DE2308087A1 - Fermentationsverfahren - Google Patents

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Patentanwälte Dipl.-Inc. γ weickmann,

Dtpl.-Ing. H. We ι c kmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

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MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

Dr. Maximilian Kellner, 8050 Freising, Untere Hauptstraße 34

Permentationsverfahren

In der technischen Mikrobiologie versteht man unter Fermentationen durch Mikroorganismen verursachte, meistens in gerührten Flüssigkeiten ablaufende, chemische Umsetzungen zwischen gelösten, dispergierten oder emulgierten Stoffen.

Bei einer großen Anzahl von Fermentationen sind ein oder mehrere Nährstofflieferanten oder "Rohstoffe" gasförmig; so stellt z.B. der Luftsauerstoff für viele industriell genutzte, aerobe Fermentationen einen gasformigen Rohstoff dar. Weil derartige Fermentationen unter sterilen Bedingungen ablaufen müssen, verursacht die Bereitstellung großer Hcngen steriler Gase resp. Luft erheblichen technischen Aufwand und entsprechende Kosten. Bei normalen aeroben Fermentationen kan:i der Aufwand für die Sterilbelüftung bis zn

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ORIGINAL INSPECTED

einem Drittel der Produktionskosten betragen. Dies ist darauf zurückzuführen, daß der Übergang des Luftsauerstoffs in die Lösung (OTR) wegen des niedrigen Sauerstoffpartialdrucks der Luft bei den üblichen Verfahren nur langsam erfolgt und deshalb weit mehr als die stö'chiornetrisch erforderliche Luftmenge zugeführt und daher auch sterilisiert werden muß.

Verwendet man als Kohlenstoffquelle für die i-likroorganisraen die unter verschiedenen Aspekten, wie Verfügbarkeit und Preis, besonders günstigen Kohlenv.-asserstoff e, so steigen die Aufwendungen für die Sterilbelüftung in besonderem Maße. Denn hierbei muß einerseits der Substratsauerstoff, der in den üblicherweise als Fermentationsrohstoff verwendeten Kohlehydraten enthalten ist, durch zusätzlichen Luftsauerstoff ersetzt v/erden und andererseits ist durch den hydrophoben Charakter der Kohlenwasserstoffe auch noch der Sauerstoffübergang in die Lösung erschwert.

Besondere Probleme liegen vor, wenn noch andere gasförmige Rohstoffe wie z.B. Erdgas, Methan, Äthan, Wasserstoff und dgl. eingesetzt werden, so daß im Fermenter explosive Luft-Gasgemische entstehen. Dies zwingt dazu, die Anlagen klein zu halten und bringt trotzdem erhebliche Probleme mit der Beseitigung der explosiven Gasgemische mit sich. Der Vorteil der leichten Verfügbarkeit und Billigkeit derartiger Rohstoffe wird hierdurch wieder aufgewogen.

Ein weiteres Problem bei der Fermentation unter Zusatz von gasförmigen Rohstoffen liegt darin, bei FermentationGdrucken zu arbeiten, die erheblich vom umgebenden Luftdruck abweichen.

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Ähnliche Schwierigkeiten wie bei explosiven Gasmischungen sind zu bewältigen, wenn in Gegenwart radioaktiver Substanzen fermentiert wird, beispielsweise bei der mikrobiologischen Herstellung isotopenciarkierter Pharmaceutica in technischem Maßstab. Die Verhinderung einer Umweltverseuchung insbesondere bei instabilen Isotopen stärkerer Radioaktivität erfordert einen beträchtlichen technischen Aufwand.

Aufgabe der Erfindung ist es, die oben aufgezeigten Schwierigkeiten und Probleme bei Ferrcentationsverfahren unter Verwendung gasförmiger Rohstoffe zu beseitigen.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Fermentationsverfahren unter Zusatz von.gasförmigen Rohstoffen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß mit geschlossenem Gaskreislauf gearbeitet wird, im Abgas die Menge der verbrauchten Gasbestandteile gemessen wird und eine dem verbrauchten Gas stöchiometrisch entsprechende Frischgasmenge in den Kreislauf eingeschleust wird.

