DE2241258A1

DE2241258A1 - Kontinuierliches verfahren zur umwandlung von methan in eiweisstoffe durch kultivierung von methan verwertenden mikroorganismen

Info

Publication number: DE2241258A1
Application number: DE2241258A
Authority: DE
Inventors: Francis Moran; Philip Albert Myers
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1971-08-24
Filing date: 1972-08-22
Publication date: 1973-03-15
Also published as: GB1397735A; AU4578672A; US3816252A; BE787963A; IT1056025B; NL7211549A; JPS4828683A; DE2241258C3; AU461750B2; RO61625A; DE2241258B2; ES406391A1; AT315109B; HU167418B

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHONWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLDPSCH DIPL-ING. SELTING

5 KÖLN 1, DEICHMANNHAUS ' 224 1

Köln, den 16.8.1972 Kl/Ax

The British Petroleum Oompany Limited, Britannic House, Moor Lane, London EC2Y 9BU.(England)♦

Die Erfindung betrifft ein Fermeptatiansverfahren zur Umwandlung von Methan in Eiweißstoffe, insbesondere ein kontinuierliches Verfahren zur Erzeugung von Mikroorga-, nisinen unter Verwendung von Methan als Kohlenstoff quelle.

Für di$ Erzeugung von Mikroorganismen wurden bereits Verfahren beschrieben, bei denen Mikroorganismen, die Methan verwerten, in einem wässrigen Kulturmedium, das Nährsalze enthält, in Gegenwart von Methan und eines Gases, das freien Sauerstoff enthält, kultiviert werden. Bei diesen Verfahren werden Nitrate, Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat, oder Ammoniak oder ADimoniumhydroxyd als Stickfctoffquelle verwendet.

' Es wurce nun gefunden, daß.bei kontinuierlichen Verfahren die Verwendung von Ammoniumionen als Stickstoffquelle zu eintr Verlangsamung der Wachstumsgeschwindigkeit von Methan

verwertenden Mikroorganismen führt, was schließlich das Verschwinden des Mikroorganismus zur Folge hat, wenn nicht die nachstehend beschriebenen, von der Anmelderin entwickelten Maßnahmen ergriffen werden.

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Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Umwandlung von Methan in Eiweißstoffe nach einem kontinuierlichen Verfahren, bei dem man Methan verwertende Mikroorganismen kontinuierlich unter stationären oder stetigen Bedingungen bei einer Produktionsgeschwindigkeit von wenigstens 0,81 g (Trockengewicht) Mikroqrganismus/l/Stunde in einem wässrigen Kulturmedium, das Nährstoffsalze und Ammonium-Ionen enthält, in Gegenwart von Methan und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases kultiviert und den p^-Wert des Kulturmediums im Bereich von 4,5 bis 8,0 und die Ammoniumionenkonzentratlon im Bereich von 2 bis 100 mg/1 hält.

Dem Verfahren gemäß der Erfindung liegt die Feststellung zu Grunde, daß bei der kontinuierlichen Kultivierung mit hohen Produktionsgeschwindigkeiten beispielsweise im Bereich von 0,81 bis 5,0 g (Trockengewicht) Mikroorganismus pro l/Stunde die maximale Ammoniumionenkonzentration, die Methan verwertende Mikroorganismen im Kulturmedium tolerieren können, etwa 100 mg/1 beträgt. Es wurde gefunden, daß bei Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Methan verwertenden Mikroorganismen bei gegebenen Verdünnungsraten die Anwesenheit von Ammoniumionen oberhalb bestimmter entscheidend wichtiger Konzentrationen im Kulturmedium eine solche Erniedrigung der spezifischen Wachsturasgesohwindigkeit zur FoIgQ bat, daß die Kultur zum Verschwinden gebracht wird.

Sie Menge der Ammoniumionen sollte vorzugsweise 80 mg/1 nicht übersteigen und im Bereich von 2 bia 50 mg/1 gehalten werden. Man ist der Ansicht, daß unterhalb von 2 mg/1 das Wachstum durch Mangel an Ammoniakstickstoff begrenzt ist, jedoch ist dieser Wert nicht genau definiert worden und die Nachweisgrenze bei den zur Bestimmung von Ammoniumionen angewendeten Methoden. Bei der Durchführung des Verfahrene wird der größte Teil der Ammoniumionen, die dem wässrigen Kulturmedium Vorzugs-

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weise als Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd zugesetzt werden, unmittelbar durch die Mikroorganismen verwertet. Die verbleibenden Ammonium!oneπ werden dann innerhalb des erforderlichen Bereichs gehalten. In der Praxis wird das Verfahren gewöhnlich bei einer Ammoniumionenkonzentration von etwa 10 bis 30 mg/1 durchgeführt,,

Die Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium kann durch Entnahme von Proben des Kulturmediums in bestimmten. Abständen und anschließende quantitative chemische Bestimmung der Ammoniumionen ermittelt werden» Beispielsweise werden geeignete kolorimetrische Methoden auf der Grundlage der llesslBrisrerung von JVPaul (1958) in Analyst, 83, Seite 37-42, und G.G. Meynell und E.Meynell (1965) !Theory and Practice in Experimental Bacteriology, Cambridge University Press, beschrieben. Es ist auch möglich, eine Sonde, vorzugsweise eine "Ammoniaksonde", in Kombination mit einem p^-Meßgerät zur kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Bestimmung der Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium zu verwenden. Eine solche ' Sonde und ein solches p^-Meßgerät werden von Electronic Instruments Ltd₀ of Great Britain hergestellt. ,

Die Ammoniumionen werden vorzugsweise durch Zusatz von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd zum Kulturmedium eingeführt. Das Verfahren kann zweckmäßig nach einer der folgenden Methoden durchgeführt werden:

a) Der p„-V/ert des wässrigen Nährmediums, das dem Kulturmedium zugesetzt wird, wird begrenzt und der p_H-Wert des Kulturmediums durch Zusatz von Ammoniumionen in Abhängigkeit von p^-V/ertänderungen im Kulturmedium geregelt. Der p^-Wert des dem Kulturmedium zugesetzten wäasrigen Mediums wird so gewählt, daß die erhaltene Wasserstoffionenkonzentration im Kulturmedium nicht die Anwesenheit von mehr als 100 mg Ammonlumionen/1 zur Pß-Regelung erfordert. ■

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b) Die Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium wird entsprechend der Anzeige von Vorrichtun£en zur Bestimmung der Konzentration im Kulturmedium im Bereich von 2 bis 100 mg/1 gehalten. Der p_fi-Wert des Kulturmediums wird durch Zusatz von Alkali mit Ausnahme von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd oder 'durch Zusatz einer Säure geregelt»

Wenn Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd sowohl als Stickstoffquelle als auch als einziges Mittel zur Regelung des PtT-Werts des Kulturmediums nach der vorstehend beschriebenen Methode (a) verwendet wird, muß das dem Kulturmedium zugesetzte wässrige Nährmedium einen p^-Wert von weniger als 7,5 haben, wobei der p„-Wert so weit unter dem Pu-Wert des Kulturmediums liegen muß, daß eine solche Wasserstoffionenkonzentration im Kulturmedium erhalten wird, daß die Menge von Ammoniumionen, die zu jedem gegebenen Augenblick zur Einstellung des p^-Werts erforderlich ist, nicht über 100 mg/1 liegt.

