DE2208279A1

DE2208279A1 - Enzymatischer Abbau von Nucleinsäuren in SCP Materialien

Info

Publication number: DE2208279A1
Application number: DE19722208279
Authority: DE
Inventors: Kwei Chao Naperville IH Chao (V St A)
Original assignee: Standard Oil Co , Chicago, 111 (V St A)
Priority date: 1971-02-22
Filing date: 1972-02-22
Publication date: 1972-09-14
Also published as: DE2208279C3; BE779667A; FR2126312B1; IT1048977B; FR2126312A1; GB1376781A; NL7202297A; US3809776A; DE2208279B2; CA991473A

Description

SiCANDÄED OIL COMPANY, Chicago, Illinois 60605/USA

Enzymatischer Abbau von Nucleinsäuren in SCP-Materialien

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren, um den Nucleinsäuregehalt in einzelligen Protein(SCP)-Materialien zu vermindern, auf eine Menge, die in Nahrungsmittelprodukten annehmbar ist. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man unicellulare Mikroorganismen physiologisch konditioniert, die Nucleinsäuren durch endogene Nucleasen abbaut und die abgebauten Produkte in das umgebende Medium auslaugt. Die Behandlung erfolgt durch kontinuierliches Verteilen von Sauerstoff, Regulieren der Temperatur und Kontrolle des pH-Wertes. Aus den Zellen wird im wesentlichen kein Proteinmaterial entfernt.

In den letzten Jahren hat man versucht, den Wohlstand der Weltbevölkerung zu erhöhen, und insbesondere sucht man nach zusätzlichen Möglichkeiten, um die laufend zunehmende Weltbevölkerung zu ernähren. Dieses Problem bedeutet, daß

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man eine ausreichende Kalorienaufnahme und eine ausgeglichene Diät gewährleisten muß, wobei man besonders beachten muß, daß in vielen Teilen der Welt ein Mangel an Nahrungsmitteln besteht, die ausreichend Protein liefern. Eine Möglichkeit, um die erforderlichen Proteinvorräte zu schaffen, besteht im Wachstum von Mikroorganismen, die einzelliges Protein ergeben wie von Hefen, Bakterien und Algen und die man entweder in Form von Nahrungsmitteln oder als Nahrungsmittelzusatzstoffe verwenden kann. Die Herstellung von einzelligen Protein(SCP)-Materialien in einer großen Menge kann durch Fermentationsverfahren erreicht werden, bei denen man beispielsweise Kohlehydrate, Kohlenwasserstoffe oder Sauerstoff enthaltende Kohlenwasserstoffmaterialien als Substrate verwendet. Dabei ist es wichtig, daß die Substratmaterialien billig sind und von den ausgewählten Mikroorganismen leicht verbraucht werden, so daß die Verfahrenskosten nicht zu hoch sind. deich wichtig ist die Annehmbarkeit und Verwendbarkeit des SCP-Materials als Nahrungsmittel oder als Nahrungsmittelbestandteil. Diese letzteren Betrachtungen umfassen Geschmacks- und Geruchsfaktoren, die damit, ob die Verbindungen von der Öffentlichkeit angenommen werden oder nicht, in Beziehung stehen, sowie auch metabolische und toxische Faktoren, die bedingen, ob die SCP-Materialien geeignet sind, bei der menschlichen Ernährung Verwendung zu finden.

Sowohl in der technischen als auch in der Patentliteratur werden Fermentationsverfahren zur Herstellung von Mikroorganismen beschrieben, die leicht wertvolle SCP-Materialien ergeben. Beispielsweise wurden Hefen auf Kohlehydraten, die in Abfallsulfitflüssigkeiten enthalten sind, auf n-Alkanbestandteilen von Gasölkohlenwasserstoffbrennstoffen und auf einer Mischung aus sauerstoffhaltigen Kohlenwasserstoffen gezüchtet. Aul" ähnliche Weise ist die Herstellung von Bakterien beschrieben. Die Fermentation, bei der Hefen oder Bakterien gebildet werden, umfaßt ein

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Oxydationsverfahren, bei dem viel Wärme entsteht und wobei eine beachtliche Sauerstoffübertragung erforderlich ist und die Fermentationstemperatur genau reguliert werden muß. Bevorzugte Substratmaterialien enthalten schon so viel gebundenen Sauerstoff wie möglich, um die Wärmeabgabe und den Bedarf an Sauerstoff möglichst klein zu halten. Bei der Herstellung von SCP-Material in Nahrungsmittelqualität kann es ebenfalls erforderlich sein, eine Extraktionsstufe durchzuführen, um die Anwesenheit unerwünschter, restlicher Substratmaterialien wie Kohlenwasserstoffe mit hohem Molekulargewicht oder wenig fermentierte , Sauerstoff enthaltende Kohlenwasserstoffmaterial!en zu beschränken.