Die wesentlichen Merkmale der Erfindung sind in der Kombination eines geschlossenen Gaskreislaufes in der Fermentation mit dem stöchiometrischen Ersatz des verbrauchten gasförmigen .Rohstoffes zu sehen.

Unter geschlossenem Gaskreislauf wird im Rahmen der Erfindung eine Gasführung verstanden, bei der das nach dem Durchlaufen des Fermenters abströmende Abgas erneut in den Fermenter eingeführt wird. Im Abgas wird die Menge der verbrauchten Gasbestandteile nach an sich bekannten Methoden gemessen. Aus der Differenz zwischen zugeführter Menge eines Gases und im Abgas noch vorhandener Gasmenge ergibt sich die Menge der

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verbrauchten Gasbestandteile. Eine dieser verbrauchten Menge entsprechende stöchiornetrische Frischgasmenge wird dann, in den G-askreislauf eingegeben und zwar entweder in das Abgas vor seiner Rückleitung in den Fermenter oder unabhängig davon direkt in den Fermenter.

Die Art der Messung des Gasverbrauches ist an sich nicht wesentlich. Je nach Größe der Anlage können jedoch bestimmte Meßmethoden anderen Methoden überlegen sein. So werden bei relativ kleinen Anlagen Messmethoden ohne Gasverbrauch bevorzugt, während bei Großanlagen ein gewisser Gasverbrauch bei der Messung keine Rolle spielt. Im Regelfall wird die Messung der verbrauchten Gasmenge erfolgen, indem einerseits der Gesamtgasdruck bestimmt und andererseits die einzelnen Gase nach speziellen Methoden bestimmt v/erden. Beispielsweise läßt sich Sauerstoff zweckmäßig polarographisch, massenspektrometrisch oder durch Prozeßgaschroma'tographie bestimmen. Bei Kohlendioxyd hat sich eine Messung mittels pH-Elektrode, IR-Absorption, Massenspektrometer oder Prozeßgaschromatographie als zweckmäßig erwiesen. Kohlenwasserstoffe werden insbesondere durch die IR-Absorption und massenspektrometrisch leicht bestimmt. Wird nur ein einziges Gas im Kreislauf geführt, beispielsweise nur Sauerstoff, so kann eine Druckmessung alleine bereits ausreichen, um die verbrauchte Gasmenge stöchiometrisch zu bestimmen.

Falls beim speziellen Fermentationsverfahren, auf welches die Erfindung angewendet wird, ein Gas-förmiges Produkt gebildet wird, muß dieses aus dem Abgas vor dessen Rückführung in den Fermenter entfernt werden. Die Entfernung kann auf beliebige V/eise erfolgen, solange nur die Geschlossenheit des Gaskreislaufes aufrechterhalten wird. Beispielsweise ist en

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möglich, das gebildete Gas in einem speziellen Reaktionsbehälter zu entfernen. Handelt es sich bei dem gebildeten Gas beispielsweise um COp, so kann der Reaktionsbehälter aus einem mit Lauge oder einem anderen COp-Adsorbens gefüllten Behälter bestehen. Es ist auch möglich, das COp auszufrieren. Eine besonders elegante Methode besteht in der Entfernung des gebildeten Abgases durch Kopplung mit einer zweiten Fermentation, in welcher das gebildete gasförmige Produkt, beispielsweise CO₂, als Rohstoff verbraucht wird. In diesem Falle dient der zweite Fermenter gewissermaßen als Reaktionsgefäß zur Entfernung der in der ersten Fermentation gebildeten gasförmigen Produkte. Man erhält so eine gekoppelte Fermentation von wenigstens zwei verschiedenen Mikroorganismen im geschlossenen Gaskreislauf, bei welcher die erfindungsgemäß erzielbaren Vorteile, insbesondere starke Verminderung der benötigten Gasmengen und der Aufwendungen für die Sterilisierung der zugeführten Frischgase, in besonderem Maße zur Geltung kommen.

