CN102242178A - 一种2-酮基-l-古龙酸的制备方法 - Google Patents

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李荣杰
穆晓玲
符秀迪
李维理
李海燕
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Abstract

本发明涉及一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法。本发明采用氢氧化钙替代碳酸钠来控制发酵过程中的pH值，一方面可以避免高浓度产物抑制产酸，利于发酵反应进程，使发酵终点古龙酸的含量达105-110mg/ml，糖酸转化率为94-96％，提高产酸浓度8-10％；另一方面可降低工艺难度，操作简单，后提取容易，提高了设备利用率。

Description

一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法。
背景技术
目前国内生产古龙酸多采用二步发酵法，二步发酵法通常采用混合菌系进行发酵，这种混合菌系最为常用的两种菌一种是氧化葡萄糖酸杆菌(俗称小菌)，另一种是巨大芽孢杆菌(俗称大菌)，其中小菌为产酸菌，胞内分泌L-山梨糖脱氢酶可以将山梨糖转化成2-酮基-L-古龙酸，但是单独培养生长缓慢，产酸能力低；大菌不能产酸，但是它可以作为小菌的伴生菌，在发酵中起辅助作用，促进小菌的生长和产酸。研究证实，大菌胞内液和胞外液菌均可以促进小菌生长，缩短小菌生长的延迟期。
目前国内古龙酸生产过程中，多采用流加碳酸钠来控制调节pH，该反应的产物是可溶的古龙酸钠，在反应后期，随着反应的进行，古龙酸钠的浓度逐渐升高，容易对发酵反应形成产物抑制，从而降低反应产率。
为了解决上述问题，本发明提出在古龙酸生产过程中采用一种新的pH调节剂，一方面可以避免高浓度产物抑制产酸，利于发酵反应进程，使发酵终点产酸浓度能够提高8-10％，另一方面可降低工艺难度，提高设备利用率。
发明内容
本发明的目的是提供一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法。
根据上述生产方法的不足，本发明采用氢氧化钙替代碳酸钠调节发酵过程中的pH值，由于其反应产物为难溶的古龙酸钙，降低了高浓度产物对反应速度和进程的抑制，利于产酸。
本发明的技术方案为：在发酵过程中流加氢氧化钙控制pH值；所述氢氧化钙可选择液体或固体，优选质量浓度为20-50％的悬浮液；更优选质量浓度为30％的悬浮液。
为进一步提高生产效率，本发明人进行了大量的研究，优化了发酵过程参数，要求在发酵过程中将pH值控制为6.7-7.0；控制初始山梨糖浓度为20-25mg/ml，并在发酵过程中流加山梨糖，使发酵液中的山梨糖浓度控制在20-22mg/ml。
优选地，所述pH值为6.7-6.8。
其中，流加山梨糖可采用山梨糖糖液，其浓度可采用各种常用的浓度，优选的，所述山梨糖糖液的浓度为200mg/L。
另外，还通过控制反应温度控制反应进程，优选的，控制反应起始温度为29℃，中后期(即24-38小时之后)将温度升至30-31℃。
采用上述参数，发酵周期为44-48小时。
发酵过程可采用生产2-酮基-L-古龙酸常用的发酵液，如采用下述成分的营养液作为发酵液：玉米浆110g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，尿素10g/L。
有益效果：本发明在制备2-酮基-L-古龙酸的过程中，采用流加氢氧化钙来替代碳酸钠控制pH值，产物为难溶的古龙酸钙，降低了高浓度产物抑制，利于产酸。此发明方法在生产中成功运用于大生产。发酵终点产酸浓度提高8-10％，达到105-110mg/ml，糖酸转化率提高2-4％，达到94-96％；此外，流加氢氧化钙对后提取有利，提高了设备利用率，大大降低了能耗和物耗。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如无特别指明，本发明采用的发酵液为下述成分的营养液：玉米浆110g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，尿素10g/L，并添加适量的山梨糖(浓度控制在20～25mg/ml)构成；采用本领域常用的氧化葡萄糖酸杆菌(小菌)(购自菌种保藏中心，保藏号CGMCC1.110)和巨大芽孢杆菌(大菌)(购自菌种保藏中心，保藏号CMCC(B)63103)制备菌液。
菌液制备过程：
冻存管--摇瓶活化24h--大小菌分别分离(28℃培养小菌2天，大菌2-3天)--选菌落饱满，边缘整齐，偏大的小菌单菌落挑一满环涂布试管(28℃培养一天)--搭上大菌，选菌落饱满，边缘整齐，大小适中的大菌单菌落在已搭过小菌的试管上(28℃培养2天)--用无菌水将试管上的菌苔洗下接种子瓶(28℃，240r/min，培养24h)。