Der p„-Wert des wässrigen Mediums liegt gewöhnlich im Bereich von 1,0 bis 7,5 und für die meisten praktischen Zwecke im Bereich von 2,0 bis 3,5.

Das wässrige Nährmedium kann aus beliebigen bekannten Medien, die für Fermentationen unter Verwendung von Methan als Kohlenstoffquelle verwendet werden und aus denen die Stickstoffquelle teilweise oder ganz weggelassen worden ist, ausgewählt werden oder darauf basieren. Die Menge jedes Nährstoffs muß so eingestellt werden, daß gewährleistet ist, daß das Medium unbegrenztes Wachstum des Mikroorganismus mit der gewünschten Geschwindigkeit ermöglicht.

Der natürliche p^-Wert des Mediums hängt von der Zusammensetzung der Nährsalze ab und kann für die Zwecke der Erfindung zu hoch oder zu niedrig sein. Demzufolge kann eine Säure oder ein Alkali zur Einstellung des gewUnsch-

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teri p_H-Werts erforderlich sein. Der ρττ-Wert eines Mediums, das Natrium- und/oder Kaliumphosphatsalze als Phosphatquelle enthält, kann zu hoch sein, so daß der Zusatz einer Säure, Z₀B. Schwefelsäure oder Phosphorsäure, notwendig ist. Andererseits kann der p^-Wert eines Mediums, das Phosphorsäure als Phosphat quelle enthält, zu' niedrig sein, so daß der Zusatz von Alkali, ZoB₀ vonNatriumhydroxyd, erforderlich sein kann« Der erforderliche p„-Wert des Mediums hängt von der Zelldichte und vom p^-Wert ab, bei dem· die Fermentation durchgeführt werden soll. Die Zelldichte kann beispielsweise abhängig sein von der Saueratoffübertragungsgeachwindigkeit, wobei Sauerstoff der begrenzende Nährstoff bei einer gegebenen ■Verdünnungsrate ist, oder von der Methanübertragungsgeschwindigkeit, wobei Methan der begrenzende'Nährstoff ist. Der erforderliche genaue p^-Wert kann empirisch durch einfache Versuche für jede bestimmte Kombination von Fermentationsbedingungen bestimmt ,werden.

Zweckmäßig kann Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd dem Kulturmedium in Abhängigkeit von einer automatischen Titrationsapparatur zugesetzt werden. Diese Apparatur ist mit e^iner Elektrode zur Messung der p„-Wertänderung im Kulturmedium und Mitteln zum Zusatz von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd zum Kulturmedium in Abhängigkeit von diesen Änderungen versehen, so daß ein gewünschter p_H-¥ert während der Fermentation aufrecht erhalten wird.

Die in dieser Weise zugesetzte Ammoniak- oder Aramoniumhydroxydmenge entspricht der Summe der Menge von Ammoniumionen, die für unbegrenztes Wachstum des Mikroorganismus erforderlich ist, und dor Menge, die zur Regelung des pjj-Werts durch Neutralisation der überschüssigen Wasserstoffionen, die aus dem wässrigen Medium stammen, das dem Kulturmedium als Nährstoff zugesetzt wird, erforderlich ist.

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Wenn ein wässriges Nährmedium ohne die vorstehend "beschriebene p„-Wertbegrenzung verwendet werden soll, kann nach der Methode (b) gearbeitet werden. Bei dieser Methode wird der Py-Wert des Kulturmediums durch Zusatz einer Säure oder eines Alkalis mit Ausnahme von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd im Bereich von 4»5 bis 8,0 und die Ammoniumionenkonzentration des Nährmediums vorzugsweise durch Zusatz von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd in Abhängigkeit von der Anzeige der Apparatur zur Bestimmung der Ammoniuraionenkonzentration im Kulturmedium im Bereich von 2 bis 100 mg/1 gehalten. Die Ammoniumionenkonzentration des Nährmediuras kann nach den vorstehend beschriebenen Methoden bestimmt werdeno

Ammoniumhydroxyd kann dem Nährmedium oder dem Kulturmedium vorzugsweise mit einer Pumpe, z.B. einer üblichen Dosierpumpe, zugesetzt werden, wobei die Ausflußmenge der Pumpe entweder von Hand oder automatisch in Abhängigkeit von der bestimmten Amraoniumionenkonzentration im Kulturmedium geregelt wird. Flüssiges oder gasförmiges Ammoniak kann dem Medium oder dem Kulturmedium mit Hilfe eines üblichen Mengenmessers zudosiert werden. ι

Als Alkali, daa mit Ausnahme von Ammoniak oder Ammoniumhydroxyd zur Regelung des PjT-Werts des Kulturmediums verwendet wird, eignen eich Alkalihydroxyde, z.B. Natriumhydroxyd. Als Säuren eignen sich beispielsweise Schwefelsäure und Phosphorsäure.

Die vorstehend beschriebene Arbeitsweise erleichtert die Verwendung eines Mediums, das einen beliebigen p„-Vi/ert hat, jedoch wird ein Medium mit einem p„-Wert unter 4,0 bevorzugt, um die Mineralsalze in lösung zu halten. Bei Durchführung des Verfahrens nach einer der vorstehend beschriebenen Methoden liegt die obere Grenze des p„-Wertes des Kulturmediums zweckmäßig bei 715, vorzugsweise im Bereich von 5,0 bis 7,0.

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_ 7 —

Die Arbeitstemperatur kann im Bereich von 30 bis 48 C liegen» Bei Verwendung von Methylococcus capsulatus wird vorzugsweise bei einem p_w-Wert im Bereich von 6,0

■ ο bis 7,0 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa bis 48⁰C gearbeitete

Das Verfahren wird normalerweise bei Normaldruck durchgeführt, jedoch kann auch bei Drücken bis etwa 3,5 atü gearbeitet werden»

Normalerweise sollte bei Verwendung von Luft-Methan-Gemischen der Sauerstoffgehalt etwa 10 bis 19$, vorzugsweise etwa 16 bis 18 Vol»-$, und der Methangehalt etwa 10 bis 50$, vorzugsweise 15 bis 25 Vol.-$ betragen. Das Methan kann in methanhaltigen Gasen, z.B. Erdgas, vorhanden sein_o Mit Sauerstoff angereicherte Gase, z,B₀ mit Sauerstoff angereicherte Luft, können verwendet werden.

