KR870001649B1 - 미생물 배양제어방법 및 장치 - Google Patents

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내용 없음.

Description

미생물 배양제어방법 및 장치

제1도는 탄산가스 생성랑과 균체증식량과의 관계를 나타낸 그래프.

제2도는 균체중 탄소함유량의 배양에 있어서의 경시변화를 나타낸 그래프.

제3도는 균체증식량 대 탄산가스생성량의 비와 배양조내의 탄산가스분압과의 관계를 나타낸 그래프.

제4도는 본원 발명장치의 일실시 예양태를 나타낸 모식도.

제5도는 빵효모배양에 있어서의 배가스의 탄산가스분압과 균체수율의 관계를 나타낸 그래프.

제6도는 본원 발명에 사용하는 배양제어장치의 일구체예를 나타낸 모식도.

제7(a)도는 실시예 1에 있어서의 배양시간과 통기가스의 통기량과의 관계를 나타낸 그래프, 제7(b)도는 배양시간과 통기가스중의 산소농도와의 관계를 나타낸 그래프, 제7(c)도는 배양시간과 교반기회전수와의 관계를 나타낸 그래프.

제8도는 교반기회전수와 산소이동속도와의 관계를 나타낸 도면.

제9도는 통기량과 산소이동속도와의 관계를 나타낸 도면.

본원발명은 미생물의 배양에 있어서, 배양조내의 탄산가스분압을 지표로 하여, 이것과 미생물이 생성하는 탄산가스량에서 배양액중의 미생물균체량(菌體量)을 산출하고, 이 산출한 균체량을 근거로하여 그것에 응한 기질(基質)공급량제어를 하는 미생물의 배양제어방법 및 장치에 관한 것이다.

미생물의 배양은 기질을 연속적으로 또는 단속적으로 공급해서 행해진다. 이 기질의 공급에 대해서는 미생물, 기질등 각각의 배양에 있어서의 지금까지의 배양실적을 근거로 해서 배양시간과 바람직한 기질공급량과의 관계 또는 균체량이 생산목표에 도달하는 시간을 추측하고, 배양전에 기질 공급프로그램을 작성하고 있는 것이 현실정이다.

그러나 각배양에 있어서 사용하는 미생물의 활성은 반드시 같지는 않으므로 미리 정한 프로그램에 따라서 기질을 공급하는 방법으로는 효율이 좋은 배양을 항상 할수는 없었다.

예를들면, 에탄올 자화균(資化菌) 또는 메탄올자화균을 각기 에탄올, 메탄올을 주탄소원으로서 배양할 경우, 기질공급량이 과잉이 되면 균체의 증식저해를 일으키며, 반대로 기질공급량이 부족하면 균체증식이 억제되는 것이 알려져 있다.

또 당을 주탄소원으로해서 빵효모를 배양할 경우, 기질공급량이 과잉이 되면 빵효묘는 공급된 당을 에탄올에 전환하도록되며, 대당수율(공급한 기질량에 대한 균체증식량의 비율)이 저하하며, 반대로 기질공급량이 부족되면 빵효모의 증식이 억제되고, 배양조단위용적, 단위시간당 생산성이 저하하는 것도 알려져 있다.

배양프로세스에 있어서는 상술한 배양예에서 명백한 것처럼 배양액중의 균체량을 신속하게 아는 일 및 그것에 의거하여 기질공급량을 제어하는 일이 동 프로세스를 효율적으로 운전하는데 중요하다.

배양액중의 균체량을 아는 방법으로서는 배양액의 일부를 원심분리나 여과함으로써 균체를 분리한 다음 110℃ 전후에서 장시간 건조하여 건조중량을 측정하는 방법, 배양액의 일부를 채취하여 현미경으로 균수를 세는 방법, 배양액의 탁도(濁度)를 측정함으로써 균체농도를 추정하는 방법등이 있고, 또 산소의 소비속도 또는 탄산가스의 생성속도에서 균체량을 추정하는 방법도 알려져 있다.

그러나 건조중량을 측정하는 방법은 배양액을 채취하고나서 측정결과를 얻기까지에 10시간이상이나 걸린다고 하는 문제점이 있고 균수를 계산하는 방법은 계수치의 불균형이 크다고 하는 문제점이 있다. 따라서 이 두방법으로는 배양액중의 균체량을 신속하고 정도(精度)좋게 알 수 없으며, 또 균체량에 응한 기질공급량제어를 할 수도 없다.

탁도로부터 균체농도를 추정하는 방버에서는 배양액이 투명한 것이 필요하지만, 공업적으로 행하는 배양에서는 배양액이 꽤착색되어 있다는 일, 및 균체이외의 고형분을 포함하는 일이 많기 때문에, 균체농도를 정확히 아는 것은 곤란하다. 따라서 신뢰성의 문제에서 이 방법을 균체량에 응한 기질공급량제어에 응용할 수 없다.

