DE2720035A1

DE2720035A1 - Verfahren zur aeroben kultivierung von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2720035A1
Application number: DE19772720035
Authority: DE
Inventors: Lubomir Dr Adamek; Miroslav Dipl Ing Rut; Frantisek Dipl Ing Stros
Original assignee: Chemopetrol AS
Current assignee: Chemopetrol AS
Priority date: 1976-05-14
Filing date: 1977-05-04
Publication date: 1977-12-01
Also published as: CS182649B1; ES458780A1; GB1578254A; IT1085140B; JPS52151785A

Description

BEETZ-LAMPRECHT- BEETZ PATENTANWÄLTE München 22 - Steinsdorfstr. 1O Dipi.-ing. r. beetz sen.

TELEFON (Ο8Θ) 22 72 O1 - 22 72 44- - 29 S91O Dipl.- Ing. K. LAM PRECHT

Telex 5 22O48-Telegramm Allpatent München 0 *7 Of] fl 0 C Dr.-lng. R. BEETZ Jr.

* I t U U O J r-,l_l_ BI.- I ■ UCII-II

Oipl.-Phys. U. HEIDRICH auch Rechtsanwalt Dr.-lng. W. TIMPE Dipl.-Ing. J. SIEGFRIED

233-26.878P 4. 5. 1977

CHEMOPETROL koncern pro cnemicky prumysl a zpracoväni ropy PRAÜ 8-Liben - CS3R

Verfahren zur aeroben Kultivierung von Mikroorganismen

Die Erfindung betrifft ein '/erfahren zur aeroben Kultivierung von Mikroorganismen, insbesondere ein Verfahren zur wirkungsvollen Kontrolle der Zugabe der Kohlenstoffquelle zum Kulturmedium im Verlauf der Kultivierung und der Erzielung einer optimalen Konzentration.

Bei der aeroben, auf die Erzeugung einer mikrobiellen Biomasse gerichteten Kultivierung von Mikroorganismen sind die Vermehrungsgeschwindigkeit der Zellen und der erreichte Ausbeutekoeffizient im beträchtlichen Maße von der Einhaltung der Konzentration der Kohlenstoffquelle in einem optimalen Bereich abhängig. Eine zu hohe Konzentration fördert zumeist die Bildung von Nebenmetaboliten, was letztlich zu einer Verringerung der Ausbeute führt. Wenn Metabolite mit inhibierender Wirkung gebildet werden, wird die Kultivierung darüber hinaus auch verzögert. Eine zu niedrige Kohlenstoffkonzentra-

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? 0 9 8 4 8 / 0 8 ΓΗ

tion hemmt auf der anderen Seite die Kultivierung. Deshalb werden Verfahren zur Kontrolle der Konzentration der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium in einem vorgewählten optimalen Bereich gesucht, wobei eine optimale Geschwindigkeit der Kultivierung der Mikroorganismen und dadurch auch eine gute Ausbeute der Kultivierung gewährleistet sein soll.

Eine bekannte Möglichkeit der Kontrolle der Konzentration der Kohlenstoffquelle bei der aeroben Kultivierung von Mikroorganismen besteht in der direkten Messung der Konzentration (vgl. die ^S-PS 142 889). Eine indirekte Kontrolle der Konzentration der Kohlenstoffquelle z.B. aufgrund von sekundären Erscheinungen, die nach der Erschöpfung der Kohlenstoffquelle auftreten, ist jedoch üblicher. Eine weitere Kontrollmöglichkeit beruht auf der plötzlich auftretenden Verringerung des pH-Wertes nach dem Aufbrauchen der Kohlenstoffquelle (vgl. die CS-PSen 158 954 und 158 991). Nach einem anderen bekannten Verfahren wird die Kohlenstoffquelle dann zugegeben, wenn ein intensives Schäumen des Kulturmediums auftritt, das ein Defizit an Kohlenstoffquelle aufweist (vgl. die US-PS 3 672 953). Eine andere bekannte Erscheinung ist, daß zum Zeitpunkt der Erschöpfung der Kohlenstoffquelle eine plötzliche Veränderung der Konzentration des im Kulturmedium gelösten Sauerstoffs festzustellen ist. Auch diese Erscheinung ist zur Kontrolle der Konzentration der Kohlenstoffquelle heranzuziehen (vgl. die Ss-PS 116 642 und die US-PS 3 384 553). Das letzte Verfahren ist nahezu universell anwendbar und führt bei richtiger Auslegung des Kontrollsystems gute Resultate. Ein Nachteil dieser Verfahrensweise ist aber, daß die

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Vorrichtung zur Messung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs häufige und sorgfältige Instandhaltung und Service verlangt. Die verwendbaren Elektroden weisen zudem nur eine unbefriedigende Lebensdauer auf, auch sind sie nur selten im Wasserdampf sterilisierbar. Die Anwendung dieses Verfahrens ist daher zumeist auf Kultivierungen im Labor beschränkt. Die Anwendung dieses Verfahrens in industriellem Maßstab und für langdauernde Kultivierungen ist derzeit noch aufwendig und problematisch .

