweise im Bereich von 5,5 bis 7,0 gehalten. Geeignet für diesen Zweck sind Alkalien wie Alkalihydroxyde, z,B. Natriumhydroxyd.

Das Verfahren kann bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 60⁰C durchgeführt werden. Vorzugsweise wird eine Temperatur von 35 bis 50°C angewandt. Vorzugsweise wird bei einem p„-Wert von etwa 6,5 und bei einer Temperatur von etwa 45 C gearbeitet.

Spezifische Verdünnungsraten im Bereich von 0,1 bis 0,35 Std. bei einer Produktivität für Biomasse im Bereich von 0,1 bis 10,0 g/l pro Stunde sind beim Verfahren gemäß der Erfindung erreichbar.

Die dem Fermenter zugeführte Menge an gebundenem Stickstoff sollte vorzugsweise 99$ nicht übersteigen und in der Praxis etwa 95 Gew.-$ des aus dem System als Rohprotein gewonnenen Stickstoffs betragen. Das Verfahren wird gewöhnlich mit einem an der Schwelle der Nachweisbarkeit durch übliche Analysenmethoden liegenden "Überschuß" an gebundenen Stickstoffionen im Nährmedium durchgeführt. Dieser Überschuß beträgt etwa 2 mg/1 für Ammoniumionen. Der als gebundener Stickstoff zugeführte Stickstoff kann die Form von Ammonium- oder Nitrationen haben. In der Praxis beträgt bei Verwendung von gebundenem Stickstoff in Form von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd die Konzentration der Ammoniumionen im Nährmedium weniger als 2 mg/1. Es wurde gefunden, daß die Anwesenheit von Ammoniumionen in einer Konzentration von mehr als etwa 100 mg/1 giftig 30983S/0942

für Mikroorganismen ist, die elementaren Stickstoff und Methan verwerten, und daß diese Mikroorganismen Ammoniumionen bevorzugt vor elementarem Stickstoff verwerten. Es ist ein Merkmal des Verfahrens gemäß der Erfindung, daß der größte Teil des vom Mikroorganismus zum Wachstum benötigten Stickstoffs als Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd zugeführt werden kann, während giftige Atnmoniumionenkonzentrationen vermieden werden, indem der verbleibende Teil des Stickstoffbedarfs des Mikroorganismus durch elementaren Stickstoff gedeckt wird.

Wenn beispielsweise Luft als Quelle von elementarem Stickstoff verwendet wird, gewährleisten zugeführte Mengen des Einsatzgases (18,2 Vol.-5a Methan in Luft) in der Größenordnung von etwa 66 V/V Nährmedium/Stunde bei einer Verdünnungsrate von etwa 0,18 Std."" die Anwesenheit von genügend elementarem Stickstoff, um den nicht durch das Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd gedeckten Teil des Stickstof f bedarf s des Mikroorganismus vollständig zu decken.

Das Ammoniumhydroxyd kann dem Kulturmedium zweckmäßig mit einer Dosierpumpe zugeführt werden. Die Zuführung von flüssigem oder gasförmigem Ammoniak kann mit einem üblichen Durchflußmengenmesser erfolgen. Durch die Zugabe von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd in einer Menge, durch die nur ein Teil des zum Wachstum des Mikroorganismus erforderlichen Stickstoffs als Ammoniumionen zugeführt wird, wird im allgemeinen sichergestellt, daß die Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium geringer ist als 2 mg/1.

Die Mikroorganismen, die elementaren Stickstoff und Methan verwerten, können nach bekannten Methoden zur Isolierung von methanverwertenden Mikroorganismen erhalten werden» Vorzugsweise werden Stämme von Methylococcus capsulatus, die elementaren Stickstoff und Methan verwerten, verwendet.