Das erfindungsgenäße Verfahren kann mit einer kontinuierlichen oder einer chargenweisen Fermentation durchgeführt werden. In jedem Falle werden die erzielbaren Vorteile in gleicher Weise erhalten. Hinsichtlich der sonstigen für die Fermentation bzw. Fermentationen benötigten Rohstoffe erfordert die Erfindung keine Abänderung der üblichen Arbeitsweise. So können die üblichen liineralsalznährmedien angewendet werden, die Regelung von pH-^T,\^rert, Nährflüssigkeitszugabe und dgl. erfolgt in bekannter Weise.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht aus einem geeigneten mit Gaszu- und -ableitungseinrichtungen versehenen Fermenter, einer Verbindungs-

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leitung von Gasableitung zu Gaszuleitung und einer in der Verbindungsleitung angeordneten Meßstrecke zur Messung des stöchiometrisehen Verbrauchs an Frischgas sowie einer Quelle für Frischgas, welche dem Fermenter entsprechend den auf der Meßstrecke erhaltenen Meßwerten für den Gasverbrauch Frischgas zuführt. Vorzugsweise wird über den oder die Meßwerte der Meßstrecke die Zugabe von Frischgas direkt geregelt. Gemäß einer v/eiteren bevorzugten Ausführungsform findet sich in der Abgasstrecke eine Vorrichtung zur Entfernung von gebildeten gasförmigen Reaktionsprodukten, die zweckmäßig als Reaktionsbehälter ausgebildet ist. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht ein . derartiger Reaktionsbehälter aus einem weiteren Fermenter, in dem eine Fermentation unter Verbrauch des in der ersten Fermentation gebildeten gasförmigen Reaktionsproduktes abläuft.

Daß erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung zu seiner Durchführung werden im folgenden anhand der beigefügten Zeichnung näher beschrieben.

Ein handelsüblicher Fermenter I mit selbstansaugendem Begasungsrührer 3 und mechanischem Schaumabscheider 4 weist eine Abgasleitung 5 auf, die über ein Reaktionsgefäß II und eine Meßstrecke 5a wieder in den Begasungsrührer 3 zurückführt. Das Reaktionsgefäß II kann weggelassen werden, es kann auch als Fermenter I ausgebildet sein. Das aus dem Fermenter austretende Gasgemisch läuft über leitung 5 zum Reaktor II. Vom Austritt des Reaktors II oder direkt vom Ausgang des Fermenters I saugt sodann der Rührer des Fermenters I (oder falls ein solcher vorhanden ist, des Fermenters II) das Gasgemisch an und preßt es wiederum durch

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den Fermenter I (bzw. II), wobei die beim ersten Durchgang nicht in Reaktion getretenen Gasanteile erneut der mikrobiologischen Umsetzung zur Verfügung stehen. Zyklone III erlauben die Abscheidung von mitgerissenen Tröpfchen. Die in diesen abgeschiedene Flüssigkeit wird entweder in den Kreislauf zurückgegeben, beispielsweise wenn sie radioaktive Stoffe enthält, oder abdrainiert. Ein Teil des Gaskreislaufes, der als Meßstrecke 5a ausgebildet ist, enthält Fühler 6, zweckmäßig in sterilisierbarer Ausführung, welche der Gaszusammensetzung analoge Meßwerte liefern, die elektrisch verstärkt (E8) und angezeigt (9) werden. Ein nachgeschalteter. Regler R10 gibt bei Unterschreiten des vorgegebenen Sollwertes des jeweils bestimmten Gases einen Impuls zur Öffnung des Gasventils V12, um das entsprechende Gas, vorzugsweise über Sterilfilter (nicht gezeigt)'nachzuliefern. Bei der Fermentation explosiver Gasgemische wird vorher der elektrische Impuls in einem Wandler E/P11 in ein pneumatisches Signal umgeformt.

Das Abgas wird im Gas- bzw. Steigraum 2 des Ferraenters gesammelt und der Leitung 5 zugeführt. Der Rührwerksantrieb ist bei explosiven Gasmischungen zweckmäßig pneumatisch oder hydraulisch ausgebildet.