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und zugleich wirtschaftliches Verfahren zur aeroben Kultivierung von Mikroorganismen bei stabiler Temperatur und stabilem pH-Wert des Kulturmediums anzugeben, das empfindlicher auf Veränderungen im Zellmetabolismus anspricht, die durch einen Mangel an Kohlenstoffquelle verursacht sind, und entsprechend eine frühzeitige Zugabe der Kohlenstoffquelle zum Kulturmedium im Verlauf der Kultivierung ermöglicht, wenn sich die Kultivierung noch nicht vollständig einstellt.

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß sich das Redoxpotential des Kulturmediums bei der aeroben Kultivierung von Mikroorganismen bei stabiler Temperatur und einem stabilen pH-Wert des Kulturmediums zu dem Zeitpunkt plötzlich verändert, wenn die Konzentration der Kohlenstoffquelle unter einen kritischen Wert absinkt, bei dem die Geschwindigkeit der Zunahme der Mikroorganismenmasse schon progressiv gehemmt wird.

Die Erfindung gibt ein Verfahren zur aeroben Kultivierung von Mikroorganismen bei stabiler Temperatur und

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stabilem pH-Wert des Kulturmediums an, das darauf beruht, daß dem Kulturmedium im Verlauf der Kultivierung jeweils dann frische Kohlenstoffquelle zugegeben wird, wenn sich das Redoxpotential des Kulturmediums im Verlauf von 5 bis 120s um 5 bis 400 mV und vorzugsweise um 40 bis 8o mV geändert hat.

Die frische Kohlenstoffquelle wird vorzugsweise in einer Men_;;;e zugesetzt, die nicht höher ist als die durch Multiplikation der Menge des Kulturmediums mit der kritischen Konzentration der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium berechneten Menge.

Die frische Kohlenstoffquelle kann vorzugsweise zusammen mit den Quellen der anderen benötigten Nährstoffe in einem experimentell bestimmten Verhältnis zugegeben werden.

Jeder zur Biomasse kultivierbare Mikroorganismus kann erfindungsgemäß verwendet werden, bevorzugt ist dabei die Kultivierung von Hefen wie insbesondere Candida lipolytica oder Candida utilis nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Als Kohlenstoffquelle können beispielsweise Äthanol oder Paraffine verwendet werden; bevorzugte Kohlenstoffquellen sind synthetisches Äthanol und n-Alkane.

Die Größe der Veränderung des Redoxpotentials am Punkt der Erschöpfung der Kohlenstoffquelle hängt im hohen Maße von der Konzentration des im Kulturmedium gelösten Sauerstoffs ab. Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerordentlich empfindlich, insbesondere bei niedri-

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gen Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff im Kulturmedium, die besonders bei industriellen Kultivierungen von Mikroorganismen üblich sind. Zur Auslösung der Zugabe der Kohlenstoffquelle kann jeder Wert der Änderung von 5 bis 400 mV gewählt werden. Wenn die Kohlenstoffquelle jedoch bereits nach einer Änderung des Redoxpotentials zugegeben wird, die nahe an der Untergrenze von 5 mV liegt, besteht die Gefahr einer Überdosierung der Kohlenstoffquelle. Dies kann beispielsweise dann vorkommen, wenn die Änderung des Redoxpotentials nicht durch Erschöpfung von Kohlenstoffquelle, sondern durch eine zufällige Erhöhung des Luftdurchsatzes durch das Kulturmedium verursacht wird. Wenn die Kohlenstoffquelle andererseits erst nach einer Änderung des Redoxpotentials zugegeben wird, die nahe an der Obergrenze liegt, können Probleme im Anfangsstadium der diskontinuierlichen Kultivierung mit hoher Konzentration an im Kulturmedium gelöstem Sauerstoff auftreten. Deshalb ist es vorteilhaft und allgemein anwendbar, zur Auslösung der Zugabe der Kohlenstoffquelle zum Kulturmedium einen Wert der Änderung des Redoxpotentials im Bereich von 40 bis 8o mV zu wählen, wodurch eine eventuelle Überdosierung der Kohlenstoffquelle in zufälligen Extremfällen verhindert werden kann.

