DE1925952B2

DE1925952B2 - Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumorwirksamkeit

Info

Publication number: DE1925952B2
Application number: DE1925952A
Authority: DE
Inventors: Fumio Kato; Yoshinobu Miyamura; Masao Machida Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-06-05
Filing date: 1969-05-21
Publication date: 1973-11-22
Also published as: US3627639A; DE1925952C3; GB1215786A; DE1925952A1; CA940852A; FR2010156A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumonvirksamkeit durch aerobes Züchten eines L-Asparaginase bildenden Mikroorganismus der Art Serratia marcescens in einem wäßrigen Nährmedium und durch Gewinnung der L-Asparaginase aus den Zellen mit üblichen Methoden.

Die Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumonvirksamkeit durch Kultivierung eines L-Asparaginase erzeugenden Mikroorganismus der Art Serratia marcescens ist an sich bekannt. So ist beispielsweise in »Biochemical and Biophysical Research Communications«, Bd. 28, Nr. 2, 1967, S. 160 bis 165, ein Verfahren beschrieben, in dem zur Herstellung der L-Asparaginase ein festes Kulturmedium verwendet wird.

Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß die damit erzielbare Ausbeute an L-Asparaginase gering ist und den Anforderungen nicht genügt, die an ein technisches Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase gestellt werden müssen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase anzugeben, mit dessen Hilfe es möglich ist, L-Asparaginase auf wirtschaftliche Weise großtechnisch herzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumonvirksamkeit durch aerobes Züchten eines L-Asparaginase bildenden Mikroorganismus der Art Serratia marcescens in einem wäßrigen Nährmedium und durch Gewinnung der L-Asparaginase aus den Zellen mit üblichen Methoden dadurch gelöst, daß man die Züchtung in einem Nährmedium, das 1 bis 15 Gewichtsprozent einer Kohicnstoffquelle enthält und in dem die als Ammonstickstoff vorliegende Stickstoffmenge bei 5 mg/ml oder weniger gehalten wird, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40 C und bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 10,0 durchführt.

ίο Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber dem bekannten Verfahren den Vorteil, daß es damit erstmals möglich ist, L-Asparaginase auf wirtschaftliche Weise in hoher Ausbeute herzustellen.

Gemäß eir bevorzugten Ausgestaltung wird das Verfahren de. Erfindung in der Weise d'.rchgeführt, daß der pH-Wert des Nährmediums mit einem Alkalihydroxyd auf einen Wert von 7,0 bis 8,5 eingestellt wird.

Als Mikroorganismen für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich insbesondere die Mikroorganismen Serratia marcescens ATCC 60 und ATCC 19 180.

Ganz allgemein werden, wenn eine relativ hohe Konzentration an einer Kohlenstoffquelle im Nährmedium vorliegt, die anderen Nährstoffe, beispielsweise die Stickstoffquelle, anorganische Salze u. dgl., ebenfalls in einer großen Menge eingesetzt, um das Wachstum der Mikroorganismen bei optimalen Bedingungen zu halten. In diesem Falle variiert die Ammonstickstoffkonzentration in dem Nährmedium in Abhängigkeit von der Stickstoffquelle (organisch oder anorganisch), die zusammen mit der Kohlenstoffquelle venvendet wird. Wenn die Menge an der in dem Nährmedium vorliegenden Stickstoffquelle groß ist. ist das Wachstum der Mikroorganismen im allgemeinen gut.

Wenn nun aber die Züchtung eines L-Asparaginase bildenden Mikroorganismus der Art Serratia marcescens so durchgeführt wird, daß in dem Nährmedium 1 bis 15 Gewichtsprozent einer Kohlenstoffquelle vorhanden sind und die Ammonstickstoffmenge auf einem konstanten Wert bei 5 mg;rnl oder weniger gehalten wird, so ist die Bildung der gewünschten L-Asparaginase mit Antitumoraktivität optimal.

In der nachfolgenden Tabelle I wird das erfindungsgemäße Verfahren mit dem Verfahren der französischen Offenlegungsschrift 2 001930 verglichen. In dieser französischen Offenlegungsschrift ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mittels diese bildenden Mikroorganismen von Serratia marcescens angegeben, wobei die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Nährmedium höchstens 1% betragen darf.

Die in der folgenden Tabelle I angegebenen Werte wurden jeweils nach beendeter Züchtung in identischer Weise ermittelt.