Vorstehende Beschreibung läßt erkennen, daß das wesentliche der erfindungsgemäßen Verfahrensweise darin zu sehen ist, daß jeweils nur derjenige Teil an gasförmigen Rohstoffen stöchiometrisch dem Kreislauf zugesetzt wird, welcher durch die mikrobiologische Umsetzung tatsächlich vorher verbraucht wurde. Die Regelung gestaltet sich dabei sehr einfach und trotzdem besonders exakt. Die Steuerung der Zuluft in einem offenen Permenter aus der Differenz des Sauerstoffgehaltes von Zu- und Abluft (ca. +0,1 Vol.-jO erfordert einen erheblichen Aufwand, da in der Praxis sehr geringe Differenzen

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gemessen werden müssen. Beim erfindungsgemäßen Verfahren hingegen läßt sich die Abweichung vom Sollwert beliebig groß einstellen, beispielsweise + 1 bis 10 YoL-⁰Zo. Dies bedeutet, daß 10 bis 100-fach größere Differenzen gemessen werden können und entsprechend ein wesentlich geringerer technischer Aufwand ausreicht. Hinzu kommt, daß das erfindungsgemäße Verfahren in vielen Fällen eine* Fermentation unter bestimmten Bedingungen, beispielsweise mit explosiven Gasgemischen in großem Umfang, mit radioaktiven Gasen und dgl., überhaupt erst möglich macht.

Die Regelung der sonstigen Fermentationsparameter wie z.B. pH-Wert, Trübung, Temperatur usw. erfolgt in bekannter 7/eise. In der Zeichnung ist schematisch auch die Regelung von Temperatur und pH-Wert durch entsprechende Keßfühler im Fermenter I angedeutet.

Außer den bereits erwähnten Vorteilen wie Ermöglichung industrieller Fermentationsanlagen unter Verwendung explosiver Gasgemische, beispielsweise zur Erzeugung von Einzellerprotein und Ersatz riesiger Sterilluftmengen bei aeroben Fermentationen durch wenig Reinsauerstoff ermöglicht das Verfahren der Erfindung auch Fermentationen unter hohem Druck; Steuerung des physiologischen Zustandes der Zellen bei mikrobiologischen Verfahren durch Steuerung des Sauerstoff partialdruckes, Untersuchungen über das Verhalten von Inert- und Stoffwechselgasen unter hohen Drücken in Mikroorganismen, die Kopplang gaserzeugender und gasverbrauchender Fermentationen und die Anwendung stark radioaktiver Ausgangsprodukte bei mikrobiologischen Verfahren in technischem Haßstab. Besondere Vorteile bietet das Verfahren der Erfindung bei Anwendung von Kohlenwasserstoffen als

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Kohlenstoffquelle zusammen mit gasförmigem Sauerstoff.

Die folgenden Beispiele erläutern anhand praktischer Ausführungsformen das Verfahren der Erfindung weiter.

Beispiel 1

In einem handelsüblichen Fermenter von 50 1 Nutzinhalt mit selbstansaugendem Begasungsrührer wie in der Zeichnung dargestellt wird eine rein mineralische Nährlösung ohne Kohlenstoffquelle angesetzt und sodann mit Luft als Gasphase sterilisiert. Die Lösung enthält in 50 1 Wasser: 450 g Na₂HPO₄.12 H₂O; 75 g KH₂PO₄; 50 g (NH₄J₂SO₄; 10 g MgSO₄. 7 H₂O; 25 g NaHCO₅; 500 mg CaCl₂; »50 rag Ferri-ammonium-citrat und 100 ml Spurenelementlösung nach HOAGLAND. Reglereinstellung für den pH-Wert der Lösung 6,9 bis 7,0.

Nach dem Beimpfen des Fermenters mit 5 1 gut gewachsener Kultur von Hydrogenomonas sp. wird die Luft des Gasraums durch Einleiten von sterilfiltriertem Wasserstoff verdrängt und die Reglereinstellung für den Sauerstoffgehalt auf 18,0 bis 20,0 Vol.-% und für den Kohlendioxydgehalt auf 9,0 bis 11,0 Vol.-$ gebracht. Der Gasdruck im Fermenter beträgt während der ganzen Fermentation 1,2 bar. Fermentationstemperatur 28 bis 30⁰C.