309836/0942

Gemäß einem weiteren Merkmal umfaßt die Erfindung die Umwandlung von Methan und elementarem Stickstoff in Proteinmaterialien nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in einer Kulturvorbereitungsstufe einen Mikroorganismus, der elementaren Stickstoff und Methan verwertet, in einem wässrigen Nährmedium, das Nährsalze enthält, in Gegenwart einer Stickstoffquelle, vorzugsweise in Gegenwart von gebundenem Stickstoff, und in Gegenwart von Methan als Kohlenstoffquelle und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases bis zu einer Konzentration der Zellen des Mikroorganismus, die für den Betrieb im stationären Zustand in einer Produktionsstufe erforderlich ist, kultiviert und anschließend in einer Produktionsstufe die Mikrobienzellen aus der Kulturyorbereitungsstufe kontinuierlich in einem Fermenter in einem wässrigen Nährmedium, das Nährsalze enthält, in Gegenwart von Methan •als Kohlenstoffquelle, eines freien Sauerstoff und elementaren Stickstoff enthaltenden Gases kultiviert, wobei die dem Fermenter als gebundener Stickstoff zugeführte Stickstoffmenge geringer ist als die Stickstoffmenge, die aus dem Fermenter als Rohprotein gewonnen wird, oder wobei dem Fermenter kein gebundener Stickstoff zugeführt wird.

Die Kulturvorbereitungsstufe hat den Zweck, eine Population von elementaren Stickstoff und Methan verwertenden Mikroorganismen zu bilden, die sich für kontinuierliches Arbeiten in der Produktionsstufe unter stationären Bedingungen bei einer gewünschten Verdünnungsrate eignet. Beispielsweise kann diese Population eine Zelldichte im Bereich von 1 bis 30 g/l haben.

In der Praxis wird die Kulturvorbereitungsstufe für eine Zeit durchgeführt, die gerade genügt, um kontinuierlichen Betrieb unter stationären Bedingungen bei der in der Produktionsstufe gewünschten Zelldichte und Verdünnungsrate zu erreichen. In der Vorbereitungsstufe kann chargenweise gearbeitet werden, jedoch wird vorzugsweise

309835/0942

kontinuierlich gearbeitet. Bei kontinuierlichem Arbeiten sollte die spezifische Verdünnungsrate wesentlich niedriger sein als die maximale spezifische Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorganismus. Die Arbeitstemperaturen, Pg-Werte, die Belüftung und die zugeführten Methanmengen können in dieser Stufe die gleichen sein, wie sie vorstehend für kontinuierliche Durchführung des Verfahrens gemäß dem ersten Merkmal der Erfindung beschrieben wurden. Alle vorstehend beschriebenen wässrigen Nährmedien sind geeignet. Vorzugsweise sollte das gewählte Nährmedium durch .eine Quelle von gebundenem Stickstoff, z.B. Ammonium- oder Nitrationen, ergänzt werden. Die Konzentration des gebundenen Stickstoffs sollte etwas über der Konzentration liegen, die erforderlich ist, um den gesamten Stickstoffbedarf des Mikroorganismus zu decken. Bei Verwendung von Ammoniak als Quelle von gebundenem Stickstoff wird das Ammoniak vorzugsweise getrennt dem Kulturmedium im Fermenter zugesetzt. Die "überschüssige" Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium liegt vorzugsweise im Bereich von 2 bis 100 mg/1. Dieser gewünschte Überschuss kann durch Regelung der dem Fermenter zugeführten Ammoniakmenge aufrecht erhalten werden.

Die "Starterkultur" für die Beimpfung der Kulturvorbereitungsstufe kann eine Kultur eines elementaren Stickstoff und Methan verwertenden Mikroorganismus, z.B. eine Agar-Schrägkultur sein. Der Fermenter kann auch mit Proben eines den Mikroorganismus enthaltenden Materials, z.B. Boden- oder Schlammproben, beimpft werden.

