DE2004299B2 - Verfahren zum aeroben zuechten von kohlenwasserstoff-abbauenden hefen - Google Patents

Description

Medium, einhält. ,..,,, u

zverfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch ge-

kennzeichnet, daß man das verbrauchte Nährmedium in einer Menge von 5 bis 75 Volumen-Prozent, bezogen auf das Gesamtmedium, in den Emulgiertank zurückführt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum aeroben Züchten von Kohlenwasserstoff abbauenden Hefen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird als kontmuierliches Gärverfahren mit dafür geeigneten Hefestammen, die Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle verbrauchen, durchgeführt.

Es ist bereits bekannt, daß einige Mikroorganismen die Fähigkeit besitzen, Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle abzubauen. Diese Mikroorganismen umfassen eine große Vielfalt von Bakterien Hefen usw. So wurde in »Die Brauerei Wissenschaftliche Beilage« 1961. S. 57 bis 60 und 71 bis 75 das aerobe Zuchten von Kohlenwasserstoff abbauenden Hefen und Bakterien in einem Kohlenwasserstoffe enthaltenden Nährmedium beschrieben.

Aus der deutschen Offenlegungsschrft 1 470 ist ein Verfahren zum Züchten von Hefen in einem Kohlenwasserstoff enthaltenden Nährmedium bekannt, bei welchem die Kohlenwasserstoffe zu 3 bis 45 Gewichtsprozent aus geradketügen KohlenwassertÄt schwierig, den Koh.enwasserämm

^«ezeuen _wertvolle Naturprodukte,

F* ^Säuren und Lipide, im industrieUen

JgJSbS ErfS herzusteUen. .

Mai»laoi^ , _der Ausbeute im Hmbhck

,,£_ς^_ς Nährstoff eingesetzte Phosphat zu erzielen, auf damals N^oß ^e g ^₇₄ ^ _zwdstufigps

ist aus der J^/£? _{t bei dem} ein Mikroorga-G^gsverfahn*b« bei ^ ^ ^^

msrnus in einer ers ^te" _fj bestehenden Gär-

Nahrmedmm und ^oUraka.^ ^ ^^

.5 medium g^¹*^ _Nährmedium durchgeführt stufe £ <^^m J_ef _te|_{weise aus} dem wäßrigen Nähr-

^,^Ä^,,.!,« der ersten Stufe entnommen medium besteht, weicne

wurdeVerfahren wird demnach die - Beidiese*^J^ _{durchgeführt}, in einer Wachs-Gärung in zwei Phase *

«JÄ™ "£^tangegjflber die Aufgabe zu_r,_nL ein Verfahren zum aeroben Züchten von gründe ein Ver.^{an e} _{d Refen zugänglich zu}

,5 ^Koh,^f^Lf_cht Hefezellen in hoher Ausbeute, machen das er g ^ ^ _gsmateriai.

bezogen auf das £°ⁿ£™ _{Hefen in einer kürzercn}

^"f^^Ter gezülhtef^erden können, als es bisher Kulturdauer g««^nie _{en soH konti}nuierlich im

möglich war ü.e ^ _{durchgeführt werden konnen}^

rw Aufeabe wird erfindungsgemäß durch ät_v ^Diese.,™_be3_Onderer Stämrne von Torulopsis Verwendung Sonder«: b ^ ^^

P^™^'^',^^ und durch Anwendung einer der J^S? vorgeschalteten Emulgierstufe gelöst.

SVtand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum aeroben Züchten von Kohlenwasserstoff abbauen-5Γ Hefen durch kontinuierliche Garung unter

λο Sblichen Bedingungen in einem üblichen Nährmedium. 3a zwischen 200 Snd 360^C siedende Kohlenwasserstoffe enthält, wobei ein Teil des Nährmediurns m Kreislauf geführt wird, das dadurch gekennzeichnet it daß man die Hefestämme Torulopsis petrophilum

ATCC Nr. 20225, Candida petrophilum ATCC Nr 20226 oder Brettanomyces petrophilum ATCC Nr 70954 einsetzt und verbrauchtes Nahrmedium NrMZ^ ein se ζι u ^ _Nährmed>um er-