Tabelle I	Ammonstickstoff (NH₃ — N) .... Feuchte Zellen	Verfahren A	Verfahren B	Verfahren C
	L-Asparaginase-Aktivität Spezifische Aktivität der rohen enzvmatischen Flüssigkeit	Spuren 16 mg/ml 65 Einheiten/ml 18,6 Einheiten/mg	9 mg/ml 65 mg/ml 13 Einheiten/ml 1,05 Einheiten/mg	Spuren 44 mg/ml 196 Einheiten/ml 27,9 Einheiten/mg

Verfahren A

Kultivierung unter Belüften und Rühren während 16 Stunden bei 3O^CC in einem Nährmedium vom pH-Wert 7,0, das 0,3 °_o Glucose, 1.0 °;, Fleischextrakt, LO %, Pepton, 0,5°_oNatriumchlorid und 0,5% liefeextrakt enthält (gemäß französischer Offeniegungsschrift 2 001930).

Verfahren B

Das gleiche Verfahren wie Verfahren A mit der Änderung, daß die Menge an Glucose 4,0°₀ beträgt und der pH-Wert mit Ammoniakwasser auf 7.0 bis 8,5 eingestellt wird.

Verfahren C

Kultivierung unter Belüften und Rühren während 36 Stunden Yc 30° C in einem 4,0% Glucose, 2,0% Fleischextrakt. 2,0% Pepton, 0,5% Hefeextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthaltenden Nährmedium. Der pH-Wert des Mediums wird mit Natriumhydroxyd auf 7,0 bis 8.5 eingestellt (gemäß vorliegender Erfindung).

Wie sich aus Tabelle I ergibt, wird c'ie Aktivität pro ml der Kulturflüssigkeit im erfindungsgemäßen Verfahren um mindestens das 3fache gegenüber dem in der französischen Offenlegungsschrift 2 001 930 beschriebenen Verfahren gesteigert. Darüber hinaus ist auch die spezifische Aktivität der rohen enzymatischen Flüssigkeit beträchtlich gesteigert.

Die Beziehungen zwischen der als Ammonstickstoff in dem Nährmedium vorliegenden Stickstoffmenge und der Antitumorwirksamkeit der L-Asparaginase und deren spezifischer Aktivität sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II

Stickstoff in Form von Ammoniak 0,1 mg/ml I 0,5 mg/ml I 5,0 mg/ml I 10,0 mg/ml

L-Asparaginase-Aktivität.

Spezifische Aktivität der rohen enzymatischen
Flüssigkeit

194 Einheiten/ml

27 Einheiten/ml 193 Einheiten/ml

26,5 Einheiten/mg

132 Einheiten/ml

19,5 Einheiten/mg

54 Einheiten/ml

9,8 Einheiten/mg

11 Einheiten/ml

0,8 Einheiten/mg

Die erfindungsgemäß hergestellten L-Asparaginase-Präparate weisen eine Antitumor virksamkeit auf, auf Grund deren es möglich ist, eine künstlich erzeugte Leukämie einer Maus vollständig zu heilen.

Sowohl ein synthetisches Nährmedium als auch ein natürliches Nährmedium ist geeignet, solange es die wesentlichen Nährstoffe zum Wachstum der verwendeten Mikroorganismenstämme enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt, und dazu gehören Stoffe, wie beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Verbindungen, die von den verwendeten Mikroorganismen benötigt werden.

Als Kohlenstoffquelle seien beispielsweise Kohlehydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate und Melasse oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie organische Säuren, beispielsweise Essigsäure und Milchsäure, genannt. Diese Stoffe können entweder einzeln oder in Gemischen von zwei oder mehreren eingesetzt werden.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen, wie Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat und Ammoniumphosphat, oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, lösliche Fischsubstanz und Reiskleieextrakt, verwendet werden. Diese Stoffe können ebenfalls entweder einzeln oder in Kombinationen von zwei oder mehreren eingesetzt werden.

Zu anorganischen Salzen, die dem Nährmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid und Zink-■,ulfat.

Wachstumsfördernde Mittel, wie Biotin, oder Vitamine, z. B. Thiamin oder Cobalamin, können ebenfalls, falls erwünscht oder erforderlich, dem Medium zugesetzt werden.

Die Kultivierung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, z. B. u^rter aerobem Schütteln der Kultur oder unter Rühren und Belüften einer Submerskultur bei einer Temperatur von etwa 20 bis 4O⁰C und einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 10,0 durchgeführt. Nach etwa 1- bis 3tägiger Kultivierung unter diesen Bedingungen haben sich große Mengen L-Asparaginase in der erhaltenen Kulturflüssigkeit angesammelt.

Nach beendeter Kultivierung kann die L-Asparaginase nach üblichen Methoden, wie beispielsweise Ionenaustauscherharz-Behandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorption oder Chromatographie, abgetrennt und gereinigt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Die aufgeführten Prozentangaben beziehen sich, falls nicht anders angegeben, auf das Gewicht pro 1 Wasser.

