DE2004299A1

DE2004299A1 -

Info

Publication number: DE2004299A1
Application number: DE19702004299
Authority: DE
Priority date: 1969-01-30
Filing date: 1970-01-30
Publication date: 1970-08-20
Also published as: DE2004299B2; NL7001282A; DE2004299C3; NL161814B; GB1300087A; NL161814C; US3674640A; FR2029693A1

Description

B es c h r β i _b u η g

zu der Patentanmeldung

der Firma · .

ASAHI. KASEI KOGYO KABUSHIKI "XAISHA 25'-Iv i-chome, ßGoime-Hanisdori, Kita-icu 0 s a ka/Japan,

betreffend
Verfahren zum Züchten von Kohlenwasserstoff abbauenden Hefen

Priorität vom J?0. Jan* 1959, Hr- 6293/1969, Japan, 26. Febr.1969, Nr.13946/1969, Japan,

Die Erfindung besieht sich auf ein Verfahren sum Züchten Kohlenwssßerstoff--verbr8uchen.d0r Hefen. Sie betrifft insba- I sondere ein Verfahren zur v/irksamen Bildung von Hefen oder .Fermantationsprodukten aus Kohlenwasserstoffen. Dieses Verfahren v/ird als kontinuierliches Kulturverfahren einer dafür

ausgezeichnet geeigneten Speci-as einer Hefe, die zum Verbrauch von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoffquelle befähigt ist, la zwei Tanks durchgeführt. Dabei wird der eraulgierte Kohlenwasserstoff in einem Hauptfermentationstsnk (im zweiten Tank)

i -

00983/./1283

der Fermentation unterworfen. Zu diesem Zweck wird Kohlenwasserstoff verwendet, der in Form einer Emulsion in einem Emulgiertsnlc (erster Tank) erholten wird, welchem der Kohlenwasserstoff in hoher Konzentration, bus der Fermentation stammende Ablauge und ein Alkohol zugeführt werden« Die Erfindung betrifft v/eiterhin ein Verfahren zum Züchten von Hefen, einer Species des Genus Torulopsis Torulopsis petrophilum, einer Species des Genus Candida Gandide petrophilum oder einer Species des Genus Brettsnorcyces Erettanomyces petrophilum in eireir. I!edium_T welches aus einer bei Temperaturen im Bereich von 2CO bis 360° G siedenden Kohlenwasserstoff-Fraktion unc. einer wässrigen Lösung bestehb, die anorganische Salze, eins anorganische Sticcstoffquelle und eine organische iStickstoffquelle enthält, wie sie üblicherweise zum Züchten -/on Mikroorganismen verwendet werden. Zu diesem Zweck wird eine Emulsion dieses Mediums mit einem Teil der bereits verbrauchten Ablauge aus der Fermentation und einer geringen Menge eines Alkohols, wie Methylalkohol, Äthylalkohol oder rropylalkchol in einem Emulgiertank hergestellt und die Fomentation in einem Hsupttsnk unter Verwendung des emulgierten Kohlenwasserstoffs durchgeführt und die gebildeten Zailen und andera Produkte der Fermentation gewonnen.

Es ist bereits bekannt, dass einige Iükroorganisiaen die Fähigkeit besitzen. Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle abzubauen. Diese Mikroorganismen umfassen eine grosse Vielfalt von Bakterien, Actinomyceten, Hefen und Fungi. Bs wurde jedoch

BAD 00983A/1283

festgestellt, dass nur ein sehr eng begrenzter Bereich von Species den Kohlenwasserstoff rait hoher Wirksamkeit abbaut, 30 dass es äusserst schwierig ist, die Zellen in zufriedenstellender Weise auszunutzen und auf diese Weise wertvolle Naturprodukte, wie Proteine, Nucleinsäuren und Lipide im industriellen Maßstab aus Erdöl herzustellen.

Ziel der Erfindung ist daher ein neues Fermentationsverfahren, welches gestattet, Hefesellen in hoher Ausbeute, bezogen auf das Kohlenwasserstoff-Rohmaterial, zn erhalten (( und nach dem Hefen In einer kürzeren Kulturdauer gesuchtet werden können, die suf eine kürzere Emulgierdauer zurückzuführen ist.