Die Bedingungen, unter denen das Verfahren durchgeführt werden kann, sind selektiv für Mikroorganismen, die Methan verwerten. Es ist nicht notwendig, die Fermentation aseptisch durchzuführen. Hauptsächlich aus wirt-7 schaftlichen Gründen wird nicht-keimfreies Arbeiten bevorzugt.

Die Mikroorganismen können vom Kulturmedium nach bekannten Verfahren, z„B. durch Zentrifugieren und/oder Filtration, die mit einer Ausflockungsstufe kombiniert werden können, abgetrennt werden.

Die Methan verwertenden Mikroorganismen können unter Anwendung beliebiger bekannter Isoliermethoden für diesen Typ von Mikroorganismen erhalten werden» Geeignete Methoden v/erden von Sheehan und Johnson in "Applied Microbiology» 2j_, Nr.3, 1971, Seite 511-515, und von V/hittenbury in Journal of General Microbiology 1970, 61, Seite 205-218, beschrieben» Bevorzugt als Bakterium

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wird Methylococcua capsulatus. Die Anreioherungstechniken sind ein besonders zweckmäßiger Y/e» zur Erzielung von Mikrobenpopulationen, die Methan verwertende Mikroorganismen für die Verwendung beim Verfahren gemäß der Erfindung enthalten«

Beispiel 1

Stufe A: Methode zur Gewinnung einer Kultur von Methan verwertenden Bakterien für die Verwendung beim Verfahren

Jeweils 500 ml einer Aufschlämmung von methanhaltigera Schlamm aus stillstehenden Becken wurden in Abständen von einem Tag während einer Zeit von 5 Tagen zu einem belüfteten und gerührten Fermenter gegeben, der ein Arbeitsvolumen von 3,0 1 hatte und 3,0 1 eines wässrigen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt:

KH₂PO₄ ' 1600.0 mg/1

Na₂HPO₄.12 H₂O 2928,0 "

NaNO₅ 1180,0 "

MgSO₄.7 H₂O 80,0 "

PeSO₄.7 H₂O 14,0 '·

Ca(N0₃)₂.4 H₂O 25,0 »

CuSO₄.5 H₂O 4,0 "

ZnSO₄.7 H₂O 0,34 "

MnSO₄₀H₂O 0,30 ·»

Na₂MoO₄.2 H₂O 0,24 "

Entmineralisiertes und entsalztes

Wasser bis 1000 ml

P_H-Wert 6,0

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45°C, einer Verdünnungsrate von 0,084/Stunde und einer Rührerdrehzahl von 100Ü UpM gehalten.

Der p^-Wert wurde durch Zusatz von 0,5 N-Natriumhydroxyd nach Bedarf bei 6,7 gehalten. Ein Gasgemisch aus 33 Vol.-¹,* Methan, 64 VoI„~<p Luft und 3 VoI.-^ Kohlendioxyd wurde in den Eintritt des Fermenters in einer Menge von 20 V/V/

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_ 9 —

Stunde eingeführt.

Eine Methan verwertende Bakterienpopulation wurde der natürlichen Entwicklung unter diesen selektiven Bedingungen überlassen.

Nach einer Betriebszeit von 7 · Tagen unter Verwendung dieses Mediums unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen erreichte die Bakterienpopulation eine Zelldichte von 1,0 g Trockengewicht/Ι» Diese Population hatte die nachstehend genannte Zusammensetzung. Nur ein Methan verwertender Bakterienstamm konnte von dieser Population isoliert werden. Die anderen Bakterientypen waren nicht in der Lage, Methan zu verwertenο Der Anteil der Methan verwertenden Bakterien an den anderen Bakterientypen "betrug zahlenmäßig etwa 90 bis 95$ ο Das Methan verwertende Bakterium war ein Coccus mit -einem Durchmesser von etwa 1,1 "bis 1,4 Ά* Er war kapselbildend und konnte sowohl Methan als auch Methanol, aber keine Glucose verwerten. Auf einem festen Medium, hergestellt durch Zusatz von 1,0$ (Gewicht/Volumen) Agar zum eingangs beschriebenen Fermentationsmedium, hatten die Kolonien nach Bebrütung für 3 bis 4 Tage bei 45⁰C unter einer¹ Methan-Luft-Atmosphäre (Volumenverhältnis 1:1) die folgende Morphologie: Der Durchmesser betrug etwa 1 bis 2 mm, und das Aussehen war weiß, glatt und abgerundet. Diese Merkmale stimmen in jeder Hinsicht mit den Merkmalen eines Stammes von Methylococcus capsulatus überein, die von JoW. Poster und R.H. Davis in Journal of Bacteriology 91 (1966), Seite 1924, und von R. Y/hittenbury, K₀C₀ Phillips und J.F.Wilkinson in Journal of General Microbiology 61 (1970), Seite 205, beschrieben wurden.

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Stufe B: Zwischenstufe zum Aufbau der Zelldichte für Betrieb unter stationären Bedingungen,

3,0 1 Kulturmedium, das die gemäß Stufe A erhaltene, Methan verwertende Bakterienpopulation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen, mit Rührer versehenen Fermenters verwendet, der ein Arbeitsvolumen von 3,0 1 hatte. Ein wässriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Permenter kontinuierlich zugeführt:

KH₂PO₄ 555 _to mg/1

Na₂HPO₄.12 H₂O 277,5 "

NaNO^ 1193,8 «·

MgSO₄.7 H₂O _i6OjO 11

Ca(N0₅)₂-4 H₂O _9OfO „

CuSO₄.5 H₂O 4-,6 "

FeSO₄-7H₂O _14f5 .1

ZnSO₄-7H₂O 0,6 »

MnSO₄-H₂O _0>8 11

CoCl₂-6 H₂O 0,03 "

Na₃MoO₄.2 H₂O 0,3 "

H₂SO₄ (36N) 0,34 ml/1'