산소소비속도 및 탄산가스생성속도에서 균체를 추정하는 방법에서는 단위균체량당의 산소소비속도 또는 탄산가스생성속도가 일정하다고 가정하고 있지만 그것은 후술하는 바와 같이 환경조건, 특히 탄산가스분압으로 커다란 영향을 받아 일정하지는 않다.

이상과 같이 미생물의 배양에 있어서, 배양액중의 균체량을 신속하고 정도좋게 아는 방법은 종래에는 알수 없었다. 그래서, 균체량에 응한 기질공급량의 제어를 행하는 배양방법은 아직 확립되어 있지 않다.

본원발명의 목적은 미생물배양에 있어서 항상 양호한 기질공급조건을 유지하며 균체 또는 생산물의 높은 수율을 유지할 수 있는 배양제어방법을 제공하는데 있다.

본 원발명은 미생물의 배양에 있어서 탄산가스 생성량과 균체증식량과의 사이에 비례관계가 있으며, 탄산가스생성량에 대한 균체증식량의 비는 배양조내의 탄산가스분압에 의존한다고하는 본원 발명자들이 발견한 사실에 의거하여 이루어진 것이다.

본원 발명은 배양조내의 압력, 배가스유량 및 배가스중의 탄산가스농도를 측정함으로써 배양조내의 탄산가스분압과 미생물이 생성하는 탄산가스량을 계량하고, 이 탄산가스분압과 탄산가스생성량으로부터 균체량을 산출하여 배양액중의 균체량을 산출하고 이 산출된 균체량에 응해서 기질공급량을 제어하는 것을 특징으로하는 미생물배양제어방법이다. 또 본원 발명의 방법은 배양조의 압력측정수단 배가스유량측정수단 및 배가스중의 탄산가스농도측정수단, 이들 각 수치에서 배양조내의 탄산가스분압 및 미생물에 의한 탄산가스생성량을 산출하고, 그것에서 균체량을 산출하는 수단, 그 수치로부터의 기질공급량의 결정수단 상기 산출수단을 위한 수치설정수단 및 결정된 결과에 의거하여 작동하는 기질공급량 조절수단의 조합(組合)으로 이루어진 것을 특징으로하는 미생물배양제어장치에 의해 실현된다.

즉, 배양욕조내의 탄산가스분압을 산출하는 동시에, 임의의 시간간격마다 탄산가스생성량을 구하고, 탄산가스분압에 응한 균체증식량과 탄산가스생성량과의 비에서, 그 시간간격에 있어서의 균체증식량을 구하고, 배양액중의 전 균체량을 산출하며, 그리고 그 산출된 배양액중의 균체랭에 의거하여 균체량에 응한 기질공급량 제어를 하는 것이다.

본원발명의 미생물배양제어방법은 미생물을 산소부화가스를 사용하여 배양할때에, 수율과탄산가스분압과의 관계에 있어서의 탄산가스분압의 임계치와 용존산소량과의 상대관계를 산소부와가스의 통기량, 그 산소농도 및 교반기 회전수의 조합에 의해 제거하는 것을 특징으로 하는 것이다.

본원 발명에 의하면, 배양조내의 탄산가스분압을 지표로 하여, 배양액중의 균체량을 신속하고 정도좋게 산출할 수 있고, 또한 그 산출된 균체량에 의거하여 기질공급량의 대소를 신속하게 조절할 수 있으며, 그 결과, 배양기간을 통해서 균체 또는 생산물의 수율을 높이 유지할 수 있음을 알수 있을 것이다.

본원 발명에 의하면, 산소부화가스의 통기량, 그 산소농도 및 교반기 회전수를 조합해서변화시킴으로써 배가스의 탄산가스분압 및 용죤산소량을 적정하게 제어할 수 있으므로, 생산물(예를들면 빵효모에 있어서의 균체 및 이 노신발효에 있어서의 발효생산물등) 수율이 높으며 또한 고생산물농도로 미생물을 배양할 수 있다.

제1도는 탄산가스생성량과 균체증식량과의 관계를 나타낸 그래프이며 당을 주탄소원으로하여 빵효모를 배양한 예(도면중 ○, △, □는 각 실험을 나타낸다)에 있어서 배양조내의 탄산가스분압을 0.1기압으로 제어한 것이다. 제1도에서 명백한 것처럼, 배양중 어느 구간(배양 1시간을 구간으로 한)에 대해서도 균체증식량과 탄산가스생성량과의 비는 탄소수지에서 보았을 경우, 1.0으로 일정했었다. 각 측의 단위는 탄소로서 계산한 g이다.

또 이 배양에 있어서의 균체중 탄소함량을 동 실험에 있어서의 균체중 탄소함량 %와 배양시간의 관계를 나타낸 제2도에서 명백한 것처럼 배양기간을 통해서 45%로 일정했었다.

양 도면에 있어서 실험 1~3은 균체량에 대한 당의 공급량 제어를 변화시켜 간 것이며, g글르코오스/g 드라이셀. 시로 나타내면, 실험 1은 0.29, 실험 2는 0.37, 실험 3은 0.43에 제어해서 배향을 했다.

