CN111733198B - 一种提高辅酶i产量的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高辅酶I产量的发酵方法，包括如下步骤：S1、将酿酒酵母接种到培养基中，然后进行发酵，当发酵液的OD600值≥30时，补加糖液保持发酵液中的残糖浓度为2g/L，当酿酒酵母生长进入停止期后，停止补加糖液；S2、向停止期的发酵液中加入生物素和烟酸，继续发酵至辅酶I含量停止增长时，收集酿酒酵母，破壁得到含有辅酶I的破壁液即可。本发明选用合适的酿酒酵母菌种并配合合适的发酵工艺，大幅提高了辅酶I的产量。
Description
技术领域
本发明涉及辅酶I技术领域，尤其涉及一种提高辅酶I产量的发酵方法。
背景技术
辅酶I(NAD)，化学名为烟酰胺腺嘌呤二核甘酸或二磷酸烟苷，在哺乳动物 体内存在氧化型(NAD+)和还原型(NADH)两种状态，是人体氧化还原反应中重要的辅酶，参与细胞物质代谢、能量合成、细胞DNA修复等多种生理活动，对 机体免疫能力有重要作用。在健康状态下，人体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度 稳定，维持各项细胞正常功能。体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸浓度决定了细胞 衰老的过程和程度，浓度下降会加速细胞衰老的过程。
辅酶I主要存在于酵母细胞线粒体中，属于胞内酶。目前常通过从酵母细胞 中提取辅酶I的方法，来获得辅酶I，但是酵母中辅酶I的含量有限，提取辅酶 I的产量并不高，需要提供新的提高辅酶I产量的方法。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种提高辅酶I产量的发酵方 法，本发明选用合适的酿酒酵母菌种并配合合适的发酵工艺，大幅提高了辅酶I 的产量。
本发明提出的一种提高辅酶I产量的发酵方法，包括如下步骤：
S1、将酿酒酵母接种到培养基中，然后进行发酵，当发酵液的OD600值≥30 时，补加糖液保持发酵液中的残糖浓度为2g/L，当酿酒酵母生长进入停止期后， 停止补加糖液；
S2、向停止期的发酵液中加入生物素和烟酸，继续发酵至辅酶I含量停止增 长时，收集酿酒酵母，破壁得到含有辅酶I的破壁液即可。
优选地，在S1中，酿酒酵母为高糖型酿酒酵母。
上述高糖型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可以从市场购得，如烟台 马利酵母有限公司、安琪酵母股份有限公司；优选烟台马利酵母有限公司。
上述酿酒酵母可以直接接种到培养基中。
优选地，在S1中，接种量为5％。
上述接种量是指移入种子液的体积和接种后培养基体积的比例。
优选地，在S1中，培养基包含：葡萄糖60g/L；酪蛋白水解物15g/L；KH2PO411.17g/L；MgSO4·7H2O 5g/L；ZnCl2 0.01g/L；泛酸钙0.01g/L；维生素B1 0.1g/L； 肌醇0.1g/L；柠檬酸铁0.01g/L；尿素5g/L；硫酸铜2g/L；硫酸锰1g/L；消泡剂 0.2mL/L和水。
优选地，在S1中，接种参数为：接种温度为29.5-30.5℃、培养基PH＝5.2-5.6、 通风量为1m3/h、搅拌速度为175rpm、培养基溶氧标定DO值为100％、罐压为 0.05Mpa、CO2量为50％。
优选地，在S1中，整个发酵过程中，发酵温度为29.5-30.5℃、培养基 PH＝5.2-5.6、罐压为0.03-0.07Mpa、CO2量为49.95-50.05％，发酵液溶氧标定DO 值＞30％。
当发酵液溶氧标定DO值≤30％时，可以通过调节搅拌转速、通风量来控制 溶氧，保证溶氧标定DO值＞30％，当搅拌转速达到上限后，调整通风量来控制 溶氧。
优选地，在S1中，糖液包含：1Kg含量为60wt％的葡萄糖水溶液和9.6mL 的混合水溶液，其中，混合水溶液为浓度为0.2g/L的碘化钾和浓度为1g/L的氯 化钴的混合水溶液。
上述S1中，当发酵液的OD600值≥30时，检测发酵液中的残糖浓度，当残 糖浓度＜2g/L时，开始向发酵液中流动加入糖液，保持发酵液中的残糖浓度为 2g/L，在流动加入糖液的过程中，当发酵液中乙醇含量过高，发酵室内乙醇味道 浓时，或残糖浓度＞2g/L时，或CO2量不等于49.95-50.05％，发酵液溶氧标定 DO值≤30％时，则降低糖液的加入速度或降低糖液的添加量。