übe einen ^^mu^^e, _{asserstoff in hoher} Konzcn- et« ^das f^^^ _Nänrmedium und Methanol.

tration ^v^^c _lsopropanol, Butanol, Pentanol, Äthanol, P_ropano. F> P _n ^^ ^^

^«anο , nep f _Octadecanol in einer

^nstyl- Cetylalkohol ο _{Volumenprozenlf be}-Konzentration von^

55 »g^X^, _der Feststellung, daß die ^Dl^^ⁿÄämmVsich sehr gut vermehren, wenn 8^ena5J^ten "^¹⁸J! ^₁^ Kohlenwasserstoff, anorgam G"¹^^"¹^ _ganischell Salzen und einer nischem ™^y, _{besteht und we}lchem das

^^^,,, _sowie eine geringe genannten Alkohole zugesetzt wird. J_erum_k eingeführt wird, in welchem vor^ ^ _n"^K _einef KohlenwassersloffemuUion

^TAfX Bildung des Macels in dem und indem d e BMd 8 _{nk umer}

^^^^g^ Gärflüssigkeit durchgeführt wird, die aus dem ersten Tank zugeleilel wird.

Mit Hilfe einer so durchgeführten, kontinuierlichen Gärung können neben dem Mycel Gärungsprodukte, wie Aminosäuren, organische Säuren und Vitamine, durch die angegebenen Stämme mit hoher Wirksamkeit gebildet werden.

Die in dem ersten und zweiten Tank angewendeten Gärbedingungen können in Abhängigkeit vom gezüchteten Stamm und den gewünschten Produkten variiert werden. So beträgt beispielsweise die Züchtungstemperatur 25 bis 37° C. Es ist erforderlich, die Gärung unter aeroben Bedingungen durchzuführen und den pH-Wert des Gärmediums einzustellen. Züchtimgsbedingungen, wie Temperatur und pH-Wert, können bei den in bekannten Verfahren verwendeten Werten gehalten werden und unterliegen keiner spezifischen Begrenzung.

In vorteilhafter Weise wird beim erfindungsgemäßen Verfahren ais Kohlenwasserstoff ein geradkettiger Kohlenwasserstoff verwendet.

Als günstig erwiec es sich auch, wenn man in dem Emulgiertank eine Konzentration des Kohlenwasserstoffs von 5 bis 40 Volumenprozent, bezogen auf das gesamte Medium, enthält.

Von Vorteil ist es auch, wenn man das verbrauchte Nährmedium in einer Menge von 5 bis 75 Volumenprozent, bezogen auf das Gesamtmedium, in den Emulgiertank zurückführt.

Die Abtrennung der gebildeten Gärfü?~.igkeit kann nach den in bekaunten Verfahren angewendeten Methoden durchgeführt werden und umfaßt beispielsweise die Trennung der Gärflüssigkeit in eine schwerere und eine leichtere Flüssigkeit mit Hilfe eines Westfalia-Separators, Einstellen des pH-Wertes der schwereren Flüssigkeit auf etwa 5. Zugabe eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels, beispielsweise Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat in einer Menge bis zu 0,005 ml pro 100 ml der Flüssigkeit, Erwärmen des Gemisches auf 50 C und anschließendes Rühren, Abtrennen der Zellen aus der Flüssigkeit mit Hilfe eines Westfalia-Separators vom Düsentyp, Waschen der Zellen mit Wasser und Trocknen mit einem Trommeltrockner. Die Abtrennung der anderen Gärungsprodukte kann beispielsweise durchgeführt werden, indem die Gärflüssigkeit, aus der die Zellen entfernt wo.den sind, einer Behandlung zum Konzentrieren oder einer Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz zur fraktionierten Isolierung der Produkte unterworfen wird.