Eine Anzahl von Fermentationsverfahren, die entwickelt werden oder die heute zur Herstellung von SCP-Materialien eingesetzt werden, soll hauptsächlich Zusatzstoffe für Tierfutter liefern, und somit liefern diese das Protein für den menschlichen Bedarf nur indirekt. Einige Mikroorganismen, insbesondere bestimmte Hefen innerhalb der Saccharomycetoideae- und der Cryptococcoideae-Unterfamilien wurden von der Food and Drug Administration für die direkte Verwendung in Nahrungsmitteln, die für den menschlichen Bedarf gedacht sind, genehmigt.

Das menschliche metabolische System liefert Harnsäure beim Metabolismus von Ribonucleinsäure (RNA). Da die Menschen kein Uricaseenzymsystem besitzen, wird die Harnsäure nicht weiter abgebaut und mit dem Urin ausgeschieden. Da die Harnsäure in Wasser eine niedrige Löslichkeit besitzt, sammelt sie sich im Körper in kristalliner Form an, wenn sie in größeren Mengen gebildet wird als sie der Körper ausscheiden kann. Dies kann zu Zuständen führen, die als Gicht bekannt sind. Viele Ernährungswissenschaftler empfehlen daher, daß die RNA-Aufnähme in der Diät möglichst niedrig gehalten wird.

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Mikrobielle Zellen oder einzellige Protein(SCP)-Materialien enthalten von k% bis 30% öder mehr Nucleinsäuren entsprechend ihren Wachstumsgeschwindigkeiten und ihrer Wachstumsphase. Im allgemeinen trifft man höhere Nucleinsäuregehalte in den mikrobiellen Zellen an, wenn schnelle Wachstumsphasen verwendet werden. Werden die mikrobiellen Zellen als Proteinquellen in menschlichen Nahrungsmitteln verwendet, so empfehlen die Ernährungswissenschaftler im allgemeinen, daß die Menge an Nucleinsäuren, die durch SCP der Diät beigefügt wird, 2 g/Tag nicht überschreiten soll.

Die berechneten RNA-Gehalte einiger bekannter Proteinquellen sind in Tabelle I angegeben. Diese variieren von 0 bis 4%. Der RNA-Gehalt von SCP liegt im allgemeinen im Bereich von 8 bis 1896 für exponentielles Zellenwachstum (exponential growth phase cells). In SCP, das für den menschlichen Gebrauch bestimmt ist, sollte der RNA-Gehalt vorzugsweise auf ungefähr 2%, bezogen auf das Trockengewicht der Zelle, vermindert sein.

Tabelle I

RNA-Gehalt (berechnet) verschiedener Proteinquellen Nahrungsmittel % RNA

Milch 0

Bohnen 1,7

Lachs 2, 4

Geflügel 2,9

Rindfleisch 3,7

Schweinefleisch 4,1

Leber 9,3

Anchovis 14,5

SCP 8-18

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Eine bevorzugte Art, SCP-Materialien zu verwenden, besteht darin, dieses in Form der ganzen Zellen einzusetzen. Dementsprechend besteht ein Bedarf, um Möglichkeiten zu schaffen, um Nucleinsäuren aus den mikrobiellen Zellen zu entfernen. Dieses sollte wünschenswerterweise möglich sein mit minimalem Verlust der Proteinmaterialien aus den Zellen, um den Nährwert solcher SCP-Materialien zu erhalten.

Eine Möglichkeit, die oben erwähnten Ziele zu erreichen, besteht darin, daß man die Enzymsysteme, die bereits in den unicellularen Mikroorganismen vorhanden sind, ausnutzt, indem man die latenten Enzyme so aktiviert, daß sie auf bestimmte Weise die besonderen Nucleinsäurespezien, die in dem SCP-Material vorhanden sind, abbauen oder diese hydrolysieren. In einem solchen Verfahren werden Mg-Ionen von dem Nährsystern ferngehalten.

Bei diesem Verfahren

werden während der Fermentation in dem Nährmediumsystem Magnesiumionen ferngehalten, um die Aktivität der RNase zu erhöhen und um gleichzeitig die RNA-Polymerase zu desaktivieren. Bei bevorzugten Bedingungen wird die mikrobielle Kultur auf 45 bis 100⁰C unter alkalischen Bedingungen erwärmt und nach dem Abkühlen mit Glucose versetzt, wobei die Glucose bei der letzten Fermentationsstufe als Diffusionsaktivator bzw. als Ausströmungsaktivator (leakage promoter) wirkt.