배양조내의 탄산가스분압과 균체증식량 대 탄산가스생성량의 비와의 관계를 나타낸 도면이 제3도이다. 제3돈느 균체증식량고가 탄산가스생성량의 비가배양조내의 탄산가스분압에 의해서 결정되는 것을 명시하고 있다.

이상의 일로부터 배양조내의 압력, 배가스유량 및 배가스중의 탄산가스 농도를 측정함으로써, 배양조내의 탄산가스분압 및 탄산가스생성량을 구하면 다음 식에 의해서 배양액중의 균체량을 산출할 수 있다는 것이 명백하다.

X₂=X₁+K

CO₂(1)

식(1)에서 X₂; 시각 t₂에 있어서의 배양액중의 균체량(g)

X₁: 시각 t₁에 있어서의 배양액중의 균체량(g)

CO₂: 시각 t₁에서t₂사이에 생성한 탄산가스량(g)

K : 균체증식량과 탄산가스생성량과의 비(배양조내의 탄산가스분압에 의존한다)

본원 발명의 방법에 있어서, 균체량을 산출하는데는 배양조내의 탄산가스분압과, 균체증식량 대 탄산가스생성량의 비와의 관계를 알 필요가 있고, 그것은 균주 및 기질에 의해 다르지만, 미리 회분배양실험 및 연속배양실험을 해서 그것을 구해 두면 된다.

본원 발명에 있어서, 배양조내의 탄산가스분압을 직접 측정하는 수단은 없지만 조내의 압력과 배가스유량 및 배가스중의 탄산가스농도를 측정함으로써 조내의 탄산가스분압뿐만 아니라 미생물에 의한 탄산가스생성량도 계산에 의해서 구할 수 있다. 그 경우에 조내압력의 측정방법으로서는 예를 들어전기저항압력계, 탄성식압력계 또는 열선진공계등을 사용하는 방법이 있고, 배가스유량특정방법으로서는 예를들어 더어멀머스프로미터에 의한 방법이 있으며, 그리고 배가스중의 탄산가스농도를 측정하는 방법으로서는 예를 들어 적외선가스분석계 또는 프로세스가스크로마토그래피등을 사용하는 방법등이 있다. 이들은 모두가 전기신호로서 취출할 수 있으므로, 조내 탄산가스분압 및 탄산가스생성량을 함께연속적으로 온라인으로 신속히 산출할 수 있으며, 그것에 수반해서 균체량산출도 신속하게 할 수 있다.

다음에 본원 발명의 일실시양태의 개략을 제4도에 의거하여 설명한다. 제4도에 있어서 (101)은 배양조을 나타내며, 그것에는 공급량가변의 기질공급수단(102)에 의해 기질이 공급된다. 이 기질공급수단(102)은 기질공급량 조절수단(103)에 의해서 제어된다. 기질공급수단(102)으로서는 예를들어 토출량(吐出量)가 변의 정량펌프로 좋으며, 기질공급량조절수단(103)으로서는 예를 들어 기질공급수단(102)에 연동하는 전기식스트로크장 조절장치로 좋다. (104)는 통기가스발생수단을 나타내며, 예를들어 콤크레서로 좋다. (105)는 배가스유량측정수단을 나타내며, 예를들어 전기신호를 취출하는 것이 가능한 상기한 더어멀마스프로우미터라도 좋다. (106)은 배양조내 압력측정수단을 나타내며, 예를들어 전기저항 압력계로 좋다. (107)은 배가스중의 탄산가스농도 측정수단을 나타내며, 예를 들어 적외선가스분석기로 좋다. (108)은 계산수단을 나타내며, 예를들어 마이크로콤퓨우터로 좋다. (108')는 균체량산출수단을 나타낸다. (108")는 기질공급량 결정수단을 나타내며, 균체량산출수단(108')에 의한 계산결과를 근거로 기질공급량을 결정한다. (109)는 수치설정수단을 나타내며, 예를 들어 키이보오드로 좋다. 그리고 (109)

(108')는 식(1)의 K값을 부여하고, (109)

(108")는 균체량에 대한 기질공급량의 대소를 판정하는 기준치를 부여한다.

이상의 각 수단으로 이루어진 배양장치를 사용한 미생물의 배양제어방법은 다음과 같다. 배양을 하기전에 종균을 배양조(1)에 투입한다. 그리고 미리 구해놓은 배양조내의 탄산가스분압과 균체증식량 대 탄산가스생성량의 비와의 관계 및 초기균체량을 수치설정수단(109)에 의해 계산수단(108)에 입력한다.

배영은 통가스발생수단(104)에 의해 가스가 공급되며, 기질공급수단(109)에 의해 기질이 공급되어서 행해진다. 배가스의 유량과, 그 안의 탄산가스농도가 또 조내압력이 계측되어서, 그들의 각 결과는 전기신호로서 계산수단(108)으로 보내진다.