Von dem erfindungsgimassen-Verfahren ■ zura Züchten von Kohlenwasserstoff -abbot"enden Hefen wird ausserdem gefordert, dass es in günstiger Weise im industriellen Maßstab durchführbar ist. ' '

Gemäss der Erfindung ist es nun gelungen. Mikroorganismen ä aus natürlichen Quellen au isolieren, rait denen diese Ziele erreicht werden können. Diese Mikroorganismen sind einige frieche Hefen, die den Genera Tcrulopsis, Oandida und Brettancaiyces angeheren.

Die Erfindung: basiert suf de? Feststellung, dass die Hefe mit guter Stetigkeit und Wirksamkeit' gebildet werden kann, indem ein Ksäium, des aus Kohlenwasserstoff, anorganischem

'..--. 0 0 9831/1283

Stickstoff, anorganischen Salaen und einer organischen Stickstoffquelle besteht und welchem die vorher verbrauchte Fermentationsebleuge souie eine geringe Menge eines Alkohols zugesetzt wird? in einen Emulgiertenk eingeführt wird, in welchem vorwiegend die Bildung einer Kohlenwasserstoffemulsion stattfindet und indem die Bildung des Mycels in dem zweiten Tank, das hei3St in dem Hauptfermentstionstenk, unter Verwendung; der emulgierten Fermentationsi'lüssigkeit durchgeführt wird, die bus dem ersten Tsnk zugeleitet wird. Mit Hilfe einer so durchgeführten, kontinuierlichen Fermentation können neben dem I lyeel Fermentationsprodukte, wie Aminosäuren, organische Säuren und Vitamine durch die angegebene Species nuVi; hoher tfirksomkeit gebildet werden.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Züchten von Kohlenwasserstoff-abbauenden Hefen durch kontinuierliche Fermentstion, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine zum Verbrauch von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoffquelie befähigte Hefespecies, Torulopsis petrophilum, Candida petrophilum oder Brett'jnomyces petrophilum, in einem Medium, wf-Jciies eine im Bereich von 2OG bis 360° G siedende Kohlenwasrarstoff-rraktion enthält, unter aeroben Bedingungen in einer vorrichtung züchtet, die aus (1) einem Emulgiertank, in dem aine Emulsion aus diesem Kohlenwasserstoff und einer wässrigen lösung gebildet wird und (2) einem mit diesem Tank in Heine geschalteten Heuptferaentetionstank besteht, in welches die Bildung der Zellen oder die ferraen-

009834/1283

tative Bildung von gewünschten Substanzen erfolgt, dass men dem Emulgiertank ein Medium zuführt, welches den Kohlenwasserstoff in hoher Konzentration, Fermentationsableuge aus dem Hauptferraentationstank und einen Alkohol in . einer Konzentration von 0,5 Volumprozent oder· weniger, bezogen auf das öesamtmedium, enthält und die im Emulgiertank erhaltene emulgierte Feriaentationsflüsslgkeit dem / Hauptfermentationstanfc zuführt.

Die in dein ersten und zweiten Tank angeviendeten Ferments« tionsbedingungen kannen in Abhängigkeit von der gezüchteten Species und diengewünschten Produkten variiert werden* So beträgt beispielsweise die Temperatur der Kultur 25 bis 37^G und es ist erforderlich* die Percientation unter aepobea Sedingungen durchzuführen und. den;'pH-Wert des Mediitias einzusteiien. ZüchtungsbeGingungen, wie Temperatur und pH-Wert können bei den in bekannten ..Verfahren verwendeten Werten genalten v/erden und unterliegen keiner spezifischen Begrenzung. ■

Als erfindungsgemäss verwendeter Alkohol können beliebige niedrige Alkohole, uia Methanol und Äthanol sowie beliebig ge höhere Alkohole, v/ie .Lauryl- und Öecylalkohol, eingesetzt werden« Die zuzusetzende i'-üenge des Alkohols kann verändert werden und liegt vorzugswaise im Bereich von .0,03 bis 0,5 Volumprozent, bezogen auf das gesaiatθ Kedium.