Bei Verwendung von Proben eines den Mikroorganismus enthaltenden Materials als Inoculum wird die Kulturvorbereitungsstufe vorzugsweise in zwei aufeinanderfolgenden Phasen durchgeführt, nämlich in einer Isolierungsphase, in der ein Mikroorganismus, der elementaren Stickstoff und Methan verwertet, vom Material isoliert wird, und 309836/0942

anschließend in einer Entwicklungspha3e, in der die Konzentration der Zellen des elementaren Stickstoff und Methan verwertenden Mikroorganismus auf die in der Produktionsstufe erforderliche Konzentration erhöht wird.

In der Praxis kann die Isolierungsphase durchgeführt werden, indem Proben des den Mikroorganismus enthaltenden Materials einem kontinuierlich arbeitenden Anreicherungssystem zugesetzt werden. Anreicherungsverfahren sind bekannt. Am zweckmäßigsten wird ein solches Verfahren so durchgeführt, daß ein Fermenter, der eines der oben beschriebenen wässrigen Nährmedien enthält, wobei vorzugsweise ein Nitrat als Stickstoffquelle verwendet wird, unter Bedingungen, die die Entwicklung einer Population eines elementaren Stickstoff und Methan verwertenden Mikroorganismus ermöglichen, kontinuierlich betrieben wird. Vorzugsweise sollte die Verdünnungsrate wesentlich niedriger sein als die erwartete maximale Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorganismus. Bevorzugt wird eine Arbeitstemperatur über 4O⁰C und eine Verdünnungsrate im Bereich von 0,05 bis 0,15.

In der Entwicklungsphase kann unter den Bedingungen, die vorstehend allgemein für die Kulturvorbereitungsstufe beschrieben wurden, gearbeitet werden.

Als Stickstoffquelle wird in der Isolierungsphase ein Nitrat und in der Entwicklungsphase Ammoniak bevorzugt.

Die Produktionsstufe des Verfahrens kann in der Weise durchgeführt werden, wie vorstehend im Zusammenhang mit dem ersten Merkmal der Erfindung beschrieben.

Beispiel

A. Kulturvorbereitungsstufe 1) Isolierungsphase

Jeweils 500 ml einer Aufschlämmung von methanhaltigem Schlamm aus Teichen mit stillstehendem Wasser wurden in täglichen Abständen während einer Zeit von 5 Tagen einem

309836/0942

mit Rührwerk versehenen	belüfteter. Fermenter zugesetzt.	1600,0 mg/1
Der Fermonter hatte ein	Arbeitsvolumen von 5,0 1 und	2928,0 '·
enthielt 5,C 1 eines wässrigen Nährmediums der folgenden	1180,0 »
Zusammensetzung:	80,0 "
KH₂PO₄	14,0 »
Na₂HPO₄.12 H₂O	25,0 «
NaNO,	4,0 "
MgSO₄.7 H₂O	0,34 "
FeSO₄.7 H₂O	0,30 »
Ca(NO₃)₂.4 H₂O	0,24 "
CuSO₄.5 H₂O	zur Auffüllung auf 1 1
ZnSO₄.7 H₂O	6,25
MnSO₄-H₂O
Na₂MoO₄.2 H₂O
Entsalztes Wasser
p„-Wert

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45⁰C gehalten. Die Verdünnungsrate betrug 0,084/Std. und die Geschwindigkeit des Rührers 1000 UpM.

Der PjT-Wert wurde durch Zusatz von 0,5N-Natriumhydroxyd nach Bedarf bei 6,75 gehalten. Ein Gasgemisch, das aus 33 Vol.-56 Methan, 64 Vol.-g Luft und 3 Vol.-Jt Kohlendioxyd bestand, wurde dem Fermentereintritt in einer Menge von 20 V/V/Std. zugeführt. Unter diesen selektiven Bedingungen konnte sich eine Bakterienpopulation, die elementaren Stickstoff und Methan verwertet, natürlich entwickeln.