Beispiel 1

Serratia marcescens ATCC 60 wurde in einem flüssigen, 2% trockene Bouillon enthaltenden Nährmedium unter Belüften und Rühren 7 Stunden lang bei 30⁰C kultiviert. Die erhaltene KulturflüssigkeK wurde als Impfkultur eingesetzt. Diese Impfkultur wurde in einen Fermentationsbehälter von 5 1 Inhalt in einer Inokulationsmenge von 10 Volumprozent in 3 1 eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

4,0% Glucose,
2,0% Pepton,

2,0 % Fleischextrakt,
0,5% Hefeextrakt,
0,5% Natriumchlorid.

Die Kultivierung wurde dann 36 Stunden lang bei 30" C und 400 UpM unter Belüften mit einer Luftmenge von 3 1 pro Minute kultiviert. Der ρίί-Wert des Mediums wurde mit Calciumhydroxyd auf 7,0 bis 8.5 eingestellt. Die erhaltenen Zellen wurden durch einen Zentrifugalabscheider abgetrennt, wobei 210 g nasse Zellen erhalten wurden.

Die Ze'kn wurden in einer 0,01-m-Tris-Pufferlösung (pH 8,5) suspendiert und mit einem Schalloszillator (10 Kc) 10 Minuten lang behandelt, um die Zellen za zerstören. Man erhielt eine rohe Extraktflüssigkeit mit einer L-Asparaginase-Aktivität von 150 Einheiten/ ml und einer spezitischen Aktivität von 25,0 Einheiten pro mg Protein. Diese ExtnV.tflüssigkeit wurde einer Behandlung zur Entfernung von Nucleinsäuren mit Mn", der Entfernung von Proieinverunreinigungen durch Erhitzen, danach einer fraktionierten Fällung mit Ammonsulfat und einer Chromatographie mit Diäthylaminoäthylcelluiose und Biogelen unterworfen, wobei das enzymatische Protein gereinigt wurde. Man erhielt ein L-Asparaginase-Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 1500 Einheiten pro mg Protein in einer Gesamtausbeute von etwa 20%. Dieses Präparat zeigte eine Antitumorwirksamkeit. womit es möglich war, eine experimentelle Leukämie mit einer Dosierung von einigen 10 ag vollständig zu heilen.

Herstellung einer Impfkultur kultiviert. Diese Impfkultur wurde in einen fermentationsbchälter von 5 1 Inhalt in einer Inokulationsmenge von 10 Volumprozent in 3 I eines Fermentationsmediunib der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

Beispiel 2

Serratia marcescens ATCC 19 180 wurde in der gleichen Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, zur

8"₀ Glycerin.

3°_n Pepton,

0,25°,

0.05°,

0,05°,

0.05°,

10 mg I

10 mg!

10 mg/1

LO mg/1

10 mg/1

, Kaliumsulfat,

, Kaliumphosphat,

, Dikali. mphosphat,

, Magnesiumsulfat,

Eisensulfat.

Mangansulfat,

i Cadmiumsulfat.

[ Kupfersulfat.

Zinksulfat.

30 Die Kultivierung wurde dann 60 Stunden lang bei 30³C unter aeroben Bedrängen bei 400 UpM und unter Belüften mit einer Lufiro-nge von 3 1 pro Minute durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wurde mit einer 40%igen Natriumhydroxydlösung auf 7,0 bis 8,5 eingestellt:. Die erhaltenen Zellen wurden durch einen Zentrifugalabscheider abgetrennt, und man erhielt 360 g feuchte Zellen. Diese fellen wurden den gleichen Behandlungen wie im Beispiel 1 zur Reinigung der Enzyme unterzogen, wobei ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 2000 Einheiten pro mg Protein in einer Gesamtausbeute von etwa 20 % erhalten wurde. Dieses Enzympräparat war in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 gegenüber einer Leukämie einer Maus wirksam.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase mit Antitumonvirksamkeit durch aerobes Züchten eines L-Asparaginase bildenden Mikroorganisinus der Art Serratia marcescens in einem wäßrigen Nährmedium und durch Gewinnung der L-Asparaginase aus den Zellen mit üblichen Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem Nährmedium, das 1 bis 15 Gewichtsprozent einer Kohlenstoffquelle enthält und in dem die als Ammonstickstoff vorliegende Stickstoffmenge bei 5 mg/ml oder weniger gehalten wird, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C und bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 10,0 durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Nährmediums mit einem Alkalihydroxyd auf 7,0 bis 8,5 eingestellt wird.