优选地，在S1中，当发酵液的OD600值为100时，先调节发酵液的pH＞5.43， 再补加糖液。
优选地，在S1中，当发酵液的OD600值＞200时，每隔2h检测一次OD600值，当OD600值停止增长时即为酿酒酵母生长进入停止期，停止补加糖液。
优选地，在S2中，每1L发酵液中加入0.5g生物素和6g烟酸。
优选地，在S2中，整个发酵过程中，发酵温度为29.5-30.5℃、培养基 PH＝5.2-5.6、罐压为0.03-0.07Mpa、CO2量为49.95-50.05％、通风量为0.8m3/h、 溶氧标定DO值＞30％。
优选地，在S1、S2中，用浓度为85g/L的磷酸水溶液或体积分数为12.5％ 的氨水调节发酵液的pH。
上述CO2量为发酵罐尾气中CO2的含量，可以通过发酵尾气分析技术实时 在线检测。
上述发酵过程中，可以添加适量体积分数为20％的消泡剂水溶液，来消除 发酵产生的泡沫。
上述糖液、磷酸水溶液、消泡剂水溶液均需湿热灭菌后，才能使用。
上述培养基需经121℃灭菌20min处理后，才能使用。
有益效果：
本发明不再从酵母中直接提取辅酶I，而是首次提出了通过发酵来提高酿酒 酵母中辅酶I含量的方法，并且通过选用合适的酿酒酵母菌种和合适的发酵工 艺，并对整个工艺参数和培养基进行筛选，选用适量的葡萄糖水溶液和碘化钾、氯化钴混合水溶液构成糖液，选用生物素和烟酸作为底物并控制其添加量，最 终获得合适的发酵工艺，使得发酵后的酿酒酵母经破壁处理后获得含有高浓度 辅酶I的破壁液；与发酵前的酿酒酵母相比，本发明的辅酶I产量是发酵前酿酒 酵母的近2倍。
附图说明
图1为对比例1得到的含辅酶I的破壁液的高效液相色谱图。
图2为实施例1得到的含辅酶I的破壁液的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
以下实施例1和对比例1中的酿酒酵母均为高糖型酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，购自烟台马利酵母有限公司。
实施例1
一种提高辅酶I产量的发酵方法，包括如下步骤：
S1、取培养基在发酵罐中121℃灭菌20min，然后将OD600值为8-10的酿酒 酵母接种到培养基中，其中，接种量为5％；接种参数为：接种温度为30℃、培 养基PH＝5.4、通风量为1m3/h、搅拌速度为175rpm、培养基溶氧标定DO值为 100％、罐压为0.05Mpa、CO2量为50％；培养基的配方为：葡萄糖60g/L；酪蛋 白水解物15g/L；KH2PO4 11.17g/L；MgSO4·7H2O 5g/L；ZnCl2 0.01g/L；泛酸 钙0.01g/L；维生素B1 0.1g/L；肌醇0.1g/L；柠檬酸铁0.01g/L；尿素5g/L；硫 酸铜2g/L；硫酸锰1g/L；消泡剂0.2mL/L和水；
然后进行发酵，整个发酵过程中，发酵温度为30℃、罐压为0.05Mpa、CO2量为50％，发酵液溶氧标定DO值＞30％；并且用体积分数为12.5％的氨水调节 发酵液pH＝5.4；
当发酵液的OD600值为30时，检测发酵液中的残糖浓度，当残糖浓度＜2g/L 时，开始向发酵液中流动加入糖液保持发酵液中的残糖浓度为2g/L，糖液的加 入速度为每升发酵液中每小时加入13g糖液；当发酵液的OD600值为60时，糖 液的加入速度为每升发酵液中每小时加入20g糖液，保持发酵液中的残糖浓度 为2g/L；当发酵液的OD600值为100时，先调节发酵液的pH＞5.43，再补加糖 液保持发酵液中的残糖浓度为2g/L；在流动加入糖液的过程中，当发酵液中乙 醇含量过高，发酵室内乙醇味道浓时，或残糖浓度＞2g/L时，则降低糖液的加 入速度或降低糖液的添加量；
当发酵液的OD600值＞200时，每隔2h检测一次OD600值，当OD600值停止 增长时即为酿酒酵母生长进入停止期，停止补加糖液；其中，糖液为：1Kg含 量为60wt％的葡萄糖水溶液和9.6mL的混合水溶液，其中，混合水溶液为浓度 为0.2g/L的碘化钾和浓度为1g/L的氯化钴的混合水溶液；