Nach einer Kultivierungsdauer von 7 Tagen unter Verwendung dieses Mediums unter den vorstehend genannten Bedingungen erreichte die Bakterienpopulation, die die nachstehend genannte Zusammensetzung hatte, eine Zelldichte von 1,0 g Trockengewicht/l. Aus dieser Population wurde ein elementaren Stickstoff und Methan verwertender Stamm von Bacterium isoliert. Andere Bakterientypen waren vorhanden, jedoch nicht in der Lage, Methan zu verwerten»

309835/0942

Das Ze.hlenverhältnis der elementaren Stickstoff und Methan verwertenden Bakterien zu den Zellen dieser anderen Bakterientypen betrug etwa 90:10 bis 95:5· Das Bacterium, das elementaren Stickstoff und Methan verwertete, war ein Coccus mit einem Durchmesser von etwa 1,1 bis 1,4 H. Das Coccus war kapselbildend und konnte sowohl Methan als auch Methanol, aber keine Glucose verwerten. Auf einem festen Medium, das durch Zusatz von 1»0 g Agar pro ml des vorstehend beschriebenen Nährmediums gebildet wurde, hatten die Kolonien nach Bebrütung für 10 Tage bei 45°C unter einer Atmosphäre von Methan und Luft (Volumenverhältnis 50:50) die nachstehend genannte Morphologie. Der Durchmesser betrug etwa 1 bis 2 mm, und das Aussehen war weiß, glatt und abgerundet. In diesen Eigenschaften gleicht das Bakterium dem Stamm Methylococcus capsulatus, der von J.W.Foster und R.H.Davis (1966), Journal of Bacteriologie 91_, 1924, und R.Whittenbury, K.C. Phillips und J.F. Wilkinson (1970), J.of Gen.Microbiology 6_1_, 205, beschrieben wird. Das Bacterium unterscheidet sich jedoch von der Beschreibung von Methylococcus capsulatus durch die vorstehend genannten Verfasser in den folgenden Eigenschaften:

1) Es verwertet elementaren Stickstoff als Stickstoffquelle.

2) Es verwertet Methanol.

3) Es bildet keine Cysten oder ruhende Phasen.

2) Entwicklungsphase

Die aus der Isolierungsphase erhaltenen 5,0 1 Kulturmedium, das die elementaren Stickstoff und Methan verwertende Bakterienpopulation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen Produktionsfermenters mit einem Arbeitsvolumen von 5,0 1 verwendet. Dem Fermenter wurde ein wässriges Nährmedium der folgenden Zusammensetzung kontinuierlich zugeführt:

309836/0942

— * 1

Na₂HPO₄.12 H₂O MgSO₄.7 H₂O H₂SO₄

CaCIo (wasserfrei)

FeSO₄.H₂O Na₂SO₄ (wasserfrei) CuSO₄.5 H₂O ZnSO₄.7 H₂O Na₂MoO₄.2 H₂O MnSO₄₀H₂O CoCl₂.6 H₂O

Wasser zur Auffüllung auf 1 1

etwa 2,0

2307692	mg/1
937,5	Il
787,5	Il
562,5	Il
706,0	Il
112,5	Il
42,7	Il
225,0	Il
20,5	Il
2,5	Il
1.5	Il
1,7	It
0,5

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45 C, einer Verdünnungsrate von 0,18 und einer Rührergeschwindigkeit von 3000 UpM betrieben. Dem Eintritt des Fermenters wurde das Gas in einer Menge von 66 V/V/Std. zugeführt. Das Gas bestand aus 18,2 Vol.-$ Methan und 18,8 Vol.-56 Luft. Der p_H-Wert wurde mit NaOH auf 6,5 eingestellt und anschließend durch Zusatz von 1,0 N-NaOH nach Bedarf entsprechend dem Signal einer automatischen Titrationsapparatur bei 6,5 gehalten.