균체랭산출수단(108')은 배양조내압력측정수단(116)과, 배가스유량측정수단(105) 및 배가스중의 탄산가스농도측정수단(107)으로부터의 각 신호를 근거로하여, 조내의 탄산가스분압 및 미생물에 의한 탄산가스생성량을 계산한다. 그리고 수치설정수단(109)으로부터의 신호를 근거로해서, 상술한 식(1)에 의해 배양액중의 균체량을 산출한다.

기질공급량결정수단(108")은 산출한 균체량을 근거로하여, 균체량에 대한 기질공급량이 작을 경우는 기질공급량을 크게하도록 기질공급량조절수단(103)에 신호를 낸다. 또 반대로 균체량에 대한 기질공급량이 클 경우에는 기질공급량을 작게 하도록 기질공급수단(103)에 신호를 낸다.

기질공급량조절수단(103)은 기질공급량결정수단(108")으로부터의 신호를 근거로 기질공급수단(102)의 제어를 한다.

기질공급량결정수단(108")에 있어서의 균체량에 대한 기질공급량의 대소의 판정은 배양하는 미생물에 의해서 다르지만 각각의 미생물에 대해서 미리 배양실험을 하고, 판정기준을 명확하게 해 두면 된다.

그리고, 미생물을 산소부화가스를 사용하여 배양할 경우에는 용존산소농도의 제어도 조합해서 하는 것이 적당하다. 이 용존산소농도의 제어를 하는데는 통기가스유량과, 그 통기가스산호농도 및 교반기회전수를 변화시키면 된다.

다음에 본원 발명의 실시예와 비교예를 나타내지만, 본원 발명은 이들 실시예에 위해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

균체 : 빵효모(Saccharomyes cerevisiae)

배지 : 모라세스(페당밀)를 30% 당액으로 조제하고, 그것에 요소와 인산을 각기 11.1g/ℓ,4.1g/ℓ의 농도가 되도록 용해했다.

배양조건 : 1ℓ용(容)의 미니자아파멘터를 사용하여 온도 30℃, pH₅, 배양조내의 탄산가스분압 0.1기압으로 하고, 균체증식량과 탄산가스 생성량과의 비를 1.0으로하여 균체량을 산출했다(제3도 참조). 그리고 미리 배양실험에 의해 최적조건으로서 결정한 균체량에 대한 당의공급량이 0.3±0.1g글루코오스/g드라이셀. 시가 되도록 상기 배지를 유가(流加)했다.

또, 용존산소농도를 2~5mg/ℓ로 유지하도록, 통기 가스유량과 통기가스산소농도 및 교반기회전수를 변화시켰다. 초기배양액량은 350mℓ로 하고, 초기균체농도는 30g 드라이셀/ℓ로 했다.

결과 : 배양시간 12시간으로 배양액량은 700mℓ로 되고, 균체농도는 83g 드라이셀/ℓ에 달했다. 배양기간을 통해서 배양액중의 에탄올농도는 150mg/ℓ이하의 저농도로 유지할 수 있었고, 대당수율(對糖收率)은 45%였다.

[실시예 2]

균체 : 빵효모(Saccharomyes cerevisiae)

배지 : 글루코오스를 30%농도로 하고, 요소를 64.5g/ℓ, 인산나트륨을 30g/ℓ, 황산마그네슘 11.4g/ℓ, 구연산나트륨을 75g/ℓ, 효모엑스를 15g/ℓ, 및 비타민용액을 가하고, 수도물에 용해했다.

배양조건 : 15ℓ용 자아파멘터를 사용하여, 온도 30℃, pH₅, 배양조내의 탄산가스분압 0.1기갑으로하고, 균체증식량과 탄산가스생성량과의 비를 0.1로 하여 균체량을 산출했다. 그리고, 균체량에 대한 당의 공급량이 0.3±0.1글루코오스/g드라이셀. 시가 되도록 상기 배지를 유가했다. 또, 잔존산소농도를 2~5mg/ℓ로 유지하도록 통기 가스유량과 통기가스산소농도 및 교반기회전수를 변화시켰다. 초기배양액량은 5ℓ로 하고, 초기균체농도는 50g 드라이셀/ℓ로 했다.

결과 : 배양시간 12시간으로 배양액량은 11ℓ로 되고, 균체농도는 95g 드라이셀/ℓ에 달했다. 배양기간을 통해서 배양액중의 에탄올농도는 150mg/ℓ이하의 저농도로 유지할 수 있었고, 대당수율은 44%였다.

[실시예 3]

균체 : 빵효모(Saccharomyes cerevisiae)

배지모라세스(페당밀) 55%를 당액으로 조제하고, 그것에 요소와 인산을 각기 16.6g/ℓ,6.2g/ℓ의 농도가 되도록 용해했다.

배양조건 : 15ℓ용 자아파멘터를 사용하여, 온도 30℃, pH₅, 배양조내의 탄산가스분압 0.1 기압으로하고, 균체증식량과 탄산가스생성량과의 비를 0.1로 하여 균체량을 산출했다. 그리고, 균체량에 대한 당의 공급량이 0.3±0.1g글루코오스/g 드라이셀. 시가 되도록 상기 배지를 유가했다. 또, 용존산소농도를 2~5mg/ℓ로 유지하도록 통기가스유량과 통기가스농도 및 교반기회전수를 변화시켰다. 초기배양액량은 5ℓ로 하고, 초기균체농도는 50g 드라이셀/ℓ로 했다.