_BA0

00983 4/1283

Die Abtrennung der gebildeten Fermentationsflüssigkeit kann nach den in bekannten Verfahren angewendeten Methoden durchgeführt v/erden und umfasst beispielsweise die Trennung der Fercen-aationsflüssigkeit in eine schwerere und eine leichtere Flüssigkeit mit Hilfe eines V/estfaliaiSeparators, Einstellen des pH-Werts der schwereren Flüssigkeit auf etwa 5> Zugabe eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, beispielsweise Polyoxyäthylensorbitanmono-

fe laurat in einer Menge bis zu 0,005 ml pro 100 ml der Flüssigkeit, Erwärmen des Gemisches auf 50° C und anschliessendes Rühren, Abtrennen der Zellen aus der Flüssigkeit mit Hilfe eines Westfalia-Separators vom Düsentyp, Waschen der Zellen mit Wasser und (Trocknen in einem Trommeltrockner· Die Abtrennung der Fermentationsprodukte kann beispielsweise durchgeführt werden, indem die Fermentationsflüssigkeit!, aus der die Zellen entfernt worden sind, einer Behandlung zum Konzentrieren oder einer Behandlung mit einem lonenaustauscherharz zur fraktionierten Isolierung der rrodukte unter-

" worfen wird.

Das erste charakteristische Merkmal öer .Erfindung, nämlich die kontinuierliche Durchführung des Züohtungsverfahrens, wird nachstehend uni;er Bezugnahme auf die boiliogende Zeich-,._t nung beschrieben, in der ein Beispiel für die in dem erfindungsgeraässen Verfahren angev/endete Vorrichtung gezeigt wird. Wie aus der Figur hervorgeht, wird in dom kontinuierlichen Zweit8nk-Ferment8bionssystem ein Medium in dem ersten Tank

BAD ORIGINAL ~ ⁶ "" 009834/

vorgelegt^welches aus dein·'Kohlenwasserstoff. ^;±α hoher Konzentration, Vorzugsweise 5 bis 40 Volumprozent sowie an- * organiechen έ&ΐζβη",-einer Stickstoff quelle und einer organischen liährstöffqüel^^ besteht.'Diesen] System wird eine geringe Menge des i.lkohols zugesetzt und" dann der Kohlenwasserstoff eiaulgieri; und das Züchtungsverfahren durchgeführt. Die Emulsion aus dem ersten Tank wird entweder kontinuierlich oder intermittierend dem. zweiten Tank zugeleitet, in welchem die Kultur durchgeführt wird, indem ein aus ä anorganischen Salzen, einer Stickstoffquelle und einer. Quelle für organische Nährstoffe bestehendes wässriges Medium, welches keinen Kohlenwasserstoff, enthält, zugeführt wird.. Es ist-erforderlich, die Züchtung sowohl im ersten eis auch im zweiten Tank iinter aeroben Bedingungen ,vorzunehaen. In dem _; -■_ zweiten Tank wird in wirksamer Weise die Hauptfermentation, dös heisst die Bildung der Zellen oder Bildung der Fermeatationsprodukte durchgeführt.

Die Art der anorganischen Salze, der Stickstoffquellβ und f der Quelle für organische Nährstoffe, die in dem ersten und zweiten Tank'verwendet werden, unterliegt keiner speziellen Einschränkung. Diese Salsa können daher aus den nach dem Stand der Technik verwendeten Salzen eusgewählt werden· So sind beispielsweise eis anorganische Salze Kaliumdihydrpgenphosphat, Kaliumiaonohydrogenpbosphet, Msgnesiuiisulfat, Natriumchlorid, Perrosuifat, Mangansulfat, Zink3uif3t, Calcium- . Chlorid und ähnliche Verbindungen zu erwähnen. Als Quelle für

009834/

organische Nährstoffe können Pepton, II-Z-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Flüssigkeit aus der Getreidemaische, Ceseinhydrolysat, Fischmehl und dessen Hydrolysat und ahnliehe Substanzen verwendet werden.

Stickstoff enthaltende Materialien wie Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, beispielsweise Ammonium^ chlorid, Ammoniumsulfate Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniunphoaphat, Am/aoniumecotst sowie Harnstoff können 8ls Stickstoffquelle Verwendung finden.