In der folgenden Beschreibung wird unter Bezugnahme auf die Zeichnung das erfindungsgemäße Verfahren erläutert. Wie aus der Zeichnung hervorgeht, wird in dem kontinuierlichen Zweitank-Gärsystem ein Nährmedium in dem ersten Tank vorgelegt, welches aus dem Kohlenwasserstoff in hoher Konzentration, vorzugsweise 5 bis 40 Volumenprozent, sowie anorganischen Salzen, einer Stickstoffquelle und einer organischen Nährstoffquelle besteht. Diesem System wird eine geringe Menge des Alkohols zugesetzt und dann der Kohlenwasserstoff emulgiert und das Züchtungsverfahren durchgeführt. Die Emulsion aus dem ersten Tank wird entweder kontinuierlich oder intermittierend dem zweiten Tank zugeleitet, in welchem die Züchtung durchgeführt wird, indem ein aus anorganischen Salzen, einer Stickstoffquelle und einer Quelle für organische Nährstoffe bestehendes wäßriges Nährmedium, welches keinen Kohlenwasserstoff enthält, zugeführt wird. Es ist erforderlich, die Züchtung sowohl im ersten als auch im zweiten Tank unter aeroben Bedingungen vorzunehmen. In dem zweiten Tank wird in wirksamer Weise die Hauptgäning, d. h. die Bildung der Zellen oder Bildung der Gärungsprodukte durchgeführt

Die Art der anorganischen Salze, der Stickstoffquelle und der Quelle für organische Nährstoffe, die in dem ersten und zweiten Tank verwendet werden, unterliegt keiner speziellen Einschränkung. Diese Salze können daher aus den nach dem Stand der Technik verwendeten Salzen ausgewählt werden. So sind beispielsweise als anorganische Salze Kaliumdihydrogenphosphat, Kali ummonohydrogenphosphatjMagnesiumsulfat, Natriumchlorid, Ferrosulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Calciumchlorid und ähnliche Verbindungen zu erwähnen. Als Quelle für organische Nährstoffe können Pepton, N-Z-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl und dessen Hydrolysat und ähnliche Substanzen verwendet werden. Stickstoff enthaltende Materialien wie Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbon;!, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat sowie Harnstoff können als Stickstoffquelle Verwendung finden.

Des weiteren erfolgt ein Zusatz des bereits verbrauchten Nährmediums und ferner einer geringen Menge eines Alkohols, wie Äthanol und Methanol, zu dem ersten Tank. Der Zusatz des verbrauchten Nährmediums erfolgt vorzugsweise in einem Verhältnis von 5 bis 75 Volumprozent, bezogen auf das gesamte Medium. Als verbrauchtes Nährmedium kann, wie in der Zeichnung gezeigt wird, die durch Zentrifuga'tbscheidung erhaltene leichtere Flüssigkeit verwendet werden. Manchmal findet das verbrauchte Nährmedium vor der Zentrifugalabscheidung oder dessen Hydrolysat Verwendung.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden dann noch die Hefestämme Torulopsis petrophilum ATCC Nr. 20225, Candida petrophilum ATCC Nr. 20226 oder Brettanomyces petrophilum ATCC Nr. 20224 eingesetzt, die sich auf Grund ihrer ausgezeichneten Eigenschaften auch zur Verwendung als Nahrungsoder Futtermittel eignen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden sehr viel bessere Ergebnisse als nach den bisher bekannten Methoden erzielt, wie aus der nachfolgenden Beschreibung noch hervorgeht. Zunächst gestattet die kontinuierliche Gärung unter Verwendung eines Zweitank-Gärsystems die Zuführung eines Ausgangsmaterials, welches die Kohlenwasserstoffe in hoher Konzentration enthält Auf diese Weise wird nur ein kleinerer Fermentationstank benötigt, in welchem die Bildung der Emulsion aus dem Kohlenwasserstoff eine geringere Zeit erfordert als bei der Zuführung des Kohlenwasserstoffs in niedriger Konzentration. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von den bisher bekannten Verfahren dadurch, daß zusätzlich zu dem Hauptfermentationstank ein Emulgiertank vorgesehen ist. Zweitens ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Wirkungsgrad des Kohlenwasserstoffabbaus sehr hoch. Nach dem Stand der Technik war es allgemein bekannt, daß aus Kohlenwasserstoffen, insbesondere aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen, das Hefemycel in einem Verhältnis von 1 : 1 gebildet wird. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird jedoch das Mycel in einem Verhältnis von mehr als 1 : 1 aus dem Kohlenwasserstoff erhalten, und Hie .inHeren ΓΊ3πιησςηιν>ΗιιΙ<ίρ werHen ebenfalls in