결과 : 배양시간 12시간으로 배양액량은 9.0ℓ이 되고, 균체농도는 120g 드라이셀/ℓ에 달했다. 배양기간을 통해서 배양액중의 에탄올농도는 150mg/ℓ이하의 저농도로 유지할 수 있었고, 대당수율(對糖收率)은 4%였다.

[비교예(에탄올 농도에 의한 제어예)]

균체 : 빵효모(Saccharomyes cerevisiae)

배지 : 모라세스(페밀당)를 32% 당액으로 조제하고, 그것에 요소와 인산을 각기 11.8g/l,4.4g/ℓ의 농도가 되도록 용해했다.

배양조건 : 1ℓ용 미니자아파맨터를 사용하여 온도 30℃, pH₅, 에탄올농도를 지표로 하여 상기 배지를 유가했다. 즉, 에탄올 농도가 낮을때는 유가량을 증가하고, 높을때는 유가량을 감소시켰다. 또, 용존산소농도를 2~5mg/ℓ로 유지하도록, 통기가스유량과 통기가스 산소농도 및 교반기회전수를 변화시켰다.

초기 배양액량은 0.35ℓ로 하고, 초기균체농도는 57g 드라이셀/ℓ로 했다.

결과 : 배양시간 15시간으로 배양액량은 700mℓ로 되고, 균체농도는 94g 드라이셀/ℓ에 달했다. 배양액중의 에탄올 농도는 200~4700mg/ℓ로 변화되어, 대당수율은 38%이고, 에탄올생성을 방치할 수 없었고, 저율(低率)이었다.

다음에 본원 발명자들은 미생물의 호기적(好氣的)배양에 있어서, 탄산가스분압을 어느 정도로 제어하면 좋은지, 즉 탄산가스분압의 임계치에 대해 검토하기 위해, 일례로서 빵효모를 사용하여 산소부화가스배양을 했다. 그 결과를 제5도에 나타낸다. 즉, 제5도는 배기가스의 탄산가스분압과 균체수율과의 관계를 나타낸 그래프이다. 제5도에서 명백한것처럼 배가스의 탄산가스분압을 0.2 기압이하로 제어함으로써, 균체수율의 저하를 방지할 수 있다.

본원 발명에 있어서는 이 제어를 행하기 위해, 산소부화가스의 통기량, 산소농도 및 교반기회전수의 조정을 하지만 이때 중요한 것은 미생물의 호기적배양에 있어서는 배가스의 탄산가스분압 외에 배양액중의 용존산소량을 적정하게 유지하는 일이다. 즉 빵효모를 예를들면 용존산소량이 0.2ppm이상이면 빵효모는 호기적대사를 하며, 균체는 순조롭게 증가하지만, 이것이 0.2ppm이하가 되면 혐기적(嫌氣的)대사로 되어 에탄올을 생성하며, 그것에 의해 균체의 수율이 저하한다. 그리고 용존산소량이 지나치게 높으면(5ppm을 넘으면) 반대로 고용존산소에 의한 증식저해가 생겨서 바람직스럽지 못하다. 따라서, 용존산소량을 적정(0.2~5ppm)하게 유지하는 일이 호기적 배양에 있어서 특히 중요해진다.

이상의 관점에 서서, 본원 발명에 있어서는 생산물의 수율과 탄산가스분압과의 관계에 있어서의 탄산가스분압의 임계치(예를들어 빵효모의 경우 상기 0.2기압)와 용존산소량(예를들어 0.2~5ppm)과의 상대적관계를 산소부화가스의 통기량 그 산소농도 및 교반기회전수의 조합에 의해 제어한다.

즉 : 배가스의 탄산가스분압이 상승했을 경우에는 산소부하가스의 통기량을 올려서 탄산가스분압을 내리지만, 그것에 의해 용존산소량이 올라가므로 교반기회전수를 내리던지 또는 통기가스중의 산소농도를 내리는 일이, 또는 교반기회전수와 통기가스중의 산소농도를 동시에 변화시키는 일이 필요하다. 또 한편, 통기량을 올려서 탄산가스분압을 내리는 대신에 조내압력을 내려 탄산가스분압을 내릴수도 있지만, 이 경우에는 반대로 용존산소량이 저하하기 때문에 교반기회전수를 올리든지 통기가스중의 산소농도를 올릴 필요가 있다.

다음에 미생물에 의해서는 배가스의 탄산가스분압을 어느정도 요구하는 경우가 있다. 이 경우에는 상기 탄산가스분압을 내릴때와 반대로하면 된다. 즉, 통기량을 내리면 용존산소량이 저하하기 때문에 교반기회전수를 올리거나 통기가스중의 산소농도를 올리든지 또는 이들 조작을 동시에 하면된다. 또 한편, 조내압력을 올려서 탄산가스분압을 올릴 경우에는 용존산소량이 상승하기 때문에 교반기회전수 또는 통기가스중의 산소농도를 내릴 필요가 있다.