Das Redoxpotential der Redoxreaktionen wird mit einer Platinelektrode als Meßelektrode und einer Kalomelektrode als Vergleichselektrode gemessen. Bei der aeroben Kultivierung stellt sich an den in das Kulturmedium tauchenden indifferenten Elektroden ein Potential ein, das von der Zusammensetzung des Kulturmediums, dem Gesamt-Redoxpotential aller bei der Kultivierung ablaufen-

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den Reaktionen, der Konzentration des gelösten Sauerstoffs, dem pH-Wert des Kulturmediums und von der Temperatur des Kulturmediums abhängig ist. Auch die Änderung des Redoxpotentials entspricht der Summe aller Teiländerungen des Redoxpotentials, die durch die Veränderungen der obigen Einzelfaktoren hervorgerufen sind. Wenn Temperatur und pH-Wert des Kulturmediums im Verlauf der Kultivierung konstantgehalten werden, was meistens der Fall ist, werden dadurch die von diesen beiden Einflußgrößen verursachten Änderungen eliminiert. Bei kontinuierlicher Kultivierung unter stabilen Bedingungen, unter denen die Zusammensetzung des Kulturmediums konstant ist, sind auch die durch Änderung der Zusammensetzung verursachten Änderungen des Redoxpotentials eliminiert. Die Änderung des Redoxpotentials ist dann nur von der Änderung des Redoxpotentials aller im Kulturmedium ablaufenden Reaktionen und der Änderung des Redoxpotentials durch Veränderung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Nähe der Elektroden abhängig. Beide Faktoren sind eng mit den in den Mikroorganismen ablaufenden Redoxreaktionen verknüpft.

Das erfindungsgemäße Verfahren reagiert außerordentlich empfindlich auf einen auftretenden Mangel an Kohlenstoffquelle, besonders bei geringen Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff im Kulturmedium, was bei industriellen Kultivierungen typischerweise der Fall ist. Zudem wird erfindungsgemäß im Unterschied zu den bekannten Verfahren nur ein einfaches System haltbarer und sterilisierbarer Elektroden und eine übliche Meßeinrichtung verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine sehr empfindliche und genaue Kontrolle bzw. Regelung der Zu-

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gäbe der Kohlenstoffquelle, da das Verfahren empfindlich auf die hiermit korrelierte Änderung des Redoxpotentials anspricht.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

In einem mechanisch gerührten Labor-Fermentationstank mit einem Gesamtvolumen von 2,5 1 und einem Nutzinhalt von 0,8 1 sowie einem volumetrischen Koeffizienten der Sauerstoffabsorption von 1000 pro Stunde, wurde eine kontinuierliche Kultivierung der Hefe Candida utilis unter Verwendung von Rohäthanol als Kohlenstoffquelle durchgeführt. Das eingesetzte synthetische Rohäthanol enthielt 90,4 Gew.-# Äthanol. Im Verlauf der Kultivierung wurden automatisch eine Temperatur von 30 ⁰C - 1 ⁰C und ein pH-Wert von 4,0 - 0,1 aufrechterhalten. Der pH-Wert wurde durch Zugaben von 10 #iger wäßriger Ammoniaklösung auf dem oben genannten Wert gehalten. Der Luftdurchsatz betrug 0,8 l/min. Der Kultur wurde kontinuierlich Wasser in einem Durchsatz von 165 ml/h zugesetzt; die VerdUnnungsgeschwindigkeit der Kultur betrug dadurch 0,206 /h. Durch einen überlauf wurde im Fermentationstank ein konstantes Volumen aufrechterhalten. Die Kultivierung wurde im Sauerstofflimit durchgeführt. In das Kulturmedium wurden eine Platinelektrode und eine Kalomelelektrode eingetaucht. Das Elektrodenpotential wurde mit einem pH-Meter mit Bereich von 0 bis 500 mV gemessen. Zu dem Zeitpunkt, in dem eine plötzliche Veränderung des Redoxpotentials um 50 mV gemessen wurde, die einen Mangel an Kohlenstoffquelle im Kulturmedium an-

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zeigt, wurde 1 ml Rohäthanol zugegeben. Diese Menge wurde aus dem Nutzinhalt des Fermentationstanks von 0,8 1 und aus der Äthanolkonzentration im Kulturmedium von 0,6 g/l berechnet, die nach der Zugabe des Äthanols nicht überschritten werden darf. Nach Zugabe der Kohlenstoffquelle ging der Wert des Redoxpotentials innerhalb einiger Sekunden wieder auf den ursprünglichen Wert zurück.