Ein anderes Verfahren wurde von Ohta, Maul, Sinskey und Tannenbaum in einer Publikation beschrieben und in einem Vortrag, der beim i60. ACS National Meeting, Chicago, Illinois, im September 1970 gehalten wurde, erwähnt. Bei diesem Verfahren wird eine sehr verdünnte (weniger als 1 Gew.% Zellen) wäßrige Aufschlämmung von Hefezellen gemäß einem spezifischen Temperatürzyklus erhitzt: sehr kurz (3 bis 17 Sekunden) bei 65 bis 70⁰C, um die Zellen abzuschrecken, dann 1 bis 2 Stunden bei 45 bis 50⁰C und schließlich unge-

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fähr 1 Stunde bei 55 bis 6O°C. Es wird beschrieben, daß das Abschrecken mit Wärme kritisch ist. Der optimale pH-Bereich beträgt 5,0 bis 6,5, was im Gegensatz zu den alkalischen Bedingungen steht, die bei dem ersten Verfahren bevorzugt sind.

Mit beiden beschriebenen Verfahren wird der Gehalt an Nucleinsäuren in cellularen Materialien vermindert. Beide Verfahren besitzen jedoch den Nachteil, daß sie nur mit relativ verdünnten Fermentationslösungen durchgeführt werden können. Enzymatische Abbauverfahren, die zur Behandlung konzentrierter Zellcremes bzw. Zellmassen, die im wesentlichen von der ursprünglichen Fermentationslösung mit ihren Mineralsalznährbestandteilen befreit sind, verwendet werden können, sind erforderlich, um wirtschaftlich annehmbare Verfahren zu entwickeln, die man verwenden kann, um Nahrungsmittelmaterialien aus SCP herzustellen, die die gewünschten Nähreigenschaften besitzen bzw. die Ernährungsstoffe in richtigen Verhältnissen enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist ein neues und verbessertes Verfahren, um den Nucleinsäuregehalt von SCP-Materialien zu erniedrigen zu einer Menge, die im allgemeinen in Nahrungsmittelprodukten, die für den menschlichen Verbrauch bestimmt sind, annehmbar ist. Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls neue und wertvolle Nahrungsmittelprodukte und Nahrungsmittelbestandteile, die SCP-Materialien enthalten und die einen geeigneten niedrigen Nucleinsäuregehalt aufweisen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren findet ein endocellularer enzymatischer Abbau der Nucleinsäuren statt, und die entstehenden wasserlöslichen Fragmente diffundieren in das umgebende wäßrige Medium. Die unicelluloaren Mikroorganismen werden zuerst physiologisch bei 3O°C unter ⁿHunger-od.Mangelbedingungen ⁿ (starvation conditions) konditioniert und dann gegebenenfalls bei O⁰C kalt abgeschreckt, um die

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Aktivierung der endogenen Nucleasen zu induzieren. Danach erfolgt eine Inkubation bei einer regulierten Temperatur von 50 bis 55° C und einem pH-Wert von 5,0 bis 5»5> während der Abbau fortschreitet, vorzugsweise in Anwesenheit von ungefähr 0,1 Mol Acetationen. Während der Behandlung erfolgt eine Belüftung durch Versprühen mit einem Gas, das Sauerstoff liefert.

Die entstehende, verbesserte SCP-Nahrungskomponente weist im wesentlichen keinen Verlust an ihrem Proteingehalt auf und enthält weniger als 2 Gew.% (bezogen auf Trockengewicht) Nucleinsäuren.

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren, um den Nucleinsäuregehalt von unicellularen Mikroorganismen zu vermindern und die neuen und verbesserten Nahrungsmittelprodukte, die dabei erhalten werden.

Es wurde gefunden, daß die Hauptmenge der Nucleinsäure, die in einzelligen Mikroorganismen enthalten ist, entfernt werden kann, wenn man den Abbau der Ribonucleinsäure (RNA) durch endogene Ribinucleasen (RNase) unter kontrollierten Bedingungen durchführt, verbunden mit einem Abströmen der löslichen, abgebauten Produkte in das umgebende Medium. Dies ist möglich, ohne daß die Proteinzusammensetzungen, die in den Zellen enthalten sind, merklich angegriffen werden. Die Effektivität des Verfahrens hängt von einer genauen Temperatur- und pH-Kontrolle ab, und sie wird verbessert, indem man entweder Acetat- oder Äthylendiamintetraacetat-Ionen oder beide Sorten von Ionen in dem Medium als Extraktionsverbesserungsmittel (extractant) verwendet. Auf diese Weise ist es durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, einzelliges Proteinmaterial in Form intakter Zellen mit einem Nucleinsäuregehalt, der wesentlich unter 2 Gev.% liegt, herzustellen.