höherer Ausbeute als bei bisher bekannten Verfahren gebildet. Es ist speziell hervorzuheben, daß bisher kein Verfahren existierte, bei dem die Ausbeute der Bildung von Hefemycel, bezogen auf zugesetzten Kohlenwasserstoff, 100 % überschreitet. Eine Ausbeute von mehr als 100 % kann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zum ersten Mal erzielt werden. Andere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind aus der Beschreibung und den Beispielen ersichtlich. Die Wirkung des Zusatzes des verbrauchten Nährmediums und geringer Mengen des Alkohols gehen aus den nachstehend beschriebenen Versuchen hervor.

Ein erster Versuch wurde unter Verwendung von Candida petrophilum ATCC Nr. 20226 durchgeführt.

Das Nährmedium in dem ersten Tank hat folgende Zusammensetzung:

Geradkettige Paraffine mit 14 bis

Volumenprozent

17 Kohlenstoffatomen (Reinheit 98%

oder mehr) 15

Gewichtsteile pro 100 Volumenteile

Mangansulfat 0,004

Magnesiumsulfat 0.05

Calciumchlorid 0,01

Harnstoff 0,3

4 Liter des wie oben zusammengesetzten Nährmediums mit einem pH-Wert von 4,5 werden in den ersten Tank (mit einem Fassungsvermögen von 8 Liter) gegeben und die Konzentrationen der Nährstoffquellen konstant gehalten. Bei der praktischen Durchführung werden die verbrauchten Anteile der anorganischen Salze, der Stickstoffquelle und der Quelle für organische Nährstoffe gemäß der Bestimmung der Ausbeute des geb.ldeten Produkts ständig ergänzt. Bei der Verwendung von verbrauchtem Nährmedium zur Bildung der Emulsion werden die auf die oben angegebene Zusammensetzung fehlenden Bestandteile diesem vor dem Wiedereinsatz zugesetzt. Die aerobe Kultur wird in dem zweiten Tank durchgelü.ut Zu diesem Zweck werden 20 Liter des Nährmediums in den Tank mit 40 Liter Fassungsvermögen gegeben. Diesem Tank wird eine wäßrige Lösung derselben Zusammensetzung wie oben, mit Ausnahme des Kohlenwasserstoffs, kontinuierlich zugeführt. Es wird jedoch kein Kohlenwasserstoff zugesetzt. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse einer Bestimmung der für die Emulsionsbildung erforderlichen Zeit (Verweilzeit) in dem ersten Tank und der Wirkungsgrad der Zellbildung im zweiten Tank für den Fall angegeben, in welchem das verbrauchte Nährmedium in einem Verhältnis von 5 bis 75 Volumenprozent, bezogen auf das Gesamtmedium, zugesetzt wird. Durch den Zusatz des verbrauchten Nährmediums zu dem ersten Tank ist eine Verringerung der zum Emulgieren des Kohlenwasserstoffs erforlichen Zeit und eine Lrhöhung der Ausbeute zu beobachten.

Tabelle 1

Wirkung des verbrauchten Nährmediums auf di Emulgierung und die Mycelbildung,

Konzentration des
verbrauchten
Nährmediums

(Volumenprozent)

10
25
50
75

Emulgierdauer

(1. Tank)

Sdt.

3,5

Trockenes Mycel

(g)

pro zugesetzten

Kohlenwasserstoff

(S)⁰Io

92

95

99

103

103

91

Gärbedingungen in dem ersten Tank: 30⁰C 500 Upm, Belüftung 60%. Flüssigkeitsvolumen 4 Lite Einstellung des pH-Werts auf 4,5 bis 5,0 mit Hilfe vo wäßrigem Ammoniak.