对照例
140m3发酵罐中初始装液量为30m3，控制初始山梨糖浓度为25mg/ml，接种量为30％(大菌和小菌混合种子液)，当残糖降至20mg/ml时，开始流加山梨糖糖液，糖液的浓度为200mg/L，流加过程控制糖含量为20-22mg/ml；同时，发酵过程中流加碳酸钠溶液控制pH在6.7-6.8。
发酵过程中，起始温度为29℃，30小时，温度升至30℃，36小时时，温度升至31℃。
发酵周期为46小时，发酵终体积为100m3。经检测，发酵液中古龙酸含量为90mg/ml，摩尔转化率为91％。
实施例1
140m3发酵罐中初始装液量为30m3，控制初始山梨糖浓度为25mg/ml，接种量为30％(大菌和小菌混合种子液)，当残糖降至20mg/ml时，开始流加山梨糖糖液，糖液的浓度为200mg/L，流加过程控制糖含量为20-22mg/ml；同时，发酵过程中流加氢氧化钙控制pH在6.7-6.8。
发酵过程中，起始温度为29℃，30小时，温度升至30℃，36小时时，温度升至31℃。
发酵周期为44小时，发酵终体积为100m3。经检测，发酵液中古龙酸含量为105.1mg/ml，摩尔转化率为94.5％。
实施例2
140m3发酵罐中初始装液量为35m3，控制初始山梨糖浓度为25mg/ml，接种量为30％(大菌和小菌混合种子液)，残糖降至20mg/ml时，开始流山梨糖糖液，糖液的浓度为200mg/L，流加过程控制山梨糖含量为20-22mg/ml；发酵过程中流加氢氧化钙控制pH在6.8-7.0。
发酵过程中，起始温度为29℃，24小时温度升至30℃，30小时温度升至31℃。
发酵周期为46小时，发酵终体积为106m3。经检测，发酵液中古龙酸含量为106mg/ml，摩尔转化率为94.79％。
实施例3
140m3发酵罐中初始装液量为35m3，初始山梨糖浓度为23mg/ml，接种量为30％(大菌和小菌混合种子液)，残糖降至20mg/ml时，开始流加山梨糖糖液，糖液的浓度为200mg/L，流加过程控制山梨糖糖含量为20-22mg/ml；发酵过程中流加氢氧化钙控制pH在6.7-6.8。
发酵起始温度为29℃，30小时温度升至30℃，36小时温度升至31℃，发酵周期为48小时，发酵终体积为108m3。
经检测，发酵液中古龙酸含量为107mg/ml，摩尔转化率为95.4％。
实施例4
140m3发酵罐中初始装液量为35m3，初始山梨糖糖浓度为25mg/ml，接种量为30％(大菌和小菌混合种子液)，残糖降至20mg/ml时，开始流加山梨糖糖液，糖液的浓度为200mg/L，流加过程控制糖含量为20-22mg/ml；发酵过程中流加氢氧化钙控制pH在6.7-7.0；30小时后控制在6.8-7.0。
发酵过程中，起始温度为29℃，30小时温度升至30℃，36小时温度升至31℃，发酵周期为48小时，发酵终体积为110m3。
经检测，发酵液中古龙酸含量为110mg/ml，摩尔转化率为96.01％。
实施例5
140m3发酵罐中初始装液量为35m3，初始山梨糖糖浓度为23mg/ml，接种量为30％(大菌和小菌混合种子液)，残糖降至22mg/ml时，开始流加山梨糖糖液，糖液的浓度为200mg/L，流加过程控制糖含量为20-22mg/ml；发酵过程中流加氢氧化钙控制pH在6.7-7.0，32小时后控制在6.8-7.0。
发酵过程中，起始温度为29℃，33小时温度升至30℃，38小时温度升至31℃，发酵周期为49小时，发酵终体积为110m3。
经检测，发酵液中古龙酸含量为106mg/ml，摩尔转化率为95.46％。

Claims (6)

1.一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法，其特征在于，发酵过程中流加氢氧化钙控制pH值。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵过程中，控制初始山梨糖浓度为20-25mg/ml。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，发酵过程中流加山梨糖，发酵液中山梨糖浓度控制在20-22mg/ml。
4.如权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，发酵过程中控制起始温度为29℃，24-38小时后将温度升至30-31℃。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述pH值为6.7-7.0。
6.如权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，所述pH值为6.7-6.8。
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