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Die Wirksamkeit enzymatischer Verfahren hängt stark von den Kulturbedingungen der Zellen ab. Die Aktivität der endogenen NA-abbaubaren Enzyme entspricht dem physiologischen Zustand der Zellen. Wenn das Wachstum durch ungünstige physikalische oder chemische äußere Einflüss.e begrenzt wird, beispielsweise wenn in einzelnen Kulturen die Wachstumsgeschwindigkeit abnimmt, sind die Zellen gegenüber ihren eigenen autolytischen NA-abbaubaren Enzymen empfindlicher, und man erhält eine vergleichsweise höhere NA-Reduktionswirksamkeit. Schneller wachsende Zellen mit höherem intracellularem NA-Gehalt sind gegenüber der NA-Reduktionsbehandlung resistenter. Ein Wechsel in dem physiologischen Zustand der Zellen durch Einstellung der Kulturbedingungen wie durch "Verhungern an Substrat" kann die latenten, endogenen NA-abbaubaren Enzyme aktivieren wie Ribosomalribonucleasen und somit die Wirksamkeit des enzymatischen NA-Abbauverfahrens verbessern. Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem die mikrobiellen Zellen physiologisch durch Wechsel in den Kulturbedingungen konditioniert werden, so daß die endogenen Nucleasen aktiviert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann allgemein bei Mikroorganismen und insbesondere bei solchen Organismen, die als Bakterien,Hefe und Pilze bezeichnet werden, verwendet werden. In Tabelle H sind Bakterien, in Tabelle III Hefen und in Tabelle IV Pilze aufgeführt, die geeigneterweise als Mikroorganismen verwendet werden können.

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Tabelle II - Geeignete Bakterien

Acetobacter sp. Arthrobacter sp. Bacillus subtilis Corynebacteria sp. Micrococcus sp. Pseudoinonas sp.

Tabelle III - Geeignete Hefen

Candida curvata Candida lipolyfcica Candida pulcherima Candida utilis Hansenula anomala Hansenula miso Oidium lactis Saccharomyces carlsbergensis Saccharomyces fragilis Trichosporon cutaneum Saccharomyces cerevisiae Candida parapsilosis Hansenula wickerhainii Pichia pa.storis Pichia haplophyla

Tabelle IV - Geeignete Pilze oder Fungi

Aspergillus niger Penicillium notatum

Aspergillus glaucus Penicillium chrysogenum

Aspergillus oryzae Penicillium glaucum

Aspergillus terreus Penicillium griseofulvin Aspergillus itaconicus

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- ίο -

Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces fragilis und Saccharomyces carlsbergensis sind jedoch für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugte Ausgangsmaterialien, da alle von der F.D.A. für die Verwendung in Nahrungsmittelprodukten genehmigt wurden.

Mikrobielle Zellen, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, können aerob entweder ansatzweise oder kontinuierlich gezüchtet v/erden. Man kann jedes geeignete Substrat, das Kohlenstoff liefert, verwenden, obgleich Äthanol als Substrat bevorzugt ist, wenn man SCP-Produkte herstellen will, die in Nahrungsmitteln verwendet werden sollen. Man kann jede bekannte Kombination von Mineralnährstoff elementen verwenden. Eine zweckdienliche Stickstffquelle ist Ammoniak, das ebenfalls in das Fermentationsgefäß in der erforderlichen Menge eingeführt werden kann, um den pH-Wert der Fermentationslösung innerhalb eines bestimmten Bereichs, vorzugsweise innerhalb des Bereichs von 3,5 bis 5,5, zu halten. Zellen, die mit schneller Geschwindigkeit gezüchtet wurden, besitzen im allgemeinen einen höheren Gehalt an Nucleinsäure, während solche, die langsamer gezüchtet wurden, dazu neigen, weniger permeable Zellwände zu besitzen. Beide Zellenarten wie auch Zellen, die unter Bedingungen, bei denen der Sauerstoff beschränkt war, oder unter Bedingungen, bei denen das Substrat beschränkt war, gezüchtet wurden, können auf erfindungsgemäße Weise behandelt werden, um verbesserte und annehmbare Nahrungsmittel und Nahrungsmittelbestandteile zu ergeben, die für den menschlichen Verbrauch geeignet sind.

Unabhängig davon, ob die Fermentation ansatzweise oder kontinuierlich durchgeführt wird, sollte die abfließende Reaktionsmischung, die aus einer Lösung-Zellmischung besteht, abgetrennt werden, und es sollte ein Zellenkonzentrat hergestellt werden. Dies kann beispielsweise durch Filtration,

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Dekantieren oder Zentrifugieren geschehen. Die Zellen sollten vorzugsweise mit Wasser gewaschen und dann konzentriert (vorzugsweise zentrifugiert) werden, wobei man eine "Zellencreme", die 5 bis 15 Gew.% Zellen enthält (bezogen auf Tro ckengewicht) erhält.