Das zweite Merkmal des erfindungsgemässen Verfahrens ist der Zusatz der bereits verbrauchten Ferment^tionsablauge und ferner einer geringen Menge eines Alkohols, wie Äthanol und Methanol zu dtm ?rsten Tank. Der Zusatz der Fermente- · tionsablauge arfolgt vorzugsweise in einem Verhältnis von 5 bis 75 Volumprozent, bozogen auf daö gesamte Medium. Als FermentationsGblauje kann, wie in der l'igur gezeigt wird, die durch Zentrifugelebsoheiclung erhaltene leichtere Flüssigkeit verwendet'werden. Manchmal findet die Fermentationsablsu.^e vor der Zentrifugalsbscheidung oder deren Hydrolysat Verv/endung.

Das dritte charakteristische Merkmal des erfindungsgemässen Verfahrens lic-gt in -ier Verwendung der drei angegebenen Species, die ausgezeichnete Befähigung zum Abbau von Kohlenwasserstoffen zeilen, und die sich aufgrund ihrer aus-

- 8 - BAD ORIGINAL

009834/1283

gezeichneten Eigenschaften zur Verwendung als Nahrungs-

eignen.

Öurch Koöbinstipn der erf indtingsgemässen i-Jässnahraen nach deSi atiittdüttgsgeinässen Verfahren werden sehr viel bessere Ergebnisse als riech den bisher bekannten Methoden erzielt, wie aus der nachfolgenden Beschteibüng herVörgtM* Äunäöhst geetötitöt die icontintiittllöhe fermentation tätttef Verwendung §iö#i ^wiitäüK-teiiäentttiöttßsyöteaö die ^üfünining eimn |

Ausgengsmaterials, welches die Kohlenwasserstoffe in hoher

te* Auf diööe Weise wiiid ßür ©in kl$l« benÖMg'fc» in welOheM $£& iildüög ¹ deffl KöhieöWagäöratoff elm g^Äge*ö 2«it ' öi?töfdöft &%& bot del* Miiin^ng dee KoAXehwoiaeiiotofiu la niedtiget Köüaentifötion. Ms eefindüngsgemäööe Veiishtöö üß* teimeheideii äiöh von den bisher bekann-feen Verfahj?en dadta^öh» dasö üügätsilich zu dem Hauptferraentationistank ein Etaülgiei?"- ■ tank Vorgesehen ist. Zweitens ist bei dem efcfindungsgemässen Vai?fehi?en der Viii*kimgsgiisd des Kohlenv/ssge.rötoffabböüs äehr hoch* Wecn dem Stsrid der 'Teßhnik vrar es allgemein bekannt * dasä aus Kohlenwasseüstoffen, .insbesohdere aus geradekeiiti'-gen Kohlen v/asserst of fen/das "Hefemyoel in einem Verhältnis von 1 EU 1 gebildet v/Ird. Nach dem erfindüngsgeiaä3sen fahren Wird äedöGh-das IVIyGeI in eineto Verhältnis von als 1 i 1 aus dem Kohlenwassarstoff erhalten und die Permentatiönspfodükte Werden ebenfalls iti höherör Ausbeute als. bei bisher bekannten Verfahren gebildet* Es ist speziell hervor«·,

V₉-. " SAD

^uneben, d8ss bisher kein Verfahren existierte, bei dem die Ausbeute der Bildung von Hefemyöel, bezogen auf bugesetzten Kohlenwasserstoff, 100 <fi überschreitet. Eine Aus· beute von mehr als ICO # kann nach dem erfindungsgemäseen Verfahren zum ersten Mal durch Kombination der speziellen erfindungsgemässen Herkmale erzielt werden. Andere Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens sind aus der Beschreibung und den Beispielen ersichtlich. Die Wirkung des Zuestses der Permentetionsablauge und geringer Mengen des Alkohols gehen aus den nachstehend beschriebenen Versuchen hervor.

Bin erster Versuch wurde unter Verwendung von Candida pettophilum ATOO Hr* 20226 durchgeführt.