HNO₅ (13,6N) 5,1 «·

Entmineralisiertes und ^g 1000 ml entsalztes Wasser

P_H-Wert ¹»⁵

"Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45⁰C, einer Verdünnungsrate von 0,18 und einer Rührergeschwindigkeit von 1500 UpM gehalten. Gas wurde dem Fermenter in einer Menge von 30 V/V/Stunde zugeführt. Das Gas bestand aus 20 Vol.-# Methan und 80 Vol.-ji Luft. Nach den ersten wenigen Minuten, in denen der p_H~Wert mit 1,0 N-HaOH geregelt wurde, wurde der p^-Wert durch Zusatz von 1,0 N-H₂SO^ oder 1,0 N-NaOH nach Bedarf aus einer automatischen Titrationsapparatur bei 6,0 gehalten. Die Fermentation wurde durchgeführt, bis die Zelldichte auf etwa 5,0 g/l (Trockengewicht) gestiegen war. Dann wurde auf ein Medium

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der folgenden Zusammensetzung übergegangen:

H^PO₄	·7Η	·6Η	2°
MgSO₄
KCl	·7Η	2°
PeSO₄
CaCl₂	·5Η	2°
CuSO₄	·7Η
ZnSO₄	-H₂	0
MnSOi₁	Na₂MoO₄ -	2H₂O
	CoCl₂	2°

NaOH

Entsalztes und entmineralisiertes Wasser

722,5	mg/1
375,0	Il
250,0	Il
37,5	Il
75,0	Il
15,0	It
2,25	Il
0,75	Il
1,0	Il
0,35	Il
250,0	Il
bis 1000 nil
3,0

Stufe C: Betrieb unter stationären Bedingungen unter Verwendung von Ammoniumhydroxyd sowohl als Stickstoffquelle als auch zur p^-Regelung des Kulturmediums

Der Pjj-V/ert wurde durch Zusatz von 1,1 Itf-Ammoniumhydroxyd aus einer automatischen Titrationsapparatur in Abhängigkeit von den Pjj-Änderungen" im Kulturmedium bei 6₅O gehalten. Die Fermentation wurde wenigstens 7 Tage unter stationären Bedingungen durchgeführt. Die Zelldichte unter diesen Bedingungen stabilisierte sich bei etwa 5,0 g/l, wobei Bakterienzellen mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,9 g (Trockengewicht) pro Liter und Stunde erhalten wurde«, Der auf Methan bezogene Ausbeutefaktor, doh. das Gewicht der Zellen (Trockengewicht), die pro Gewichtseinheit des bei der Fermentation verbrauchten Methana erzeugt wurde, betrug 0,66. Der auf Sauerstoff bezogene Ausbeutefaktor betrug 0,21»

Die folgenden Ergebnisse sind typisch für die während des Versuche erhaltentm Resultate:

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Zeit Std.	Zufuhr des Nährmediums, ml/Stunde	Zelldichte, g/l	■überschüssige NH. - Konzentration im Kulturmedium, mg/1
O	510	4,9	16,2
12	510	5,1	7,5
24	510	4,9	12,3
36	510	5,0	10,9
48	510	5,2	9,2
60	510	5,1	20,3
72	510	• 4,9	31,7
84	510	5,0	25,5
96	510	5,0	18,4

Die überschüssige Ammoniumionenkonzentration wurde in 10 ml-Proben des Kulturmediums nach einer kolorimetrischen Methode bestimmt.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß durch Verwendung eines Mediums mit einem genauen Pj--Wert, der speziell auf eine Fermentation unter ganz bestimmten stationären Bedingungen abgestimmt ist, die überschüssige Acidität im Kulturmedium auf eine Höhe begrenzt wird, die nur eine sehr begrenzte Neutralisation durch Ammoniumhydroxyd erfordert. Diese Ammoniumhydroxydmenge führt zu einer überschüssigen Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium, die normalerweise zwischen 7,5 und 31,7 mg/1 liegt. Die Hauptmenge des der Fermentation zugeführten Ammoniumhydroxyds wurde sofort als Stickstoffquelle für das Wachstum der Methan verwertenden Bakterienkultur ausgenutzt.

Beispiel 2

3,0 1 eines Kulturmediums, das die Methan verwertende Bakterienpopulation enthielt, die gemäß den Isolier- und Zelldichte-Aufbaustufen A und B von Beispiel 1 erhalten wurde, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen Produktionsferoenters mit einem Arbeitsvolumen von 3,0 verwendet. Ein wässriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt:

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335,0 mg/1

012 H₂O 277,5 "

₄H₂O 200,0

CaGl₂ 50,0

NaSO₄ (wasserfrei) 500,0 "

ZnSO₄.7H₂O 5,0 »

CuSO₄C5 H₂O 2,0 ""

MnSO₄H₂O 0,2 "

NaMoO₄.2 H₂O ' 3,0 »

CoCl₂.6 H₂O 0,01 ■'

FeSO₄.7 H₂O 5,0 "

H S0_A ■ 2,3 Milliäquivalent/1

Entmineralisiertes und zur Auffüllung auf 1 entsalztes Wasser

P_H 3,1

Stufe C: Betrieb unter stationären Bedingungen unter Verwendung von Amnioniumhydroxyd sowohl als Stickstoffquelle als auch zur p^-Regelung des Kulturmediums

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45⁰C, einer Verdünnungsrate von 0,18 und einer Rührergeschv/indigkeit von 15OO UpM gehalten. Gas wurde dem Fermenter in einer Menge von 30 V/V/Stunde zugeführt. Das Gas bestand aus 20 VoX.-5t Methan und 80 VoX.-# Luft.

Der PjT-Wert wurde durch Zusatz von 1,1 N-Ammoniumhydroxyd nach Bedarf bei 6,0 gehalten. Die Fermentation wurde unter stationären Bedingungen für eine Zeit von 7 Tagen durchgeführt« Die Zelldichte unter diesen Bedingungen betrug 4,5 g/l, wobei BakterienzeXXen in einer Menge von 0,81 g (Trockengewicht) pro Liter und Stunde erzeugt wurden. Der auf Methan bezogene Ausbeutefaktor, d.h. das Gewicht der Zellen (Trockengewicht)„ das pro Gewichtseinheit des dem iermenter zugeführten Methans erzeugt wurde,.betrug 0,66. Der auf Sauerstoff bezogene Ausbeutefaktor betrug 0,21.

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Durch Zusatz eines wässrigen Nährmediums, das einen p_H-Wert von 3,1 hatte und 2,3 Milliäquivalent H_pSOj,/l enthielt, zum Kulturmedium bei einer Verdünnungsrate von 0,18/Stunde war die resultierende Y/asserstoff ionenkonzentration in der wässrigen Phase derart, daß die Ammoniumionenmenge, die in der wässrigen Phase in jedem gegebenen Augenblick: erforderlich war, um den p_H-Wert während des kontinuierlichen Betriebs unter stationären Bedingungen bei 6 zu halten, im Bereich von 5,0 bis 50 mg/1 variierte. Das Ammoniumhydroxyd wurde sowohl als Stickstoffquelle als auch als Mittel zur Regelung des p_H-Wertes des Kulturmediums verwendet.