Die Zellencreme oder -aufschlämmung wird in eine Konditionierzone oder ein Fermentationsgefäß gegeben, gerührt und bei ungefähr 30° gehalten, während Luft oder ein anderer Gasstrom, der Sauerstoff liefert wie eine Mischung aus Sauerstoff-Stickstoff, durch irgendeine geeignete Sprühvorrichtung eingeführt wird. Der pH-Wert der Zellcreme sollte bei ungefähr 4,0 gehalten werden. Vorzugsweise fügt man eine wäßrige Ammoniaklösung, geeigneterweise 5%igen wäßriges Ammoniak, zu der Creme, wie es erforderlich ist, um zu verhindern, daß der pH-Wert unter 4,0 fällt. Durch diese Bedingungen werden die Zellen physiologisch konditioniert, da sie Mangel an Nährmedium leiden, während sie kontinuierlich belüftet werden. Die Verlagerung des endogenen Metabolismus wird erkenntlich, wenn sich der pH-Wert der belüfteten Zellencreme zu erhöhen beginnt, ohne zusätzliche Zugabe von Ammoniak oder anderen alkalisch reagierenden Reagentien, was anzeigt, daß diese Stufe beendigt ist.

Die Aktivität der endocellularen NA-abbaubaren Enzyme wird dann weiter erhöht, indem man die konditionierte Zellcreme vorzugsweise durch eine Wärmeaustauschschlange in eine Inkubationszone, geeigneterweise einen Tank, leitet, worin die Creme bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 55⁰C während einer Zeit im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 3 Stunden gehalten wird. Der pH-Wert der Zellencreme steigt weiter an, wenn diese in den Inkubationstank gegeben wird, und man sollte ihn auf einen Wert von mindestens 5,0, aber nicht über ungefähr 5,5 steigen lassen. Der pH-Wert wird dann ir Bereich von 5,0 bis 5,5, vorzugsweise bei ungefähr

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5,2, durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure in dem geforderten Maß gehalten, während die Creme in der Inkubationszone verbleibt. Der Abbau der Nucleinsäure ist unter diesen Inkubationsbedingungen maximal, und er fällt schnell ab, sowohl bei höheren als auch bei niedrigeren pH-Werten. Während der Inkubationsperiode wird die Belüftung weitergeführt.

Bei der Verwendung von anderen Säuren außer Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure für die Kontrolle des pH-Wertes sollte man vorsichtig sein. Einige üblicherweise zur Verfügung stehende Säuren wie Phosphorsäure inhibieren den autolytischen Abbau. Essigsäure ist im allgemeinen bevorzugt, obgleich Chlorwasserstoffsäure öfter wegen der niedrigeren Kosten verwendet wird.

Die Kontrolle des pH-Werts wird durch Zugabe eines Puffermittels zu der Zellencreme beim Eintritt in die Inkubationszone erleichtert. Eine Acetation-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bis 5,5, vorzugsweise ungefähr 5,2, wirkt mit jeder Molarität zwischen 0,05 und 1,0, obgleich es bevorzugt ist, 0,05 bis 0,25 m und am meisten bevorzugt ungefähr 0,10m Acetation zu verwenden. Es wurde weiterhin beobachtet, daß eine überraschende, wesentlich wirksamere Entfernung wasserlöslicher Abbauprodukte der Nucleinsäuren (NA) aus den Zellen in die wäßrige Phase erreicht wird, wenn der Acetation-Puffer vorhanden ist. Überraschenderweise wurde gefunden, daß Äthylendiamintetraacetat(EDTA)-Ion ähnlich wirksam bei niedrigen Konzentrationen von ungefähr 0,01m ist . Die Verwendung sowohl von Acetat- als auch von EDTA-Ionen, beispielsweise mit einer Konzentration von 0,1m bzw. 0,01m, ist noch wirkungsvoller, als wenn man eins der Reagentien allein verwendet.

Nach Beendigung einer geeigneten Inkubationszeit im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 3 Stunden werden die in der Wärme

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behandelten Zellen von der wäßrigen überstehenden Phase durch bekannte Verfahren, beispielsweise durch Zentrifugieren, abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Gewünschtenfalls kann die wäßrige überstehende Phase ganz oder teilweise zu einem primären Fermentationsgefäß zugegeben werden, um nützliche Nährmedien- und Substratkomponenten für das Wachstum zusätzlicher mikrobieller, einzelliger Organismen zu ergeben. Die gewonnenen Zellen enthalten noch im wesentlichen ihr gesamtes, ursprüngliches Proteinmaterial, und sie können getrocknet werden, wobei man ein geeignetes Nahrungsmittelprodukt oder einen Nahrungsmittelbestandteil erhält. Das Trocknen kann auf bekannte Weise geschehen, man kann im Vakuum trocknen oder sprühtrocknen, wobei man das verbesserte SCP-Produkt nicht auf besonders hohe Temperaturen erwärmen sollte. Es ist bevorzugt, das SCP-Material bei ungefähr 70° zu trocknen.