이상의 조작에 의해 배가스중의 탄산가스분압과 함께 용존산소량을 동시에 제어하는 것이 가능해진다.

그리고 배양조가 교반기를 갖추고 있지 않은 기포탑(氣泡塔)일 경우에는 상기 제어방법에서 교반기회전수를 바꾸는 조작을 제외한 다른 조작을 동시에 행함으로써, 유효한 배양제어를 하는 것이 가능하다.

또 본원 발명에 있어서의 통기가스중의 산소농도를 변화시키는데는 산소봄베와 에어콤프레서를 사용해서하거나 또는 흡착식산소분리기 또는 심냉식(深冷式) 산소분리기를 사용할 수 있다.

다음에 본원 발명을 도면에 의거하여 설명한다. 즉 제6도는 본원 발명에 사용하는 배양제어장치의 일구체예를 나타낸 모식도이며, (201)은 배양조(202)는 교반기(203)은 산소분리기(204)는 전자계산기(205)는 기질탱크(206)은 기질공급펌프(207)은 산소가스측정기(208)은 통기량측정기(209)는 탄산가스분압측정지,(210)은 압력조절기, (211)은 용존산소센서(213)~(216)은 도관을 나타낸다. 제6도에 의거하여 배양조(201)내에 종균을 넣어, 기질탱크(205)에서 기질을 기질공급펌프(206)에 의해 배양조(201)에 공급한다. 이때, 용존산소센서(211), 탄산가스분압측정기(207) 및 통기량측정기(208)로부터의 신호를 전자계산기(204)로 처리하고 제어프로그램에 따라서 산소분리기(203), 교반기(202) 및 압력조절기(210)에 신호를 보내고, 통기량, 조내압력, 교반기 회전수 또느 통기가스중의 산소농도르 제어할 수 있다.

다음에 본원 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하지만, 본원 발명은 이들에 의해 아무런 한정을 받는 것이 아니다.

[실시예 4]

균체로서 Saccharomyes cerevisiae(빵효모)를 사용하여, 배지는 글루코오스300g, 요소 32.25g, NaHPO₄.2H₂O 15g,MgSO₄.7H₂O 를 5.7g,KCl 3.3g, 구연산나트륨 37.5g, 효모엑스 7.5g, 비타민액 15ml및 미네랄액 15ml을 수도물 1ℓ에 가하여 용해하고, pH5.0에 조정했다. 단, 비타민액은 비오틴 10.04g 비타민 B₁0.08g 비타민 B₃200g, 판토텐산칼슘 1.0g 및 이노시토올 20g을 증류수 1ℓ에 용해하여 작성하고, 미네랄액은 CaSO₄. 5H₂O를 0.05g, ZnSO₄. 7H₂O를 0.8g 및 FeSO₄(NH₄)₂, 6H₂O를 0.3g 사용하여, 이들을 증류수 1ℓ에 용해해서 작성했다.

균체의 배양은 다음 조건으로 했다. 즉 15ℓ용 자아파멘터(배양조)를 사용하여, 온도 30℃, pH5.0으로 상기 배지를 유가하고, 배가스의 탄산가스분압을 0.2기압, 용존산소량을 5ppm로 유지하기 위해서, 흡착산소분리기를 사용하여 통기가스의 통기량, 통기가스중의 산소농도 및 교반기회전수를 제7도에 나타낸 것처럼 변화시켰다. 즉 제7(a)도는 배양시간과 통기가스의 통기량과의 관계를 나타낸 그래프, 제7(b)도는 배양시간과 통기가스중의 산소농도와의 관계를 나타낸 그래프, 제7(c)도는 배양시간과 교반기회전수와의 관계를 나타낸 그래프이다. 그리고, 초발(初發)배양액량은 5.0ℓ, 초발균체농도는 50g/ℓ로 했다.

그 결과, 배양 12시간을 통해서 배가스의 탄산가스분압을 0.2±0.02기압용존산소량을 5±1ppm으로 유지할 수 있었다. 또 이 경우의 균체농도는 94g/ℓ의 고농도에 달하며, 균체수율은 0.44g/ℓ이었다.

[실시예 5]

균체, 배지는 실시예 1과 전적으로 같이하고, 배양조건중 배가스의 탄산가스분압을 0.03기압, 용존산소량을 5ppm으로 유지하기 위해서 흡착식 산소분리제를 사용하여, 통기량, 통기가스중의 산소농도 및 교반기회전수를 각기 10~15ℓ/분, 50~80%, 150~800rpm의 범위로 변화시켰다. 초발배양액량을 5.0ℓ로 하고, 초발균체농도를 50g/ℓ로 했다.

그 결과, 배양 12시간을 통해서 배가스의 탄산가스분압을 0.03±0.002atm, 용존산소농도를 5±1ppm으로 유지할 수 있었다이 경우의 균체농도는 95g/ℓ의 고농도에 달하며, 균체수율은 0.46g/ℓ이었다.