Beispiel 3

Stufe Bj Zwischenstufe zum Aufbau der Zelldichte für Betrieb unter stationären Bedingungen

5,0 1 Kulturmedium, das die Methan verwertende und gemäß Stufe A von Beispiel 1 erhaltene Bakterienpopulation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen, mit Rührer versehenen Fermenters verwendet, der ein Arbeitsvolumen von 5,0 1 hatte. Ein wässriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt:

KH₂PO₄	V	12 H₂O
Na₂HPO
NaNO,	7 :	H₂O
MgSO₄.	_p)₂	• 4 H₂O
Ca(NO-,	5	H₂O
CuSO₄ -	7H	2°
FeSO₄-	7H	2°
ZnSO₄·	H₂	0
MnSO₄·	6	H₂O
CoCl₂-	V	2 H₂O 6ν}
Na₂MoC		V/ill J ,6N)
HNO, (

782,0	mg/1
647,5	11
2785,5	Il
373,0	It
210,0	It
10,6	tt
33,8	It
1,3	Il
1,8	11
0,06	tt
0,75	Il
0,8	ml/1
7,3	Il

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Entmineralisiertes und

entsalztes Wasser bis 1000 ml

P_H . 1,3

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45 C, einer

—1

Verdünnungsrate von 0,18 h und einer Rübrergescbwindigkeit von 3000 UpM betriebene Gas wurde dem Eintritt des Fermenters in einer Menge von 66 V/V und Stunde zugeführt. Das Gas bestand aus 18,2'Vol.-# Methan und 81,8 YoI.-°/° Luft. Der Pjj-Wert wurde auf 6,1 eingestellt und anschliessend durch Zusatz von 1,0 N-H₂SO₄ oder 1,C K-KaOH nach Bedarf aus einer automatischen Titrationsapparatur bei 6,1 gehalten.

Unter diesen Bedingungen stieg die Zelldichte allmählich auf etwa 14 g (Trockengewicht) pro Liter. In dieser Phase wurde auf ein Medium der folgenden Zusammensetzung übergegangen:

KH₂PO₄ 937,5 mg/1

Na₂HPO₄₀12 H₂O ' 787,5 "

MgSO₄₀7 H₂O 562,5 "

FeS0_4O7 H₂O 50,6 " ,

CaCl₂ 112,5 "

CuSO₄ ο 5 H₂O 20,5 "

2,5 "

MnSO,_oH₉0 1,7 »

Na₂MoO₄„2 H₂O . 1,5 »

CoCl_2O6 H₂O 0,5 "

Na₂SO₄ 225,0 "

H₂SO₄ (36 N) . 0,2 ml/1

Entmineralisiertes und

entsalztes Wasser bis 1000 ml

2,6

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Stufe Ci Betrieb unter stationären Bedingungen unter Verwendung von Ammoniumhydroxyd Bowohl als Stickatoffquelle als auch zur ρ,,-Regelung dea Kulturmediums

Der p„-'Wert des Kulturmediums wurde durch Zusatz von 1,1 N-IIH, OH-Lösu ng aus einer automatischen Titrationaapparatur in Abhängigkeit von p_H-Änderungen im Kulturmedium bei 6,1 gehalten. Das Ammoniumhydroxyd diente sowohl als Stickstof'fquelle für das Wachstum ale auch als Neutralisationsnittel.

Die Zel.ldichte stabilisierte sich unter diesen Bedingungen bei etwa 14g (Trockengewicht)/l. Die Fermentation wurde unter stationären Bedingungen für wenigstens 7 Üage durchgeführt. Die Bakterienzellen wurden mit einer Geschwindigkeit von etwa 2,5 g (Trockgengewicht) pro liter und Stunde erzeugt. Die überschüssige Ammoniumionenkonzentration in Kulturmedium wurde nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode bestimmt. Die folgenden Ergebnisse sind typisch für die während des Versuchs erhaltenen Resultate:

te, Überschüssige NHU⁺i-Kon-

zentration Im Kult urnedluaj mg/1

14,4 11,5 9,2 10,4 18,3 17,6 20,4 21,2 10,5

Zeit Std.	Zufuhr von Nährmedium, ml/Std.	Zelldi £/1
0	820	14,1
12	Il	14,0
24	Il	14,1
36	ti	14,0
48	η	14,0
60	Il	14,1
72	It	14,2
84	Il	14,1
96	Il	14,0

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Beispiel 4

Stufe Bi Zwischenstufe zum Aufbau der Zelldiohte für Betrieb unter stationären Bedingungen

5,0 1 Kulturmedium, das die gemäß Stufe A von Beispiel 1 erhaltene, Methan assimilierende Bakterienpopulation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich "betriebenen, mit Rührer versehenen Fermenters verwendet, der ein Arbeitsvolumen von 5,0 1 hatte. Ein wässriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt:

KH₂PO₄	782,0	ng/1	ml
Na₂HPO₄.12 HgO	647,5	π
NaNO,	2785,5	Il
MgSO₄.7 H₂O	373,0	U
Ca(NO^)₂-4 H₂O	210,0	It
CuSO₂₁.5 HpO	10,6	Il
PeSO₄-7H₂O	33,8	Il
ZnSO₄-7H₂O	1,3	It
MnSO₄-H₂O	1,8	IS
CoCl₂-6 H₂O	0_B06	IS
¹ Na₀MoO₂₁-S HpO	O_s75	SJ
H₂SO₄ (36N)	0,8	ml/1
HNO₃ (D,6N)	7,3	Ii
Entmineralisiertes und
entsalztes Wasser	bis 1000
p„~Wert	•» j

Der Permenter wurde bei einer Temperatur von 45 C_s einer Verdünnungsrate von 0_s10 h~ und einer Rührergeschwindigkeit von 3000 UpM betrieben« Gas würde dem Eintritt des Fermenters in einer Menge von 66 V/V/Stunde zugeführt* Das Gas bestand aus 18_S2 Yol₀-$ Methan und 81_a8 Vol_o-$ Luft. Der p^-Wert wurde auf 6_S1 eingestellt und dann durch Zusatz von 1,0N-H₉SO, oder 1,0 N-KaOH-Lb"sung (nach Bedarf) aus einer automatischen Titrationsapparatur bei 6,1 gehalten.