Gegebenenfalls können die mit Wasser gewaschenen, in der Wärme behandelten Zellen mit warmer, wäßriger Natriumhydroxydlösung bei einem pH im Bereich von 7,0 bis 8,0 bei einer Temperatur im Bereich von 60 bis 70⁰C extrahiert werden, um die löslich gemachten NA-Abbaufragmente vollständig zu entfernen. Die Zellen werden dann schließlich abgetrennt, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Das physiologische Konditionieren des SCP-Materials kann verstärkt werden, wenn man zwischen der Hunger- oder Mangelperiode bei ungefähr 30⁰C und der Inkubationsperiode bei 50 bis 55⁰C eine kalte Abschreckbehandlung durchführt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß ein stärkeres Abdiffundieren der NA-Abbaufragmente aus den Zellen während der Inkubation auftritt, wenn die Zellen zuerst auf ungefähr 0°C gekühlt wurden und bei dieser niedrigen Temperatur ungefähr 15 Minuten gehalten wurden.

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Das erfindungsgemäße Verfahren liefert ein verbessertes SCP-Material, das weniger als 2 Gew.% (Trockengewientsbasis) Nucleinsäuren enthält. Der Proteingehalt der behandelten Zellen liegt im allgemeinen im Bereich von bis ungefähr 60 Gew.% (Trockengewicht), was im wesentlichen dem Protein entspricht, das in den ursprünglichen Zellen vorhanden ist. Die gewünschten physikalischen Eigenschaften einschließlich des Geschmacks und Geruchs werden durch das erfindungsgemäße Verfahren nicht beschädigt bzw. geändert, und das entstehende SCP-Nahrungsmittelmaterial wurde in seinen Nähreigenschaften wesentlich verbessert. Überraschenderweise werden die funktionalen Eigenschaften, d.h. die Textureigenschaften, die Wasser- und Ölretention, die niedrige Dispergierbarkeit in Wasser u.a. stark verbessert. Dementsprechend besitzt das erfindungsgemäße SCP-Nahrungsmittelmaterial eine große Vielseitigkeit, wenn man es in bekannte Nahrungsmittelprodukte einarbeitet und wenn es bei der Entwicklung neuer Nahrungsmittelprodukte eingesetzt wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1

Zellen von Candida utilis (ATCC 9256) wurden in einer kontinuierlichen Fermentationsvorrichtung in einem Mineralsalzmedium, das Äthanol als Kohlenstoff enthaltendes Substrat enthielt, gezüchtet. Die Raumgeschwindigkeit wurde bei 0,22 Std. gehalten, wobei das Wachstum durch die Äthanolkonzentration und nicht durch die Belüftungsgeschwindigkeit begrenzt wurde. Die geernteten Zellen wurden aus dem Abfluß (der 3,6 Gew.% Zellen enthielt) durch Zentrifugieren und Waschen entfernt, wobei man eine Paste erhielt, die ungefähr 22 Gew.% Feststoffe enthält. 4 kg der Paste wurden dann wieder in 4 1 entionisiertem Wasser suspendiert, wobei man 8 1 einer Aufschlämmung erhielt, die

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10 Gew.% ( Trockengewichtsbasis) Zellen enthielt. Die wäßrige Zellenaufschlämmung wurde dann auf 53 4 1°C unter kontinuierlichem Rühren (800 U/min) und Belüftung (1 Vol.Luft/Vol.Suspension/min) erwärmt. Die Aufschlämmung wurde bei diesen Bedingungen 3 Stunden gehalten, während der pH-Wert der Aufschlämmung durch Zugabe von 6n Chlorwasserstoff säure in dem geforderten Maß bei 5,2 -Jr 0,1 gehalten wurde. Die Zellenaufschlämmung wurde dann zentrifugiert und die Zellencreme mit Wasser gewaschen. Die Zellencreme wurde in heißem Wasser bei 65 C wieder aufgeschlämmt, wobei man eine 15 gew.%ige Aufschlämmung erhielt, die durch Zugabe von Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, zentrifugiert, mit V/asser gewaschen und schließlich getrocknet wurde. Die ursprünglich geernteten Zellen enthielten 10 Gew.% (bezogen auf Trockengewicht) Nucleinsäuren; die behandelten Zellen enthalten nur noch 3|3 Gew.?ii. Die Ausbeute an wiedergewonnenen Zellen betrug ^r,7_t5% und der Proteingehalt der behandelten Zellen betrug 58,0 Gew.5». Die behandelten Zellen enthielten ebenfalls sehr wenig Phosphor und Asche. Der ursprünglich hefeartige Geschmack bzw. Geruch war eliminiert und die funktioneilen Eigenschaften waren verbessert.

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß anstelle von 6n Chlorwasserstoffsäure zur Kontrolle des pH-Werts während der Erwärmungsperiode bei 55 C Eisessig verwendet wurde. Der Gehalt an Nucleinsäure der behandelten Zellen betrug 2 Gew.% (bezogen auf Trockengewichtsbasis) . Die Ausbeute an gewonnenem Zellmaterial betrug 78,050 und der Proteingehalt der behandelten Zellen betrug 60,0 Gew.?o.

Bei spiel 5

Das Ve- ^p?>hren von Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Ausnahme, zv~ Herstellung der Zellaufschlämmungen ver-

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brauchte Fermentationslösung anstelle von frischem Wasser verwendet wurde. Der Nucleinsäuregehalt der behandelten Zellen betrug 3>6 Gew.% (bezogen auf Trockengewicht).