균체, 배지는 실시예 1과 전적으로 같이하고, 배양조건중 배가스의 탄산가스분압을 0.35기압, 용존산소량을 5ppm으로 유지하기 위해 흡착식 산소분리재를 사용하여 통기량, 통기가스중의 산소농도 및 교반기회전수를 각기 1~2ℓ/분, 50~80%, 400~800rpm의 범위로 변화시켰다. 초발액량을 5.0ℓ로 하고, 초발균체농도를 50g/ℓ로 했다.

그 결과, 배양 12시간을 통해서 배가스의 탄산가스분압을 0.35±0.002atm, 용존산소농도를 5±1ppm으로 유지할 수 있었다. 이 경우의 균체농도는 82g/ℓ, 균체수율은 0.38g/g이며, 배가스의 탄산가스분압이 높으면 균체수유이 저하하기 때문에 최종균체농도는 낮아졌다.

본원 발명자들은 용존산소농도를 용이하고 정도좋게 제어하는 방법에 대해서 더욱 상세하게 검토한 결과, 제1단계로서 교반기회전수를 제어하고, 제1단계로서 교반기회전수를 제어하고, 제2단계로서 통기가스의 산소분압을 제어하며, 제3단계로서 통기량을 제어하는 것이 바람직하다는 것을 발견하기에 이르른 것이다.

즉 제1단계로서 교반기회전수를 제2단계로서 통기가스의 산소분압을 제3단계로서 통기량을 변화시켜서 용존산소농도를 제어하는 것은 다음에 기술하는 이유에 의한다.

교반기회전수, 통기가스의 산소분압 및 통기량을 바꾸어 아황산산화법에 의해 배양조의 산소이동속도를 측정한 결과가 제8도 제9도이다. 제8도의 A는 순산소, B는 공기를 나타낸다. 또 제9도의 C는 교반기회전수 350rpm을 나타낸다. 이것에서 명백한 것처럼 교반기회전수를 2배로 올리면, 산소이동속도는 5배 이상으로 향상하며, 통기가스의 산소분압을 공기의 0.21atm에서 순산소의 1atm으로 올리면 산소이동속도는 약 5배 향상한다. 한편, 통기량을 2배 많게 하더라도 산소이동속도는 거의 향상하지 않는다. 이것에서 배양액중의 산소이동속도를 바꾸는데는 교반기회전수를 바꾸는 것이 가장 효과적이며, 통기가스의 산소분압, 통기량의 순으로 효과가 작아진다는 것을 알았다.

배양액중의 용존산소농도를 효율좋게 제어하는데는 산소 이동속도를 효과적으로 바꿀 수 있는 방법이 좋은 것으로부터 배양액의 용존산소농도가 저하했을 경우, 제 1단계로서 교반기 회전수를 올린다. 교반기회전수가 설정상한치로 되었을 경우는제2단계로서 통기가스중의 산소분압을 올린다. 통기가스중의 산소분압이 성정상한치로 되었을 경우는 제3단계로서 통기량을 올리는 것이다. 한편, 배양액의 용존산소농도가 설정치보다 높을 경우는 제1단계로서 교반기회전수를 내린다. 교반기회전수가 설정하한치로 되었을 경우는 제2단계로서 통기가스중의 산소분압을 내린다. 통기가스중의 산소분압이 설정하한치로 되었을 경우는 제3단계로서 통기량을 내리는 것이다.

또한 종래의 공기만의 통기의 경우에 비해서 산소부화가스를 사용함으로써, 2,000m-mol/ℓ.h라고 하는 높은 산소이동속도가 얻어진다. 이것에서 종래 불가능했었던 균체농도 20~50g/ℓ 이상의 고균체농도배양이 가능해지고, 배양의 생산성이 향상하는 동시에 배양액액량의 저감을 도모할 수 있다. 더하여 높은 용존산소레벨을 요구하는 배양이나 고점도 때문에 산소이동속도가 저하하기 쉬운 고점성배양등의 배양이 가능해 진다.

산소분압을 제어하는데는 조내압을 변화시키는 방법이나 통기가스중의 산소농도를 변화시키는 방법이 있다. 이들 방법의 모든 것을 사용할 수도 있고, 동시에 사용함으로써 보다 큰 산소분압을 얻을 수 있다.

통기가스중의 산소농도를 바꾸는데는 산소가스봄베나 흡작식 산소분리장치나 심냉식 산소분리장치들이 사용된다.

본원발명에 사용되는 미생물에는 삭카로미세스(Saccharomyces)속, 한제눌라(Hansenula)속, 토룰로프샤(Torulopsos)속, 피히아(Pichia)속, 캔디다(Candida)속, 및 더코토룰라(Mycotorula)속 등에 속하는 효모, 메틸로모나스(Methylomonas)속, 슈우도모니스(Pseudomonas)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 바실라스(Bacillus)속 및 코니레박테륨(Corynebacterium)속등에 속하는 노카르디아(Nocardia)속 및 스트렙통마이세스(Streptomyces)속 등에 속하는 방선균, 페니실륨(Penicillium)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속 및 트리코데르마(Trichoderma)속 등에 속하는 곰팡이등이 사용된다.