Der Stickstoff wurde als Amraoniumhydroxyd (1,1N) zugeführt und in allmählich steigender Menge so in den Fermenter gepumpt, daß eine Zelldichte von etwa 13 g/l (Trockengewicht) aufgebaut wurde. Die "überschüssige" Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium wurde ermittelt, indem alle 5 Minuten eine Probe von 10 ml des Kulturmediums genommen und der Ammoniumionengehalt unter Anwendung der kolorimetrischen Methode bestimmt wurde, die von J.Paul in Analyst 1958, 37-42, oder G.Go Meynell und E.Meynell in "Theory and Practice of Experimental Bacteriology", Cambridge University Press 1965, beschrieben wird. Der "Überschuss" an Ammoniumionen im Kulturmedium wurde bei

309835/0942

einer Konzentration von 5 bis 10 mg/1 gehalten, indem die Menge, in der das Ammoniumhydroxyd in den Fermenter gepumpt wurde, von Hand geregelt wurde« Es ist auch möglich, die Ammoniumionenkonzentration des Kulturmediums durch eine "Ammoniaksonde" in Kombination mit einem p_H-Messer zu bestimmen, z.B. mit der Sonde, die von Electronic Instruments Ltd., (EIL) of Great Britain als Laboratoriumsmodell 8002-3 geliefert wird, in Kombination mit einem EIL-p^-Messer Modell 7030.

Nach Erreichen einer Zelldichte von 13,7 g/l wurde die Kultivierung beim stationären Zustand etwa 24 Stunden fortgesetzt. In dieser Phase war die Ammoniumhydroxydmenge, die in den Fermenter gepumpt wurde, mit Ausnahme kleiner Korrekturen praktisch konstant.

Die Bakterienzellenproduktion betrug 13,7 x 0,18 g (Trockengewicht/l pro Stunde). Der auf Methan bezogene Ausbeutefaktor, d.h. das Gewicht der erzeugten Zellen (Trockengewicht) pro Gewichtseinheit des dem Fermenter zugeführten Methans, betrug 0,63. Der auf Sauerstoff bezogene Ausbeutefaktor betrug 0,23.

3) Produktionsstufe

Die Ammoniumhydroxydzufuhr zum Fermenter, der unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen des stationären Zustandes betrieben wurde, wurde in drei Stufen um 1) etwa 30$, 2) 65$ und 3) 100$ verringert. In jedem Fall setzte die Gärung nach einigen Stunden bei einem neuen stationären Zustand mit einer niedrigeren Zelldichte und mit einer nicht feststellbaren niedrigen Ammoniumionenkonzentration in der Gärbrühe beim stationären Zustand erneut ein.

In der folgenden Tabelle sind die Betriebsdaten und Ergebnisse genannt, die bei kontinuierlichem Betrieb beim stationären Zustand in jeder Stufe (1, 2 und 3) erhalten wurden. Zum Verg-lei-cb-sind die Daten und Ergebnisse

309838/0942

genannt, die durch Betrieb beim stationären Zustand bei einem Amraoniumionenüberschuss in der Gärbrühe von 5 bis 15 mg/1 erhalten wurden.

309835/0942

Beispiel

Vergleichs-"beispiel 3 4

Zuführung von Stickstoff zum Fermenter als Ammoniak, mg/1 pro Stunde

Als Rohprotein aus dem Fermenter gewonnener Stickstoff, mg/1 pro Stunde

Im Fermenter als Ammoniak im ausgebrauchten Medium verlorener Stickstoff auf der Grundlage der Annahme, _ω daß 2 mg Ammoniumionen pro liter vorhanden sind,

mg/1 pro Stunde cc

co Reine Aufnahme von Stickstoff, der dem Fermenter als **> Ammoniak zugeführt wurde, durch die Mikroorganismen, mg/1 pro Stunde

Verdünnungsrate (Std." )