Beispiel 4

Candida utilis (ATCC 9256)-Zellen wurden als kontinuierliche Kultur mit einer Raumgeschwindigkeit von 0,38 Std. in einem Mineralsalzmedium, das Äthanol als Kohlenstoff lieferndes Substrat enthielt, gezüchtet, wobei die Wachstumsgeschwindigkeit durch die Konzentration an gelöstem Sauerstoff beschränkt war. Die geernteten Zellen wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 behandelt. Die ursprünglich geernteten Zellen enthielten 12,0 Gew.% (bezogen auf Trockengewicht) Nucleinsäuren und die behandelten Zellen enthielten 4,6 Gew.% Nucleinsäuren.

Beispiel 5

Das Verfahren von Beispiel 4 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß zuerst auf 55⁰C erwärmt, die Zellaufschlämmung gerührt und bei ungefähr 30⁰C belüftet wurde, während der pH-Wert bei einem Wert, der nicht niedriger war als 4,0, durch Zugabe von 5%igem wäßrigem Ammoniumhydroxyd in dem erforderlichen Maße gehalten wurde. Diese Konditioniert Mangeloder "Verhungerungs"-Behandlung wurde 30 Minuten durchgeführt und dann beobachtete man, daß der pH-Wert ohne Zugabe von Ammoniumhydroxyd stieg. Die Zellen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben weiter aufgearbeitet. Die behanditen Zellen enthielten nur 1,8 Gew.% (bezogen auf Trockengewicht) Nucleinsäuren.

Beispiel 6

Eine 5 gew.%ige (bezogen auf Trockengewicht) wäßrige Aufschlämmung aus Torula-Hefezellen wurde dem Behandlungsverfahren von Beispiel 1 unterworfen mit der Ausnahme, daß sie 5 Stunden bei 55°C gehalten wurden, wobei man periodisch

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Proben der wäßrigen Phase entnahm, um das löslich gewordene Nucleotidmaterial zu bestimmen. Diese Materialien zeigen ein Absorptionsmaximum bei Wellenlängen nahe 260 m/u . Eine zweite Aufschlämmimg wurde auf gleiche Weise herge-, stellt, nachdem man sie auf O⁰C gekühlt und bei dieser Temperatur 15 Minuten gehalten hatte, bevor man sie auf 55⁰C erwärmte. Spektroskopische Messungen zeigen eine erhöhte Löslichkeit des Nucleotidmaterial, wenn die Zellen zuerst eine Abschreckbehandlung in der Kälte unterworfen wurden.

Lösliches Nucleotidmaterial A ,

Zeit bei	Std.	55°C	7
1	Std.
3	Std.
5	eis
B	ρ ie I

Kälteschock kein Kälteschock

33 10

43 18

51 26

Das Verfahren von Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei man (a) Acetation-Pufferlösung zugab, bis man eine Molarität von 0,1 erhielt, während der pH-Wert bei 5,2 gehalten wurde, (b) Athylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzufügte, bis man eine Molarität von 0,01 erhielt, oder (c) beide Verbindungen zufügte, wenn man die Aufschlämmung auf 55°C erwärmte. Nach 2 Stunden bei 55⁰C wurde die optische Dichte oder die Absorption "bei 260 m/u (Aocq) eier wäßrigen Phase bestimmt; diese ist ein Anzeichen für das Ausmaß, wie weit die Nucleotidmaterialien in löslichen Zustand überführt wurden. Sowohl Acetat- als auch Äthylendiamintetraacetat-Ionen sind v/irksam, um Nucleinsäurematerialien aus den Zellen zu entfernen, und wurden beide Verbindungen zusammen verwendet, so sind sie am wirksamsten.

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Zusatzstoff ^260 keine 32

0,1m Acetat 83

0,01m EDTA 68

0,1m Acetat 97

Beispiel 8

Torula-Hefezellen wurden bei 30⁰C und einem pH-Wert von 4,0 in einem ansatzweise arbeitenden Fermentationsgefäß gezüchtet, wobei man eine Mineralsalznährlösung und Äthanol als Substratmaterial, das den Kohlenstoff lieferte, verwendete. Die irische Zellenaufschlämmung wurde dann kontinuierlich in ein Fermentationsgefäß mit einer Raumgeschwindigkeit von 0,3 Std. eingeführt, wobei die gleiche Temperatur und die gleichen Bedingungen wie bei dem ansatzweisen Versuch aufrechterhalten wurden und wobei man mit Luft belüftete, um eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff aufrechtzuerhalten, die niedriger war, als es einer 85%igen Sättigung entsprach. Acetationen waren nicht vorhanden. Die behandelte Zellaufschlämmung wurde kontinuierlich geerntet, und die Zellen wurden von der wäßrigen Phase abgetrennt. Es werden periodisch Analysen durchgeführt und der ApgQ-Wert betrug für die überstehende wäßrige Phase 319 - 9. Der Nucleinsäuregehalt der behandelten und getrockneten Zellen betrug 3,2 - 3 Gew.%. Die Zellgewinnung betrug 77,0 - 3,0 Gew.%.