Das Medium in dem ersten Tank hat folgende Zusammensetzung:

öeradekettige Paraffine mit 14 bis 17 Kohlenstoffatomen (Reinheit 98 Jj oder tiehr)

Mengansulfet

Magnesiumsulfat Calciumchlorid Harnstoff Ammoniumsulfat Ferrosulfat Flüssigkeit aus Getreidemaische

- IO -

15 Volumprozent

0,004 Gewichtsteile pro 100 Volumteile

0,05

0,01 "

0,3 " · ■:■■■■··

0,2 ^M ■■·.·'

0,005 "

0,1 "

009834/1283

4 1 des wie oben zusammengesetzten Mediums mit einem pH-Wert von 4,5 ν;erden in den ersten Tank (mit einem Fassungsvermögen von 8 1) gegeben und die -Konzentrationen der Nährstoffquellen konstant gehalten. Bei der praktischen Durchführung werden die verbrauchten Anteile der anorganischen Salze, der Stickstoffquelle und der Quelle für organische Nährstoffe gemäss der Bestimmung der Ausbeute des gebildeten Produkts ständig ergänzt. Bei der Verwendung von Fermente tionsablauge zur Bildung der Emulsion werden die auf die oben angegebene Zusammensetzung fehlenden Bestandteileder Ablauge vor dem Verfahren zugesetzt. Die aerobe Kultur wird in dem zweiten Tank durchgeführt. Zu diesem Zweck v/erden 20 1 des i-lediums in den Tank mit 40 1 Fassungsvermögen gegeben. Diesen Tank wird eine wässrige Lösung derselben Zusammensetzung wie oben, mit Ausnahme des Kohlenwasserstoffs, kontinuierlich zugeführt. Es wird jedoch kein Kohlenwasserstoff zugesetzt. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse einer Bestimmung der für die Emulsionsbildung erforderlichen Zeit (Verweilzeit) in dem ersten Tank und der Wirkungsgrad der Zellbildung im zweiten Tank für den Foil angegeben, in welchem die Ablauge der Fermentation in einem Verhältnis von

5 bis 75 Volumprozent, bezogen auf das Gesamtmedium, züge-, setzt wird· Durch den Zusatz der Fermentationsablauge zu dem ersten Tank ist eine Verringerung der zum Emulgieren des. Kohlenwasserstoffs erforderlichen Zeit und eine Erhöhung der Ausbeute zu beobachten.

- 11 - BAD

0Ö9834/1283

Tabelle 1

Wirkung der Fermentstionseblauge ouf die Einulgierung und die

Mycelbildung

Konzentration der Emulgierdeuei· trockenes Mycel (g) pro Fermentationsab- (1· Tank),Std. zugesetzter Kohlenwesserlauge (Vol. SS) stoff (____# _______

10 25 50 75 o

5
5

3,5

92 „95

99 105 103

FermentationsbedinrTuagen in dem ersten Tank: 30 0, 500 Upm, Beliifung 60 ?ί, Flüssigkeitsvolumen ^ 1, Einstellung des pH-Werts auf 4,5 bis 5?0 mit Hilfe von wässrigem Ammoniak.

Fermentationsbedin^uagen in dem zweiten T3nk: 30° 0, 400 Upm_t Belüftung 100 >.-, Verweilzeit 4 Stunden.

In einem zweiten Versuch wurde derselbe Stamm und dss gleiche Medium v/ie in Versuch 1 verwendet, nit der Ausnahme, dass die Fermentaticnsablauge dem ersten Tank in einer Konzentration von 25 Volumprozent, bezogen auf das Gesamtmedium, zugesetzt wurde und :.ie wirkung der Zugabe des Alkohols zu dem ersten Tank geprüft v/urde. Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Ergebnisse.

BAD ORIGlNAL

009834/1283

- 12 -

!Tabelle

Wirkung des Alkoholzusatzes Koaaentratiop des Alkohols» Vol. ff

2UÜ4299

0,0? ff

Alkohol

ΨΨ ¹W «W H»«·»·· ·■·

Methanol

Pcoponol 106
108
UX
112
110

109

106

XXO

XXX

IXf

117

oq

101 %

118 1X9 1X7

XOS 108

XXX

XXO

XXX

xxa xxa

XX¹?

in dar

Qramra ppo, IQQ QQVfioht;steile des

güa

h^it BAD

Zugabe der Fermentationsablauge und des Alkohols eine bemerkenswerte synergistische Wirksamkeit.