Gärbedingungen in dem zweiten Tank: 3O⁰C 400 Upm, Belüftung 100%, Verweilzeit 4 Stunden. *5 In einem zweiten Versuch wurde derselbe Stamr und das gleiche Medium wie im Versuch 1 verwendet mit der Ausnahme, daß das verbrauchte Nährmediun dem ersten Tank in einer Konzentration von 25 Vo lumenprozent, bezogen auf das Gesamtmedium, zugi setzt wurde und die Wirkung der Zugabe des Alkoho zu dem ersten Tank geprüft wurde. Tabelle 2 zeigt d erhaltenen Ergebnisse.

Ammoniumsulfat 0,2

Ferrosulfat 0,005

Maisquellwasser 0,1

Tabelle 2
Wirkung des Alkoholzusatzes

Konzentration des
Alkohols

Volumenprozent I 0,05 I 0,1

Alkohol

Methanol

Äthanol

Propanol

Isopropanol

Butanoi

Pentanol

Hexanol

Heptanol

Caprylalkohol

Nonylalkohol

Decylalkohol

Laurylalkohol

Myristylalkohol .

Cetylalkohol

Octadecanol

Vergleichsversuch

106 108 111 112 110 109 106 110 111 113 117 108 105 110 108

101 118 118 119 117 116 106 108 113 111 110 111 112 112 117

99

Die Zahlenwerte in der Tabelle bedeuten Gewicl der getrockneten Zellen in Gramm pro 100 Gewicht teile des zugesetzten Kohlenwasserstoffs in Gramm.

Wie aus Tabelle 2 klar hervorgeht, hat die gleicl zeitige Zugabe des verbrauchten Nährmediums un des Alkohols eine unerwartete Wirkung.

Die Wirkung des Alkoholzusatzes kann einer ve besserten Assimilation des Kohlenwasserstoffs durc die Zellen zugeschrieben werden, ist jedoch nicht a:

eine Assimilation des Alkohols als Kohlenstoffquel

durch die Zellen zurückzuführen. Dies ist aus di

Tatsache verständlich, daß höhere Ausbeuten an Zellen erzielt werden, als bei der höchstmöglichen Assimilation des Alkohols durch die Zellen. Der Zusatz von Alkoholen erfolgt vorzugsweise in einer Menge von 0,03 bis 0,5 Volumprozent, bezogen auf das gesamte Medium.

Beispiel 1

Die kontinuierliche Gärung von Candida petrophilum ATCC Nr. 20226 wurde in zwei Gärtanks durchgeführt, welche ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung enthielten.

Nährmedium in dem ersten Tank:

Geradkettige Paraffine mit 14 bis 17 Kohlenstoffatomen (Reinheit 98 %

oder mehr) 20 ml

Ammoniumsulfat 0,3 g

Harnstoff 0,3 g

monobasisches Kaliumphosphat 0,1 g

dibasisches Kaliumphosphat 0,1 g

Äthanol 0,05 g

Magnesiumsulfat 0,01 g

Ferrosulfat 0,005 g

Maisquellwasser 0,2 g

Leitungswasser 100 ml

pH-Wert 5,5

Nährmedium in dem zweiten Tank:

Ammoniumsulfat 0,3 g

monobasisches Kaliumphosphat 0,1 g

dibasisches Kaliumphosphat 0,1 g

Natriumchlorid 0,1 g

Magnesiumsulfat 0,01 g

Ferrosulfat 0,005 g

Vitamin B₁ 100 γ

Leitungswasser

pH-Wert 4,5

100 ml

Das Nährmedium in dem ersten Tank enthält den Kohlenwasserstoff in einer Menge von 20 Volumenprozent, während das Nährmedium in dem zweiten Tank keinen Kohlenwasserstoff enthält. Das Nährmedium aus dem ersten Tank wurde in den zweiten Tank überführt, um die kontinuierliche Züchtung mit den angegebenen Verweilzeiten unter den nachstehend genannten Bedingungen durchzuführen. In den ersten und zweiten Tank, der ein Fassungsvermögen von 8 bzw. 40 Liter hatte, wurden 4 bzw. 20 Liter des entsprechenden Nährmediums eingeführt. Die Zellen in dem zweiten Tank wurden nach beendigter Gärung durch Zentrifugalabscheidung entfernt und die leichlere Flüssigkeit in den ersten Tank zurückgeführt, um ein Gemisch aus der leichteren Flüssigkeit und dem frischen Nährmedium in einem Verhältnis von 4: 6 Volumenteilen für die in diesem Tank durchgeführte Gärung zu bereiten. Die Verweilzeit im ersten Tank betrug 3 Stunden und die Gärung in dem zweiten Tank wurde während einer Dauer von 4 Stunden durchgeführt. Die Gärbedingungen umfaßten in dem ersten Tank eine Temperatur von 30⁰C, einen pH-Wert von 5,0 bis 6,0, der mit wäßrigem Ammoniak eingestellt wurde, 400 Upm und 60°/₀ Belüftung. Der zweite Tank wurde unter folgenden Bedingungen gehalten: 33°C, pH-Wert 4,5 bis 5,0, 400 Upm. und 1Γ^{Λη/ D}-lüftung. Die so gebildete Gärflüssigkeit wurde Westfalia-Separator separiert und in eine leichtere um.

Flüssigkeit wurde ein Sorbitanester einer aliphatischen Säure in einem Verhältnis von 0,005 g pro 100 ml der Gärflüssigkeit zugesetzt und das Gemisch auf 50⁰C erwärmt und anschließend separiert. Die so abgetrennten Zellen wurden mit Wasser gewaschen und in einem Trommeltrockner getrocknet. Die Ausbeute an Hefezellen (auf Trockenbasis) betrug 109 g pro 100 g des zugesetzten Kohlenwasserstoffs. Die Ausbeute bei der Isolierung der Zellen betrug 92 %> so daß die

Zellen als solche als Proteinquelle für Futtermittel Verwendung finden können.

Beispiel 2

Nach einem Verfahren, das mit dem in Beispiel 1 verwendeten Verfahren völlig identisch war, wurde Torulopsis petrophilum ATCC Nr. 20225 eingesetzt. Als Alkohol wurde Propanol verwendet. Propanol wurde in einer Konzentration von etwa 0,05 Volumenprozent kontinuierlich dem ersten Tank zugeführt. Die

kontinuierliche Gärung wurde unter Verwendung eines Waldhof-Tanks der gleichen Kapazität wie im Beispiel 1 als zweiter Tank vorgenommen. Unter Gärbedingungen und nach einer Behandlung nach der Abtrennung der Zellen gemäß Beispiel 1 wurde das getrocknete Mycel in einer Ausbeute von 104 g pro 100 g des zugesetzten Kohlenwasserstoffs erhalten. Der Wirkungsgrad der Abtrennung der Zellen unter Verwendung eines Westfalia-Separators betrug 92°/o- Die so erhaltenen Zellen können als solche als Proteinquelle für Tierfuttermittel verwendet werden.

Beispiel 3

Die kontinuierliche Gärung wurde in zwei Gärtanks durchgeführt, die ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung enthielten. Als Hefe wurde Candida petrophilum ATCC Nr. 20226 verwendet.

Nährmedium in dem ersten Tank:

Hexadecan 20 ml

Ammoniumsulfat 0,3 g

Harnstoff 0,3 g

monobasisches Kaliumphosphat 0,1 g

dibasisches Kaliumphosphat 0,1 g

Propanol 0,05 ml

Magnesiumphosphat 0,01 g

Ferrophosphat 0,005 g

Maisquellwasser 0,2 g

Leitungswasser 100 ml

pH-Wert 5,5

Nährmedium in dem zweiten Tank:

Ammoniurasulfat 0,3 g

monobasisches Kaliumsulfat 0,1 g

dibasisches Kaliumphosphat 0,1 g

Magnesiumsulfat 0,01 g

Ferrosulfat 0^005 g

Melasseabfall OJ g

Trimethyloctadecylammoniumchlorid 0^05 g

Leitungswasser lOo'ml

pH-Wert 5,5

Ein ähnliches Nährmedium, wie das im Beispiel 1 verwendete, wurde mit der Hefe beimpft und in das

^ ^ _ _ gleiche Gefäß gegeben. Nach beendigter Gärung im

oH^Wert'4 5 'bis^&5 0,400 Upm. und 100 °/o Be- 65 zweiten Tank wurden die Zellen durch Zentrifugieren iJ riL ,„ „.«Met* rJlrflfKwnrkeit wurde in einem entfernt und die leichtere Flüssigkeit in den ersten

Tank geleitet, in welchem die Gärung in einem Ge

eine schwerere Flüssigkeit getrennt. Der schwereren g misch aus der leichteren Flüssigkeit und frischem

309517/49

Nährmedium in einem Verhältnis von 4: 6 durchgeführt wurde. Die Verweilzeit in dem ersten Tank betrug 3 Stunden, und die Gärung im zweiten Tank wurde innerhalb von 5 Stunden abgeschlossen. Die kontinuierliche Gärung wurde unter folgenden Bedingungen im ersten Tank: 3O⁰C, pH-Wert 5,0 bis 6,0, 500 Upm und 100% Belüftung und im zweiten Tank bei 30° C, pH-Wert von 5,0 bis 6,0, 400 Upm und 100% Belüftung vorgenommen. Aus der so erhaltenen Gärflüssigkeit wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und die Gärflüssigkeit mit Schwefelsäure angesäuert. Dann wurde der angesäuerten Gärflüssigkeit Äther in einem Verhältnis von 300 ml Äther pro 1 Liter der Flüssigkeit zugesetzt. Die Extraktion wurde zweimal wiederholt und der Äther aus dem Extrakt unter

10

vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde an einem kühlen Ort stehengelassen, wobei 14 g kristalline Zitronensäure aus 1 Liter Fermentationsflüssigkeit erhalten wurden.
5

Beispiel 4

Eine Kultur von Brettanomyces petrophilum ATCC Nr. 20224 wurde unter Bedingungen gezüchtet, die

ίο den Bedingungen des Beispiels 1 mit der Ausnahme glichen, daß geradkettige Paraffine mit 11 bis 15 Kohlenstoffatomen (in einer Reinheit von 98 % oder mehr) verwendet wurden. Die Hefezellen wurden in einer ausbeute von 102 g auf Trockenbasis pro 100 g des zugesetzten Kohlenwasserstoffes erhalten.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

1. Verfahren zum aeroben Züchten von Kohlen-

wasserstoff abbauenden Hefen durch kontmuierliehe Gärung unter üblichen Bedingungen meinem

üblichen Nährmedium, das zwischen 200 und 360 C

siedende Kohlenwasserstoffe enthält, wobei ein

Teil des Nährmediums in Kreislauf geführt w,rd,

d a d u r c h g e k e η η ζ e i c h η e t, daß man die

HeitLnme⁸ Torulopsis petrophilum ATCC

Nr 20225, Candida petraphilum ATCC Nr. 20226

oderBretinomyces petrophilum ATCC Nr. 20224

einsetzt und verbrauchtes Nährmedium über einen

Emulgiertank durch ein Nährmedium ersetzt das

den Kohlenwasserstoff in hoher Konzentration,

verbrauchtes Nährmedium und Methanol, Äthanol,

Propanol, Isopropanol. Butanol, Pentanol Hexanol,

Heptanol, Capryl-, Nonyl-, Decyl- Lauryl-,

Myristyl-, Cetylalkohol oder Octadecanol ,n einer

Konzentration von 0,03 bis 0,5 Volumenprozent.

bezogen auf das Gesamtmedium, enthalt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff einen geradkettigen Kohlenwasserstoff verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Emulg.ertank eine Konzentration des Kohlenwasserstoffs von 5 bis 40 Volumenprozent, bezogen auf das gesamte