Zusammen mit dem Rohäthanol wurden auch die Quellen der übrigen erforderlichen Nährstoffe in einer Lösung zugegeben, die in 1 Liter 40 ml Phosphorsäure (75 Gew.-% H₅PO^), 55 ml Kaliumhydroxid (40 Gew. -% KOH), 20 g MgSO^H 0,5 g ZnSOj₊-7 %D und 25 g (NH_i|)₂S0_i| enthielt. Die Lösung enthielt pro Liter ferner genügend K, Mg, P₂Oc und Zn zur Erzeugung von 1 kg Biomasse durchschnittlicher Zusammensetzung .

Unter der Voraussetzung, daß die Ausbeute an Biomasse aus 1 g reinem Äthanol 0,7 g beträgt, wurde 0,5 ml der Lösung der Mineralnährstoffe zusammen mit 1 ml Äthanol in den Fermentationstank eingeführt.

Nach 24 h kontinuierlicher Kultivierung wurden 3*96 1 reifes Kulturmedium erhalten. Das Kulturmedium enthielt 19>6 g/l Biomasse-Trockensubstanz. Der erreichte Ausbeutekoeffizient betrug 0,659, die Kultivierungsgeschwindigkeit 4,04 g/l-h.

Beispiel 2

Im gleichen Fermentationstank wie in Beispiel 1 wurde

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•β -

eine einmalige Kultivierung der Hefe Candida lipolytica mit n-Alkanen als Kohlenstoffquelle durchgeführt. Die Verfahrensbedingungen waren allgemein dieselben wie in Beispiel 1. Die isolierten Paraffine enthielten 99,5 n-Alkane, in der Mehrzahl C,u- bis C.y-Kohlenwasserstoffe. Im Verlauf der Kultivierung wurden eine Temperatur von 35 ⁰C und ein pH-Wert von 4,5 aufrechterhalten. Die Anfangszusammensetzung des Kulturmediums betrug pro Liter:

1 g (NH₄)₂SO₄

1,6 g KH₂PO₄

0,5 g MgSO₄-7 H₂O

0,01 g ZnSO₄*7 H₂O

Die Anfangskonzentration des Kulturmediums nach der Zu gabe des Inokulums betrug 2 g Biomasse/l. Die Kultivierung wurde mit 2 ml isolierten Paraffinen in Gang gebracht.

Im Verlauf der Kultivierung zeigte das Redoxpotential eine langsam steigende Tendenz. In der zweiten Hälfte der Kultivierung stabilisierte sich das Redoxpotential auf den Wert 170 mV. Jedesmal, wenn eine plötzliche Veränderung des Redoxpotentials um 50 mV gemessen wurde, wurde ImI isolierte Paraffine zugegeben. Nach der Zugabe stabilisierte sich das Redoxpotential rasch auf den normalen Wert. Die Kultivierung wurde nach 9 h beendet. Es wurden 0,8 1 reifes Kulturmedium gewonnen, das 18,5 g/l Biomasse-Trockensubstanz enthielt. Dabei wurden l6 ml isolierte Paraffine, die 12,25 g reinen n-Alkanen entsprachen, verbraucht. Es wurde ein Ausbeutekoeffizient von 1,058 erreicht.

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Claims

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Ansprüche

l_f Verfahren zur aeroben Kultivierung von Mikroorganismen bei stabiler Temperatur und stabilem pH-Wert des Kulturmediums, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium im Verlauf der Kultivierung jeweils dann frische Kohlenstoffquelle zugegeben wird, wenn sich das Redoxpotential des Kulturmediums im Verlauf von 5 bis 120 s um 5 bis 4ü0 mV und vorzugsweise um 40 bis 80 mV^- geändert hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die frische Kohlenstoffquelle in einer Menge zugegeben wird,die nicht höher ist als das Produkt aus der Menge des Kulturmediums und der kritischen Konzentration der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die frische Kohlenstoffquelle zusammen mit den Quellen der anderen erforderlichen Nährstoffe in einem experimentell bestimmten Verhältnis zugegeben wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus eine Hefe, vorzugsweise Candida lipolytica oder Candida utilis, verwendet

5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Äthanol oder Paraffine, vorzugsweise synthetisches Äthanol oder n-Alkane, verwendet werden.

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