Die Wirkung des Alkoholzusataes ksnn einer verbesserten Wirksamkeit der Assimilation des Kohlenwasserstoffs durch die Zellen zugeschrieben werden, ist jedoch nicht auf eine Assimilation des Alkohols als Kohlenstoffquelle durch die . Zellen zurückzuführen. Dias ist aus der Tatsache verständlieh, dass höhere Ausbeuten an Zellen erzielt werden, als bei der höchstmöglichen Assimilation des Alkohols durch die Zellen. Der Zusatz von Alkoholen erfolgt vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,03 bis etwa 0,5 Volumprozent,, bezogen auf das gesamte Medium.

Wie bereits angegeben, ist zur konstanten Bildung der 3?ermentationsprodukte in hoher Ausbeute, bezogen auf den Kohlenwasserstoff , und mit geringem Zeitaufwand und zur Isolierung dieser Produkte die erfindungsgemässe Kombination der Verwendung eines zum wirksamen Abbau von Kohlenwasserstoffen befähigten Stammes mit der Verwendung von zwei Peraientationstanks, nämlich einem Emulgiertank uad einem Heuptfermentationstank und dor Zugabe der bereits gebrauchten Fermentationsabiauge and eines geringen Anteils eines Alkohols zu dem Emulgiartsnk äusserst geeignet. Die erfindungsgemisse» in zwei Tanks durchgeführte Fermentation ist durch Ihr ^erfahrensprinssip von den bisher verwendeten Zweitankftrraeatationen völlig verschieden, bei denen ein in Serie

009834/1283

angeordneter ReifetBnk vorgesehen wer.

Die Erfindung soll nun durch die folgenden Beispiele näher veranschaulicht werden.

Beispiel 1

Die kontinuierliche Fermentation einer -Jiefe wurde :in zwei ^

^durehgeführ*» ^elche^ ein; Medium der-. ν ä

enthielten* Als Hefe, wurde. Can--^ ^

dida peinrophiilunt ATGG Nr.:v2Oa2&"^erwendet. - ^: : iv; . ^

Medium^in_dem_ersten_i_Tank£ .; y^ ; ς % κ

geredekettige Paraffine mit 14 bis 1? Kohlenstoffatomen (Reinheit 98S oder

mehl*) ''"'■ ^:'·^ν" ^: '" ■-■·■' "/"·' ■ - -.■.;■.·■■-,-.- 20 ml ' "

Ammoniumsulfat ' ° · 0,3 g

Herhstoff 0,3 g

monobasisches Kariumphosphat -?·.;.·-.■■-. 0,1 g

dibasisches Kaliunphosphat .^ ö;l'"g^{: ;}

Äthanol 0^05 g

Magnesiürasulfat 0,01 g

FerroBüifaTb 0,005 g

PiussigkVit aus der Getreidemeische 0,2 g

Leitungswasser 100 ml

009834/1283

Ammoniumsulfat 0,3 g

monobasisches Kaliumphosphat 0,1 g

dibasisches Kaliumphosphat 0,1 g

Sodium Natriumchlorid 0,1 g

Magnesiumsulfat 0,01 g

Ferrosulfat . 0,005 g

Vitamin B₁ 100 γ

Leitungswasser * 100 ml

ρ H-IVe vt 4,5

Das Medium in dem ersten Tank enthält den Kohlenwasserstoff in einer Menge von 2ü Volumprozent, während das Medium in dem zweiten Tenk keinen Kohlenwasserstoff enthält. Die Fermentationslauge wurde aus dem ersten Tank in den zweiten Tank überführt, um die kontinuierliche Züchtung mit den angegebenen Verweilzeiten unter den nachstehend genannten Bedingungen durchzuführen. In den ersten und zweiten Tank, der ein Fassungsvermögen von 8 1 bzw. 40 1 hette, wurden 4 1 bzw. 20 1 des entsprechenden Mediums eingeführt. Die Zellen in dem zweiten Tsnlc wurden nach beendigter Fermentation durch Zentrifugalabscheidung entfernt und die leichtere Flüssigkeit in den ersten Tank eingeführt, um ein Gemisch aus der leichteren Flüssigkeit und dem frischem Medium in einem Verhältnis von 4 : 6 Volumteilen für die in diesem Tenk durchgeführte Fermentation zu bereiten. Die Verweilzeit im ersten Tank betrug 3 Stunden und die Fermentation in dem zweiten Tank wurde