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Claims

- 19 Patentansprüche

1. Verfahren, um den Nucleinsäuregehalt von einzelligem Protein(SCP)-Material für Nahrungsmittelprodukte , das aus unicellularen Mikroorganismen stammt _v die in einem Fermentationsgefäß aerob in einer geeigneten Fermentationslösung gezüchtet wurden,wesentlich zu vermindern,dadurch gekennzeichnet, daß man " ·-—■------

(a) die Zellen von dem Hauptbestandteil der Fermentationslösung abtrennt, wobei man eine konzentrierte Zellaufschlämmung erhält;

(b) das aufgeschlämmte Zellkonzentrat mit Wasser wäscht;

(c) das gewaschene Zellkonzentrat zentrifugiert, wobei man eine Zellcreme erhält, die 5 bis 15 Gew.% Zellen enthält;

(d) in der Zellcreme einen Sauerstoff liefernden Gasstrom versprüht, während die Zellcreme bei einer Temperatur von ungefähr 30 C gehalten wird;

(e) die Acidität der belüfteten Zellcreme bei ungefähr 4,0 hält durch Zugabe der erforderlichen Menge an 5?oigem wäßrigem Ammoniak;

(f) die belüftete Zellcreme bei ungefähr 30⁰C hält, bis der pH-Wert anfängt, ohne weitere Zugabe von wäßrigem Ammoniak zu steigen;

(g) die Zellcreme auf eine Temperatur im Bereich von 50 bis 55°C erwärmt, wobei man weiterhin kontinuierlich einen Sauerstoff liefernden Gasstrom versprüht;

(h) die erwärmte und belüftete Zellcreme durch Zugabe einer wäßrigen Acetation-Pufferlösung in ausreichender Menge puffert, um eine Molarität im Bereich von O₅05 bis 1,0 zu erhalten;

(i) die Acidität der erwärmten und belüfteten Zellcreme im Bereich von 5»0 bis 5,5 durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure in der erforderlichen Menge hält;

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2?08.279.

(j) die Zellcreme unter den obigen Belüftungstemperatur- und Aciditätsbedingungen während einer Periode von 1 bis 3 Stunden durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure oder Essigsäure in dem erforderlichen Maß, um den pH-Wert in dem erforderlichen Bereich zu halten, behandelt;

(k) die behandelte Zellcreme zentrifugiert, wobei man eine überstehende wäßrige Phase und ein wärmebeha ndeltes Zellkonzentrat, das einen wesentlich verminderten Nucleinsäuregehalt besitzt, erhält;

(1) das wärmebehandelte Zellkonzentrat mit Wasser wäscht, und

(m) das gewaschene, wärmebehandelte Zellkonzentrat trocknet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil der überstehenden wäßrigen Phase zu der Fermentationslösung in der Fermentationsvorrichtung zugefügt wird.

J5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellcreme ungefähr 10 Gew.% Zellen enthält.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erwärmte und belüftete Zellcreme auf einen pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 5,5 durch Zugabe von Acetation-Pufferlösung gepuffert wird, v/obei man eine Acetation-Molarität im Bereich von 0,05 bis 0,25 erhält.

5· Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die belüftete Zellcreme auf ungefähr O⁰C gekühlt und bei dieser Temperatur ungefähr 15 Hinuten gehalten wird, bevor sie auf eine Temperatur im Bereich von 50 bis 55⁰C erwärmt wird.

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6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wärmebehandelte Zellkonzentrat zusätzlich in heißem Wasser bei einer Temperatur im Bereich von 60 Ibis 7O⁰C suspendiert wird und auf einen pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 8,0 durch Zugabe einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung eingestellt wird, bevor die letzten Wasch- und Trocknungsstufen durchgeführt werden.

7· Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als unicellulare Mikroorganismen Bakterien oder Hefe verwendet.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces fragislis und Candida utilis verwendet.

9. · Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida utilis verwendet.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als unicellularen Mikroorganismus Candida utilis verwendet, die' Zellcreme ungefähr 10 Gevi.% Zellen enthält und daß die erwärmte und belüftete Zellcreme auf einen pH-Wert von ungefähr 5»2 durch Zugabe einer Acetation-Pufferlösung gepuffert wird, wobei die Konzentration an Acetation ungefähr 0,1 M beträgt und daß Äthylendiamintetraacetat-Ionen zusätzlich zugefügt werden, bis eine Molarität von 0,01 erhalten wird.

11. Nahrungsmittelprodukt, das einzelliges Proteinmaterial, hergestellt gemäß dem Verfahren von Anspruch 1, enthält.

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