S2、向停止期的发酵液中加入生物素和烟酸，继续发酵，并每3h检测辅酶 I含量，直到辅酶I含量不再增长，结束发酵，放罐收集酿酒酵母液，离心酿酒 酵母菌体，破壁得到含有辅酶I的破壁液即可，其中，每1L发酵液中加入0.5g 生物素和6g烟酸；整个发酵过程中，发酵温度为30℃、罐压为0.05Mpa、CO2量为50％、通风量为0.8m3/h、溶氧标定DO值＞30％；并用浓度为85g/L磷酸 水溶液调节发酵液pH＝5.4。
对比例1
取高糖型酿酒酵母，不经发酵，直接进行破壁处理得到破壁液，其中，破 壁处理的方法与实施例1相同。
检测发酵前后辅酶I含量(辅酶I含量以每g干菌体中辅酶含量mg计算)， 结果如表1和图1-2所示：
图1为对比例1得到的含辅酶I的破壁液的高效液相色谱图；图2为实施例 1得到的含辅酶I的破壁液的高效液相色谱图。
表1发酵前后辅酶I产量数据对比结果
由表1和图1-2可以看出：与对比例1(未发酵高糖型酿酒酵母)相比，本 发明通过选用适宜的发酵工艺进行高糖型酿酒酵母发酵，使得实施例1中的高 糖型酿酒酵母的辅酶I产量是对比例1的近2倍。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本 发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护 范围之内。
Claims (4)
1.一种提高辅酶I产量的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将酿酒酵母接种到培养基中，然后进行发酵，当发酵液的OD600值≥30时，补加糖液保持发酵液中的残糖浓度为2g/L，当酿酒酵母生长进入停止期后，停止补加糖液；
S2、向停止期的发酵液中加入生物素和烟酸，继续发酵至辅酶I含量停止增长时，收集酿酒酵母，破壁得到含有辅酶I的破壁液即可；
在S1中，酿酒酵母为高糖型酿酒酵母；
在S1中，糖液包含：1Kg含量为60wt%的葡萄糖水溶液和9.6mL的混合水溶液，其中，混合水溶液为浓度为0.2g/L的碘化钾和浓度为1g/L的氯化钴的混合水溶液；
在S1中，培养基包含：葡萄糖60g/L；酪蛋白水解物15g/L；KH2PO4 11.17g/L；MgSO4·7H2O5g/L；ZnCl2 0.01g/L；泛酸钙0.01g/L；维生素B1 0.1g/L；肌醇0.1g/L；柠檬酸铁0.01g/L；尿素5g/L；硫酸铜2g/L；硫酸锰1g/L；消泡剂0.2mL/L和水；
在S1中，整个发酵过程中，发酵温度为30℃、培养基PH=5.4、罐压为0.05Mpa、CO2量为50%，发酵液溶氧标定DO值＞30%；
在S1中，当发酵液的OD600值为100时，先调节发酵液的pH＞5.43，再补加糖液；
在S1中，当发酵液的OD600值＞200时，每隔2h检测一次OD600值，当OD600值停止增长时即为酿酒酵母生长进入停止期，停止补加糖液；
当残糖浓度＜2g/L时，向发酵液中流动加入糖液保持发酵液中的残糖浓度为2g/L，糖液的加入速度为每升发酵液中每小时加入13g糖液；
当发酵液的OD600值为60时，糖液的加入速度为每升发酵液中每小时加入20g糖液，保持发酵液中的残糖浓度为2g/L；
当发酵液的OD600值为100时，先调节发酵液的pH＞5 .43，再补加糖液保持发酵液中的残糖浓度为2g/L；
在流动加入糖液的过程中，当发酵液中乙醇含量过高，发酵室内乙醇味道浓时，或残糖浓度＞2g/L时，则降低糖液的加入速度或降低糖液的添加量；
在S2中，每1L发酵液中加入0.5g生物素和6g烟酸；在S2中，整个发酵过程中，发酵温度为29.5-30.5℃、培养基PH=5.2-5.6、罐压为0.03-0.07Mpa、CO2量为49.95-50.05%、通风量为0.8m3/h、溶氧标定DO值＞30%。
2.根据权利要求1所述提高辅酶I产量的发酵方法，其特征在于，在S1中，接种量为5%。
3.根据权利要求1所述提高辅酶I产量的发酵方法，其特征在于，在S1中，接种参数为：接种温度为29.5-30.5℃、培养基PH=5.2-5.6、通风量为1m3/h、搅拌速度为175rpm、培养基溶氧标定DO值为100%、罐压为0.05Mpa、CO2量为50%。
4.根据权利要求1所述提高辅酶I产量的发酵方法，其特征在于，在S1、S2中，用浓度为85g/L的磷酸水溶液或体积分数为12.5%的氨水调节发酵液的pH。
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