배양기질로서는 당밀등의 탄수화물, n-파라핀, 메탄올, 에탄올, 초산 및 지방산등이 사용된다. 기질이외의 부원료로서 통상의 배양에 사용되는 유안, 요소, 암모니아수, 인산칼륨, 효모엑스, 황산마그네슘, 황산제1철 및 각종 비타민, 미네락 등이 사용된다.

[실시예 6]

균주 : 한세눌라에 속하는 일균주(一菌株)

배지 : 기질로서 에탄올 400g에 대해, 부원료를 유안 60g, KH₂PO₄30g, NaHPO₄30g, MgSO₄5g, FeSO₄. 7H₂O 0.2g, MnSO₄. 4~6H₂O 0.02g, CaCl₂. 2H₂O0.02g, 사이아민 4mg량을 사용했다.

배양조건 : 50ℓ용자아파멘터를 사용하여 온도 35℃,pH3.5로 상기 배지를 유가하고, 용존산소농도를 교반기 회전수, 통기가스의 산소분압 및 통기량에 의해 제어했다. 그리고 통기가스의 산소분압은 에어콤프레서와 산소봄베를 사용하여 변화시켰다. 초발액량을 15ℓ로 하고 초발균체농도를 50g/ℓ로 했다.

결과 : 배양 15시간은 통해서 용존산소농도를 2~4ppm의 범위내로 유지할수 있었다. 이것에 의해 균체농도는 100g/ℓ의 고농도에 달하고 균체수율은 0.70g/g였다.

본원 발명의 일실시예에 의하면 용존산소농도의 제어가 용이하게 행해지기 때문에 고균체농도배양이 가능해지고, 배양조의 생산성을 향상시키는 효과가 있다.

Claims (8)

1. 배양조내의 압력, 배가스유량 및 배가스중의 탄산가스농도를 측정함으로써 배양조내의 탄산가스분압과, 미생물이 생성하는 탄산가스량을 계산하고, 이탄산가스분압과 탄산가스생성량에서 균체증식량을 산출하여 배양액의 균체량을 산출하며, 이 산출된 균체량에 응해서 기질공급량을 제어하는 것을 특징으로하는 미생물배양 제어방법.
2. 미생물을 공기 또는 산소부화가스를 사용하여 배양할 경우에 용존산소농도의 제어도 조합(組合)해서 하는 특허청구의범위 1기재의 미생물 배양 제어방법.
3. 수율과 탄산가스분압과의 관계에 있어서의 탄산가스 분압의 임계치와 용존산소량과의 상대관계를 산소부화가스의통기량 그 산소농도 및 교반기 회전수의 조합에 의해 제어하는 것을 특징으로하는 특허청구의 범위 2기재의 미생물 배양제어방법.
4. 탄산가스분압의 임계치와 용존산소량과의 상대관계를 산소부화가스의 통기량, 그 산소농도, 교반기회전수 및 조내압력의 조합에 의해 제어하는 특허청구의 범위 3기재의 미생물 배양제어방법.
5. 미생물이 빵효모인 특허청구의 범위 1 또는 2기재의 미생물 배양 제어방법.
6. 빵 효모 배양시에 탄산가스분압을 0.2기압 이하, 용존산소량을 0.2~5ppm으로 유지하는 것을 특징으로하는 특허청구의 범위 5기재의 미생물 배양제어방법.
7. 미생물을 호기적(好氣的)으로 배양할 때에 교반기회전수, 통기 가스중의 산소분압 및 통기량을 사용하여 용존산소농도를 제어하는 미생물배양제어방법에 있어서 배양액의 용존산소농도가 설정치보다 저하했을 경우는 제1단계로서 교반기회전수를 올리며, 교반기회전수가 설정상한치로 되었을 경우는 제2단계로서 통기가스중의 산소분압을 올리고, 통기가스중의 산소분압이 설정상한치로 되었을 경우는 제3단계로서 통기량을 올리며, 반대로 배양액의 용존산소농도가 설정치보다 높을 경우는 제1단계로서 교반기 회전수를 내리며, 교반기회전수가 설정하한치로 되었을 경우는 제2단계로서 통기가스중의 산소분압을 내리고, 통기가스중의 산소분압이 설정하한치로 되었을 경우는 제 3단계로서 통기량을 내리는 것을 특징으로하는 미생물 배양제어방법.
8. 배양조의 압력측정수단, 배가스유량측정수단 및 배가스중의 탄산가스농도측정수단, 이들 각 수치에서, 배양조내의 탄산가스분압 및 미생물에 의한 탄산가스 생성량을 산출하며, 그것으로부터 균체량을 산출하는 수단, 그 수치로부터의 기질공급량의 결정수단, 상기 산출수단을 위한 수치설정수단 및 결정된 결과를 근거로 작동하는 기질공급량 조절수단의 조합으로 이루어진 것을 특징으로하는 미생물 배양제어장치.

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