-308811/0^1©

Unter dienen Bedingungen stieg die Zelldichte allmählich auf etwa 25 g (Trockengewicht)/!. In dieser Phase wurde auf ein Medium der folgenden Zusammensetzung übergegangen}

KiI₂PO₄ 1875,0 mg/1

Na₂HPO₄.12H₂O 1575,0 »

MgSO₄.7H₂O ' 1125,0 «

FeSO₄.7H₂O 101,4 "

CaCl₂ 225,0 "

CuSO₄.5H₂O 41,0 "

ZnSO₄.7H₂O 5,0 "

MnSO₄-H₂O 3,4 ⁿ

Na₂MoO₄.2H₂O 2,9 ^w

CoCl₂-OH₂O 1,0 "

Na₂SO₄ 450,0 »

H₂SO₄ (36N) 0,4 ml/1

Entsalztes und entminerali-

siertes Wasser bis 1000 ml

P_H-Wert 2,3

Stufe G: Betrieb unter stationären Bedingungen unter Verwendung von Ammoniumhydroxyd sowohl als Stickstoffquelle als auch zur p„-Regelung des Kulturmediums *

Der p,,~V/ert des Kulturmediums wurde durch Zusatz von 1,1 N-NH.OH-Lösung aus einer automatischen Titrationsapparatur in Abhängigkeit von den p„—Änderungen im Kulturmedium bei 6,1 gehalten. Das Ammoniumhydroxyd diente sowohl als Stickstof f quelle 'für das V/ach st um ale auch als Neutralisationsmittel,

Die Zeildichte stabilisierte sich unter diesen Bedingungen bei etwa 25,0 g (Trockengewicht)/l. Die Fermentation wurde unter stationären Bedingungen für eine Zeit von wenigstens 7 xagen Durchgeführt. Die Erzeugung an Bakterienzellen betrug' etwa 2,5 g (Trοckgeηgewicht) ρr0 Liter und Stunde. 1) i f! üb e ι: ί j c h ti a 3 χ g e A m in o-n i u m i ο η e η lc ο η ζ ο 111 r a t i ο η i ia Ku 11 urin edium wurde nach einer kο 1 οrίmetrί schen Meth0de be3tiinnit.

308811/0718

Die folgenden Ergebnisse sind typisch für die während des Versuchs erhaltenen Resultate;

Zeit Zufuhr von Zelldichte, Überschüssige NH.-Koηzeη-Std. Nährmedium g/l tration im Kulturmedium, ml/Std c ; mg/1

O	415	25,0 '	21,6
12	Il	25,0	22,0
24	Il	24,5	- 18,0
36	Il	• 25,0	19,5
48	Il	25,5	17,2
60	Il	25,0	22,0
72	H	24,5	25,0
84	It	24,5	30,2
96	Il	25,0	30,0
		Beispiel 5

Stufe A: Methode zur Gewinnung einer Kultur von Methan verwertenden Bakterien für die Verwendung beim Verfahren gemäß der Erfindung - .

Aufschlämmungen von je 500 ml von methanhaltigem Schlamm aus stehenden Becken wurden in täglichen Abständen für eine Zeit von 5 Tagen zu einem belüfteten und gerührten Fermenter gegeben. Der Fermenter hatte ein Arbeitsvolumen von 5,0 1 und enthielt 5,0 1 eines wässrigen Mediums der folgenden Zusammensetzung:

KH₂PO₄

₂₄12 H₂O NaNO₃

MgSO₄ο7 H₂O FeSO₄.7 H₂O Ca(N0₅)₂o4 H₂O CuSO₄.5 H₂O ZnSO₄ ο7 H₂O MnSO₄₀H₂O Ka₂MoO₄ ο 2 H₂O En t ra i η e ra ] .1 π i. 0 r tea und entealzton Wau8 er

1600,0 mg/1	M
2928,0	Il
1180,0	Il
80,0	Il
14,0	Il
25,0	Il
4,0	Il
0,34	Il
0,30	Il
0,24	zur Auffüllunf- auf 1 Liter

3 0 8811/0718

P_H 6,25

Der Perme nt ei¹ wurde "bei einer Temperatur von 45 0, einer Verdünnungarate von 0,084/Stunde und einer Rührergecchwindigkeit von 1000 UpM gehalten.

Der Pu-Wert wurde durch Zusatz von 0,5 N-Hatriumhydroxyd nach Bedarf bei 6,75 gehalten. Ein Gasgemisch, das aus 33 Vol.-# Methan, 64 Vol.-⁰/» Luft und 3 VoI.-^ Kohlendioxyd bestand, wurde dem Eintritt dea I'ermenters in einer Menge von 20 V/V/Stunde zugeführt,.

Nach einer Betriebsdauer von 7 Tagen unter Verwendung dieses Mediums unter den vorstehend genannten Bedingungen erreichte die Bakterienpopulation eine Zelldichte von 1,10 g (Trockengewicht) pro Liter. Sie hatte die nachstehend genannte Zusammensetzung. Nur ein Methan verwertender Stamm von Bakterium konnte aus dieser Population isoliert werden. Die anderen Bakterienarten vermochten Methan nicht zu verwerten. Der Anteil der Methan verwertenden Bakterien an den anderen Bakterienarten betrug zahlenmäßig etwa 90 bis 95$. Das Methan verwertende Bakterium war ein Coccus mit einem Durchmesser von etv/a 1,1 bis 1,4yU. Er war kapselbildend und konnte sowohl Methan als auch Methanol, aber keine Glucose verwerten. Auf einem festen Medium, hergestellt durch Zusatz von 1,0^o (Gew.-/Vol„) Agar zu dem zu Beginn beschriebenen Fermentationsinedium hatten die Kolonien nach einer Be- ' brütungsdauer von 3 bis 4 Tagen bei A5 C unter einer Atmosphäre von Methan und Luft (Volumenverhältnis 50:50) die folgende; Morphologie: Der Durchmesser betrug etwa 1 bis ? um, und das Aussehen war weiß, ^lati; und obgeri.'rutotc Di(UO J-.erkm-i.l π stimmen in ;i<;dor Hi ns ich t mit den 1·Η.:]·Ι\ΐΐι;ι1ι;η (.:Jnc:; Jtnm.vitis von Mothyloeoccus cajsulntus

tvin, lit'i- von c"\v;„Foiiter und K.lUDovJs in J.Bact.Vol.91, 30981 1/0718

(1955) 1924, und R.Whittenbury, _.G,Phillip3 und J.P. Wilkinson in JcGen „Microbiology, 6_. (1970) 205, "beschrieben wurde.