Nach 60 Std. Fermentationsdauer werden 644 g Bakterien-Biomasse mit 82 Gew.-^ Wassergehalt entspr. 116 g Trockensubstanz erhalten; Anteil an Rohprotein 46,1 Gew.-^, bezogen auf Trockensubstanz, entspr. einer Gesamtausbeute von 53,4 g Rohprotein bei einem Gasverbrauch von insgesamt 3050 Nl Wasserstoff, 720 Nl Sauerstoff und 420 Nl Kohlendioxid.

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Beispiel 2

Es wird eine Anlage wie in der Zeichnung dargestellt verwendet, die einen Fermenter I und ein Reaktionsgefäß II aufweist. Wie in Beispiel 1 beschrieben wird eine mineralische Nährlösung angesetzt. Die Lösung enthält in 50 1 Wasser: 250 g (HH₄J₂HPO₄; 100 g KH₂PO₄; 50 g Na₂HPO₄.12 H₂O 5 g MgSO₄.7 H₂O; 100 ml Spurenelementlösung nach HOAGLAND. Als Kohlenstoffquelle dienen 5 kg einer Gasölfraktion mit 15 Gew.-% assimilierbarem n-Alkan-Anteil, berechnet als Hexadekan. Die Füllung des Reaktors II (Nutzvolumen 5 1) im Gasirreislauf besteht aus grobkörnig-porösem NaOH, KOH oder handelsüblichem Atemkalk. Die Reglereinstellung für den pH-Wert der Lösung ist 5,4 bis 5»6.

Nach dem Beimpfen des Fermenters mit 5 1 gut gewachsener Kultur von Candida sp. wird die Reglereinstellung für den Sauerstoff auf 28,0 bis 30,0 Vol.-% gebracht. Fermentations temperatur 28 bis 30⁰C.

Nach 60 Std. Fermentationsdauer werden 3675 g Hefe-Biomasse mit.80 Gew.-# Wassergehalt entspr. 735 g Trockensubstanz erhalten. Der Anteil an Rohprotein beträgt 51*3 Gew.-?£_f bezogen auf die Trockensubstanz, entspr. einer Gesamtausbeute von 377 g Rohprotein bei einem Gasverbrauch von 420 Nl Sauerstoff.

Zur Erzielung einer gleichen Menge Rohprotein in einem Fermentationsgefäß mit offener Fermentation werden 180 000 Nl sterile Luft benötigt.

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Beispiel 3

In einer Fermentationsanlage gemäß Zeichnung, inder jedoch der Reaktor II durch einen weiteren Ferraenter analog dem Fernienter I ersetzt ist, werden die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Fermentationen gekoppelt durchgeführt. Hierbei werden 4319 g Biomasoe, bestehend aus 3675 g Hefemasse und 644 g Bakterienmasse, mit einem Gesamtgehalt von 430 g Rohprotein erhalten. Der Verbrauch an Viasserstoff beträgt 3050 Nl, der Sauerstoffverbrauch II40 Nl.

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Claims (7)

Patentansprüche

1. Fermentationsverfahren unter Zusatz von gasförmigen Rohstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß mit geschlossenem Gaskreislauf gearbeitet wird, im Abgas die Menge der verbrauchten Gasbestandteile gemessen wird und eine dem verbrauchten Gas stöchiometrisch entsprechende Frischgasmenge in den Kreislauf eingeschleust wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß im Abgaskreislauf gasförmige Fermentationsprodukte entfernt v/erden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gasförmigen Fermentationsprodukte durch, Absorption oder Reaktion entfernt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gasförmigen Fermentationsprodukte in einer zweiten Fermentationsreaktion als Rohstoff verbraucht werden.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet durch einen Fermenter (I) mit einer im Kreislauf in diesen zurückgeführten Abgasleitung (5), die eine Meßstrecke (5a) aufweist, in der ein oder mehrere Fühler (6) zur Kessung des stöcliiometrischen Gasverbrauchs angeordnet sind und mit einer liegelungseinrichtung (8, 9, 10, 11, 12) verbunden ist bzv;. sind, welche die stöchiometrische Zugabe von Frischgas in die Leitung (5) steuert.

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6. Vorrichtung nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch einen Reaktor (II) in der Abgaskreislaufleitung (5).

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktor (II) aus einem Fermenter besteht.

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