009834/1283

während einer Dauer von 4 Stunden durchgeführt. Die Ferinentationsbedingungen umfassten in dem ersten Tank eine iernperatur von. $0° Ö, einen pH-Wert von 5,0 bis 6,O₁ der mit wässrigem Ammoniak eingestellt würde, 400 Upm und 60 % Belüftung. Der zweite Tank wurde unter folgenden Bedingungen 53° G, "pH-Wert 4,5 bis 5,0, 400 Upm, und 100 °/o Belüftung. Die so gebildete Permentationsflüssigkeit wurde in einem Westfalis-Sepoü8tor der.ZentrifusBlabscheidung unterworfen und in eine leichtere und eine schwerere Flüssigkeit ge~ .-trennt. Der schwereren Flüssigkeit wurde ein ßörbitanester_;· einer aliphatischen,Säure in einem Verhältnis von 0,003 S ' ' pro 100 ml der Fermentationsflüssigkeit zugesetzt und das Gemisch auf 30° 0 erwärmt und anschliessend der Zentfifu» galabscheidung uhterworfan» Die so abgetrennten Zellen wur* den mit Wasser, "gewäsehen und in einem IJrommeltrockner getrocknet» Die Ausbeute an Hefezellen (auf Trockenbasis) betrug 109 g pro 100 g des zugesetzten Kohlenwasserstoffs« Die Ausbeute bei der Isolierung, der Zellen betrug 92 $,. so dass die Zellen als solche als Proteinquelle für Futtermittel |

Verwendung finden können»

Beispiel 2 _v

Wach einem Verfahren, das mit dam in Beispiel 1 verwendeten Verfahren völlig identisch war, wurde eine Kultur von Torulopsis petrophilum AICG Wr. 20225 erzeugt. Als Alkohol ■ wurde Propanol verwendet. Propanol wurde in einer Konzentration von etwa 0*05 Volumprozent koiitinuierlieh dem ersten

00983IT1283—

Tank zugeführt. Die kontinuierliche Fermentation wurde unter Verwendung eines tfaldhof-Tenka der gleichen Kapazität wie in Beispiel 1 als zweiter Tenk vorgenommen. Unter Fermentationsbedingungen und nach einer Behandlung nach der Abtrennung der Zellen, die den Bedingungen des Beispiels gleich weren, wurde das getrocknete Hycel in einer Ausbeute von 104 g pro 100 g des zugesetzten Kohlenwasserstoffs erhalten. Der Wirkungsgrad der Abtrennung der Zellen unter Verwendung eines IJestfolia-Seperators betrug 92 #. Die so erhaltenen Zellen können als solche als Proteinquelle für Tierfuttermittel verwendet werden.

Beispiel 3

Die kontinuierliche Fermentation von Hsfo wurde in zwei Fer mentationstanks durchgeführt, die ein Medium dor folgenden Zusammensetzung enthielten. Als Hefe wurde Candida petrophilum ATOC Nr. 20226 verwendet.