Stufe Bi Zwischenstufe zum Aufbau der Zelldichte für Betrieb unter stationären Bedingungen

5 1 Kulturmedium, das die in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene}, Methan verwertende Bakterienpopulation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen Produktionsfermenters mit einem Arbeitsvolumen von 5,0 1 verwendet» Ein wässriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt}

KH₂PO₄	937,5	mg/1
Na₂HPO₄.12 H₂O	787,5	Il
MgSO₄„7 H₂O	562,5	t!
H₂SO₄	706,0	Il
CaCIp (wasserfrei)	112,5	ti
FeSO₄.7 H₂O	42_f7	If
Na₂SO₄ (wasserfrei)	225,0	η
CuSO₄.5 H₂O	20,5	η
ZnSO₄.7 H₂O	2,5	η
Na₂MoO₄.2 H₂O	1,5	It
MnSO₄-H₂O	1*7	Si
CoCl₂06 H₂O	0,5	Il
Wasser	zur Auffüllung auf 1 1
PtT-We rt	etwa 2,6

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45°C_S einer Verdünnungsrate von 0,18 und einer Rührergeschwindigkeit von 3000 UpM betrieben.« Gas in einer Menge von 6.6 V/V/Std. wurde dem Eintritt des Fermenters zugeführt. Das Gas bestand aus 18_S2 Vol.-56-Methan und 81,8 Vol.-# Luft. Der P_H-Wert wurde mit NaOH auf 6,5 eingestellt und anschliessend bei 6,5 gehalten, indem 1,0 Ii-NaOH nach Bedarf aus einer automatischen Titrationsapparatur zugesetzt wurde.

3098 Ί1/Q? Ί β · -

Der Stickstoff wurde als Ammoniumhydroxyd (1,1 N) zugeführt, das in den Fermenter in allmählich steigender Menge so eingeführt wurde, daß eine Zelldichte von etwa

10 g (Trockengewicht) aufgebaut wurde. Die "überschüssige" Arr.Goniumionenkonzentration im Kulturmedium wurde ermittelt, indem alle 10 Minuten 10 ml Kulturmedium entnommen wurden und dann die Ammoniumionenkonzentration nach der kolorimetrischen Methode bestimmt wurde, die von J.Paul in Analyst §2 (1958) 37-42 (oder G.G.Maynell und E.Maynell

¹¹ Theory and Practice of Experimental Bacteriology, Cambridge University Press), beschrieben wird. Es ist auch möglich, die Ammoniumionenkonzentration mit einer "Ammoniaksonde" in Kombination mit einem Pjj-Meßgerät zu bestimmen, z.B. mit der Sonde der Electronic Instruments Ltd. (EIL) of Great Britain als Laboratoriumsmodell 8002-3 in Kombination mit einem EIL-p„-Meßgerät Modell 7030. Der "Überschuß" der Ammoniumionen im Kulturmedium wurde bei einer Konzentration von 5-10 mg/1 gehalten, indem die Menge, in der das Ammoniumhydroxyd in den Fermenter gepumpt wurde, von Hand geregelt wurde.

Stufe C: Betrieb unter stationären Bedingungen unter Verwendung von Ammoniumhydroxyd als Stickstoffquelle mit einer unabhängigen p„~Regelung unter Verwendung von Natriumhydroxyd

Als die Zelldichte des Fernenters in der Stufe B 13,5 g/l erreicht hatte, wurde mit dem Betrieb unter stationären Bedingungen begonnen, wobei unter den gleichen Fermentationsbedingungen, wie sie für die Stufe B beschrieben wurden, gearbeitet wurde. Der "Überschuß" an Ammoniumionen wurde mit Hilfe einer der oben beschriebenen Methoden bei einer Konzentration zwischen 5 und 10 mg/1 gehalten. In dieser Phase war die Menge pro Zeiteinheit, in der aas Ammoniumhydroxyd in den Fermenter gepumpt wurde, mit Ausnahme von kleinen Korrekturen praktisch konstant.

30981 1/07 18

Die Fermentation wurde untf?r stationären Bedingungen 17 Tage durchgeführt. Die ZellcTichte unter den vorstehend genannten Bedingungen "betrug 13_S5 g/l bei einer Produktionsgeschwindigkeit an Bakterienzellen von 13,5 x 0,18 g (Trockengewicht) pro Liter und Stunde. lie auf Methan "bezogene Ausbeute, d.h. das Gewicht der Zellen (Trockengewicht), die pro Gewichtseinheit des dem Fermenter zugeführten Kethans erzeugt wurden, betrug 0,63» Die auf Sauerstoff "bezogene Ausbeute betriig 0,23.

Beispiel 6

Stufe B: Zwischenstufe zum Aufbau der Zelldichte für den Betrieb unter stationären Bedingungen

3,0 1 Kulturmedium, d&.s die gemäß Stufe A von Beispiel 1 erhaltene, Methan verwertende Bakterienpopulation enthielt, wurden zum Anfahren eines kontinuierlich unter Rühren "betriebenen Fernaenters mit einem Arbeitsvolumen von 3,0 1 verwendete, Ein wässriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt :

KH₂PO₄ Na₂HPO	4°	12 H₂O
MgSO₄O	7	H₂O
FeSO₄O	7	H₂O
CaCl₂ CuSO₄O	₅	Η_?0
ZnSO₄ ο	ι	H₂O
Ea₂KoO	ν	2 H₂O
CoCl₂O	6	Η_?0

H₂SO₄ (36 K) Enttrii neral iiiiertea und entsalztet; Wasser

335,0	mg/1
277,5	Ii
160,0	ti
14,5	If
40,0	Il
4,55	It
0,55	It
0,75	Il
0,32	ti
0,023	It
0,125	ml/1

zur Auffüllung auf 1000 ml 2,6

309811/0718

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45 C, einer Verdünnun^srate von 0,18 und einer Rührergeschwindigkeit von 1500 UpM betrieben. Ein aua 20 Vol.-# Methan und 80 Vol.-jto Luft bestehendes Gas wurde dem Fermenter in einer Menge von 30 V/V/Std. zugeführt.

Stufe C: Betrieb unter stationären Bedingungen unter Verwendung von Ammoniumhyüroxyd als Stickstoffquelle mit unabhängiger ρ,,-Regelung unter Verwendung von Natriumhydroxyd ·

Der Oti-V/ert wurde durch Zusatz von 1,0 N-Natriumhydroxyd

" Xl

aus einer automatischen Titrationsapparatur in Abhängigkeit von Pjr-Wertänderungen im Kulturmedium bei 6,6 gehalten. Eine 1,1 N-Ammoniumhydroxydlösung wurde mit einer Pumpe zugesetzt, wobei.die Menge gemäß der bestimmten Ammoniumionenkonzentration im Kulturmedium eingestellt wurde. Die Amraoniumionenkonzentration wurde nach einer kolorimetrischen Methode bestimmt, die in Beispiel 5 (Stufe B) genannt ist. Die Fermentation wurde für eine Mindestzeit von 7 Tagen durchgeführt. Die Zelldichte unter diesen Bedingungen betrug etwa 5,0 g/l entsprechend einer Erzeugung von Bakterienzellen von etwa 0,9 g (Trockengewicht) pro Liter und Stunde, Die folgenden Ergebnisse sind typisch für die während des Versuchs erhaltenen Resultate:

Zeit Einsatz des Aufnahme von Zelldichte, Überschüssige Std. Kährmediums, 1,0 IJ-NaOH _ /, _w„ + „

mi/btü. gem.iitration trltlon im

^ml/Stunde Kulturmedium,

0	500	3,0
12	Il	3,0
24	ti	2,9
36	Il	3,0
48	Il	3,1
60	Il	2,9
Ί?	Il	3,0
64	Il	3,0
96	Il	2,9
		30981 1 /0718

4,9 5,0 5,0 4,9 4,9 5,0 5,0 4,8 5,0

15,0 8,0

7,5

10,0

12,5 15,0 17,5 16,0 15,0

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß durch Zuführung von Ammoniumhydroxyd mit einer Pumpe in Abhängigkeit von der überaohüssigen NH,⁺-Ionenkonzentration im Kulturmedium eine Fermentation unter stationären Bedingungen durchgeführt werden kann« Durch Neutralisation mit Natriumhydroxyd wird der ρττ-Wert des Kulturmediums konstant gehalten.

Beispiel 7 Stufe B: Zwischenstufe zum Aufbau der Zelldichte. .

5,0 1 Kulturmedium, das die gemäß Stufe A von Beispiel 1 erhaltene, Methan verwertende Bakterienpopulation enthielt, wurdenzum Anfahren eines kontinuierlich betriebenen, mit Rührer versehenen Fermenters mit einem Arbeitsvolumen von 5,0 1 verwendet. Ein wässriges Medium der folgenden Zusammensetzung wurde dem Fermenter kontinuierlich zugeführt»

H₃PO₄	1098,0	mg/1
MgSO₄.7 H₂O	825,0	Il
KCl	275,0	Il
Na₂SO₄	210,0	Il
FeSO₄.7 H₂O	54,4	" I
CaCl₂	75,0	Il
CuSO₄.5 H₂O	20,6	K
ZnSO₄.7 H₂O	2,9	Il
MnSO₄.H₂O	0,8	It
Na₂MoO₄„2 H₂O	1,5	It
CoCl₂o6 H₂O	0,5	ti
Entmineralisiertes und
entsalztes Wasser	zur Auffüllung auf	1000 ml
ρ, _T-We rt	2₉25

Der Fermenter wurde bei einer Temperatur von 45⁰C₅ einer Verdünnungsrate von 0/18 h"¹ und einer Rührergescbwindigkeit von 3000 UpM betrieben. Ein aus 18,2 VoI₀-^ Methan und 81,8 Vol.-# Luft bestehendes Gas wurde dem Eintritt des Fermenters in einer Menge von 66 V/V/Std. zugeführt.

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Eine; 1,1 N-Arnmcniurnhydrcxydlbsung wurde mit einer Pumpe in den Fermenter eingeführt. Die zu^eführte Menge wurde nach der Amiiioniurnionenkonzuntration ir.i Kulturmedium unter Anwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Bestiniiuungsmethode geregelt. Der p_H-Wert wurde durch Zusatz von 1,0 N-NaOH-Lösung aus einer autoiratischen l'itrationsappara"cur in Abhängigkeit von Pu-Wertänderungen im Kulturmedium bei 6,2 gehalten.

Stufe C: Betrieb unter stationären Bedingungen unter Verwendung von Ainmoniumhydroxyd als Stickstoff quelle bei unabhängiger p_t,-F.egelung unter Verwendung von llatriumhydro:xyd

Die Zelldichte unter diesen Bedingungen stabilisierte sich bei etwa 14 g (Trockengewicht) pro Liter. Die Fermentation wurde wenigstens 7 Tage unter stationären Bedingungen durchgeführt. Die- Erzeugung an Bakterien betrug etwa 2,5 g (Trockengewicht) pro Liter und Stunde.

Die folgenden Ergebnisse sind typisch für die während des Versuchs ei^haltenen Resultate.

Zeit Zufuhr des Aufnahme

Zelldichte, Überschüssige

Std.	Nährmediums, tnl/Std.	von 1,0 N-NaOH gem.Titra tion, ml/ Stunde	g/l	NH, -Konzen tration im Kulturmedium, mg/1
0	815	5,3	13,9	15,0
12	M	5,5	14,0	12,5
24	M	5,7	14,3	10,0
36	Il	5,8	14,4	9,5
48	Il	5,5	14,0	10,0
60	Il	5,7	14,1	8,0
72	Il	5,1	14,3	7,5
84	Il	5,6	14,0	7,8
96	Il	5,7	14,4	9,5

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Claims

Patentansprüche

1) Kontinuierliches Verfahren zur Umwandlung von Methan in Eiweißstoffe durch kontinuierliche Kultivierung von Methan verwertenden Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium, das Nährsalze und Ammoniumionen enthält und dem ein wässriges'Kährmedium zugesetzt wird, in Gegenwart von Methan und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases, dadurch gekennzeichnet, daß man -den powert des Kulturmediums im Bereich von 4,5 "bis 8,0 und die Ammoniumionenkonzeritration im Bereich von 2 Ms 100, vorzugsweise 2 Us 50 mg/1 und die Produktionsgeschwindigkeit unter stationären Bedingungen "bei wenigstens 0,81 g (Trockengewicht) Mikroorganismus pro Liter und Stunde hält.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den p^-Wert des dem Kulturmedium zugesetzten wässrigen ITährmediums unter 7,5 und "bei einem Wert hält, der so weit unter dem p_H~Wertdes Kulturmediums liegt, daß die erhaltene WasserstoffionenkOnzentration im Kulturmedium bei einem solchen Wert bleibt, daß die Ammoniumionenmenge, die in jedem gegebenen Augenblick erforderlich ist, um den p^-Wert des Kulturmediums einzustellen, im Bereich von 2 bis 100 mg/1 liegt ο

3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Prr-Wert dea Kulturmediums durch Zusatz von Säure oder Alkali mit Ausnahme von Ammoniak oder Amaioniumhydroxyd im Bereich von 4,5 bis 8,0 und die .Arnnioniumionenkonzentration in Abhängigkeit von durch Apparaturen bestimmten Werten der Ammoniumionenkon;:cntrat j on irn Kulturmedium im Bereich von 2 bis 100 rnr/1 halt.

4) Vorführen nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn- ^r/A:ichn<}\,, daß der Methan verwertende Mikroorganismus

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als Teil einer nach einer Anreicherunpsmethode erhaltenen

Mikrolbieopopulation eingesetzt wird.

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