Zelldichte, g/l Zellproduktivität, g/l pro Stunde

Konzentration von Amminiumionen in der Gärbrühe, mg/1

Gesamtstickstoffgehalt der Zellen in fo auf Basis des Trockengewichts

Rohproteingehalt der Zellen in °J> auf Basis des Trockengewichts (Stickstoffgehalt χ 6,25) 158
240

0,33

64
219

0,33

204

keine Ammoniumionen durch die
Probenahmeapparatur nachgewiesen,
die eine niedrigere
Nachweisgrenze von
2 mg/1 hat

11,6

72,5

11,6

11.5

72,5 71,9

288

286

2,04

1	57	,7	63	,7	0,1	O	O	286
O	,1	76	0,1	74	9,	79	1	,180
1	1,	76	10,	84	1,	91		3,73
	2,	07	1,	89	77	2,47

12

11,6

72,5

Claims

Patentansprüche

1) Verfahren zur Umwandlung von Methan und elementarem Stickstoff in Proteinmaterial, wobei man in einem Fermenter einen elementaren Stickstoff und Methan verwertenden Mikroorganismus in einem wässrigen Nährraedium, das Nährsalze enthält, in Gegenwart von Methan als Kohlenstoffquelle und eines freien Sauerstoff und elementaren Stickstoff enthaltenden Gases kultiviert, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung kontinuierlich durchgeführt wird und die Menge des dem Fermenter als gebundener Stickstoff zugeführten Stickstoffs geringer ist als die Stickstoffmenge, die aus dem Fermenter als Rohprodukt gewonnen wird, oder daß dem Fermenter kein gebundener Stickstoff zugeführt wird.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,daß der gebundene Stickstoff im Kulturmedium in Form von Ammoniumionen in einer Konzentration von weniger als 2 mg/1 vorhanden ist.

3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Kulturvorbereitungsstufe einen elementaren Stickstoff und Methan verwertenden Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium, das Nährsalze enthält, in Gegenwart einer Stickstoffquelle vorzugsweise in Form von gebundenem Stickstoff und in Gegenwart von Methan als Kohlenstoffquelle und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases bis zu einer in einer Produktionsstufe erforderlichen Konzentration der Zellen des Mikroorganismus kultiviert und anschließend die Mikrobienzellen aus der Kulturvorbereitungsstufe kontinuierlich in einer Prcduktsionsstufe in einem wässrigen Nährmedium, das Nährsalze enthält, in Gegenwart von Methan als Kohlenstoffquelle und eines freien

309835/0942

— ι υ -

Sauerstoff und elementaren Stickstoff enthaltenden Gases kultiviert, wobei die Stickstoffmenge, die dem Ferraenter als gebundener Stickstoff zugeführt wird, geringer ist als die Stickstoffmenge, die aus dem Fermenter als Rohprotein gewonnen wird, oder wobei dem Fermenter kein gebundener Stickstoff zugeführt wird.

4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturvorbereitungsstufe in zwei aufeinanderfolgenden Phasen durchgeführt wird, nämlich in einer Isolierungsphase, in der ein Mikroorganismus, der elementaren Stickstoff und Methan verwertet, von einem den Mikroorganismus enthaltenden Material isoliert wird, und anschließend in einer Entwicklungsphase, in der die Konzentration der Zellen des Mikroorganismus auf die in der Produktionsstufe erforderliche Konzentration erhöht wird.

5) Verfahren nach Ansprüchen 3 und 4» dadurch gekennzeichnet, daß als Stickstoffquelle in der Isolierungsphase Nitrationen verwendet wird.

6) Verfahren nach Ansprüchen 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Stickstoffquelle in der Entwicklungsphase Ammoniumionen, die im Kulturmedium in einer Konzentration im Bereich von 2 bis 100 mg/1 vorhanden sind, verwendet wird.

7) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein elementaren Stickstoff und Methan verwertender Stamm von Methylococcus capsulatus verwendet wird.

309836/0942