normal Hexodecan 20 ml

Aramoniuinsulfat 0,3 g

Harnstoff 0,3 g

monobasisches Kaliumphosphat 0,1 g

dibesisches Kaliumphosphat 0,1 g

Propanol 0,05

Magnesiumphosphat 0,01 g

18 - BAD

009S34/12ST

Ferrophosphet 0,005 g

Flüeeigkeit bob der Getreidemeiache 0,2 g

Leitungswasser 100 ml pH-Wert 5»5

Ammoniumsulfat 0,5 S

monobesieches -/Kaliumsulfat.. 0,1 /g

dib8sisches Kaliumphosphat 0,1 g

Magnesiumsulfat 0,01 g

Ferrosulfat 0,005 g

Melesseabfall . 0,5 S

• ■

TriDethylöctadecylemmoniumclilorld 0,05 g

Leitungswassar 100 ml pH-Wert

Ein ähnliches Medium, wie das in Beispiel 1 verwendete, wurde mit der Hefe angeimpft und in das gleiche Gefäss gegeben. Nach beendigter Fermentation im zweiten Tank wurden die ZeI-len durch Zentrifugalabscheidung entfernt und die leichtere Flüssigkeit in den ersten Tank geleitet, in weichem die Fermentation in einem Gemisch aus der leichteren Flüssigkeit und frischem Medium in einem Verhältnis von 4:6 durchgeführt wurde» Die Verweilzeit in dem ersten Tank betrug 3 Stunden und die Fermentation im zweitön Tank wurde innerhalb von 5 Stunden vervollständigt. Die kontinuierliche Fermentation wurde unter folgenders Bedingungen im ersten Tank: 50° C,

- 19 ^

009834/1283

pH-Wert 5,0 bis &,O, 500 Upm und 100 fj Belüftung und im zweiten Tank bei 30° 0, pH-Wert von 5,0 -bis 6,0, 400 Upm und 100 # Belüftung vorgenommen. Aus der so erhaltenen Fer mentationsflüssigkeit wurden die Zellen durch Zentrifugalsbscheidung entfernt und die Fermentstionsflüssigkeit mit Schwefelsäure ongesäuert. Dann wurde der angesäuerten Fermentetionsflüssigkeit Äther in einem Verhältnis von 500 ml Äther pro 1 1 der Flüssigkeit zugesetzt. Die Extraktion wurde zweimal wiederholt und der Äther aus dem Extrskt unter vermindertem Druck entfernt» Der Rückstand wurde en einem kühlen Ort stehengelassen, wobei 14 g kristalline Zitronensäure aus 1 1 Fermentationsflüssigkeit erhalten wurden.

Beispiel 4

Eine Kultur von Brettanomyces petrophilum ATVV Nr· 20224 wurde unter Bedingungen gezüchtet, die den Bedingungen des Beispiels 1 mit der Ausnehme glichen, dass geredekettige Paraffine mit 11 bis 15 Kohlenstoffatomen (in einer Reinheit von 98 ^c/> oder mehr) verwendet wurden. Die Hefezellen wurden in einer Ausbeute von 102 g auf Trockenbasis pro 100 g des zugesetzten Kohlenwasserstoffes erhalten.

Patentensprüche

- 20 - bad ORiGiNAL

009834/1283

Claims

P a t e η t e η s ρ r ü ο h e

Verfahren zum Züchten von Kohlenwasserstoff-abbsuenden Hefen durch kontinuierliche Fermentation, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t, dass man eine zum Verbrauch von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoffquelle befähigte Hefespecies, Torulopsis petrophilum, Candida petrophilum oder Brettanomyces petrophilum, in einem Medium, welches eine im Bereich von 200 bis 360 G siedende Kohlenwasserstoff -Fraktion enthält, unter aeroben Bedingungen in einer Vorrichtung züchtet, die aus (1) einem Emulgiertank, .in dem eine Emulsion aus diesem Kohlenwasserstoff und einer wässrigen Lösung gebildet wird und (2)· einem mit diesen Tank in Reihe geschalteten Hauptfermentationstank besteht, in welchem die Bildung der Zellen oder die fermentative Bildung von gewünschten Substanzen erfolgt, dass man dem Emulgiertank ein Medium zuführt, welches den Kohlenwasserstoff in hoher Konzen- ■-■. tration, Fermentationsabiauge aus dem Hauptfermenta- -·-.; ^ tionstank und einen Alkohol in einer Konzentration von V 0,5 Volumprozent oder weniger, bezogen auf das Gesamtmedium, enthält und die im Emulgiertank erhaltene emulgierte Fermentationsflüssigkeit dem Hauptfermentations-" tank zuführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n η - ■---ζ e i c h η e t, dass man als Kohlenwasserstoff einen

ORIGINAL

geradekettigen Kohlenwasserstoff verwendet.
3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g β k θ η η -

zeichnet, dass man in dem Emulgiertank eine Konzentration des Kohlenwasserstoffs von 5 bis 40 Volumprozent, bezogen auf das gesamte Medium, einhält.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentationseblauge in einer Menge von 5 bis 75 Volumprozent, bezogen auf das Gesamtmedium, in den Emulgiertank zurückführt.

22 -

009834/1283