DD149873A3 - Verfahren zur steuerung des kultivierungsprozesses von mikroorganismen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft das Gebiet der mikrobiologischen Industrie, speziell Verfahren zur Steuerung und Regulierung von Prozessen der Kultivierung von Mikroorganismen. Es ist das Ziel der Erfindung, die Steuerung von Kultivierungsprozessen zu vereinfachen und den Zeitaufwand fuer die Ermittlung der Faktoren, die den Prozesz negativ beeinflussen, zu vermindern. Das Ziel wird erreicht durch ein Verfahren, mit dessen Hilfe das rasche Erkennen und eine beschleunigte Korrektur von Stoerungen im stabilen Prozesz der mikrobiellen Eiweiszsynthese moeglich wird. Es beruht auf dem Nachweis im Anstieg der Nitritkonzentration ueber eine festgesetzte Grenze hinaus.

Description

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Titel·:

Verfahren zur Steuerung des Kultivierungsprozesses von Mikroorganismen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der mikrobiologischen

Industrie, speziell Verfahren zur Steuerung und Regulierung von Prozessen der Kultivierung von Mikroorganismen»

Charakteristik -der bekannten technischen Lösungen

Es sind Verfahren zur Steuerung von Kultivierungsprozessen O nach der Biomassekonzentration (SU-US 302 363), nach, der Menge der aktiven Zellen (SU 365 373)> nach der Atmungsintensität, nach dem Alkoholgehalt des Abgases (DT-AS 1 OSO 043), nach der Temperatur des Fermentationsmediums (SU-US 506 611) und nach, der Menge des bei der Gärung gebildeten Kohlendioxids bekannt (SU-US 344 352).

Der Nachteil der genannten Verfahren besteht darin, daß bei Änderung des für die Steuerung verwendeten Prozeßparameters oder Stoffwechseiprodukte, z. B· bei Verminderung der Menge des entstehenden Kohlendioxids, zwar eine Störung des technologischen Systems angezeigt wird, aber zur Ermittlung der Ursachen alle prozeßtechnischen Kenngrößen kontrolliert werden müssen, was sehr zeitaufwendig ist*

Ziel der Erfindung

Der Zweck der Erfindung besteht darin, die Steuerung von Kultivierungsprozessen zu vereinfachen und den Zeitaufwand für die Ermittlung der Faktoren, die den Prozeß negativ be-

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einflussen, zu vermindern« . ·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, als Steuergröße ein leicht zu analysierendes Stoffwechselprodukt zu verwenden, das durch die Mikroorganismen "bei Abweichungen von den optimalen Prozeßbedingungen ausgeschieden wird und dessen Bildung mit der Änderung "bestimmter Prozeßparameter korreliert. Bei der Kultivierung von Mikroorganismen, z. B. von methanassimilierenden Bakterien, ist die in das Medium ausgeschiedene Nitritmenge geringer als 0,3 mg N/l, wenn die Ammonium-Stickstoff-Konzentration 20 - 80 mg N/l, die Durchflußrate nahe der kritischen Durchflußrate liegt und durch Einstellung entsprechender Partialdrucke die Sauerstoffkonzentration die Wachstumsrate bestimmt.

Es wurde festgestellt, daß bei inhibierenden Ammonnium-Stickstoff-Konzentrationen, limitierenden Konzentrationen der Kohlenstoff quelle und steigendem Limitationsgrad von Sauerstoff, die Nitritkonzentration im Fermentationsmedium über die für einen gegebenen Prozeß zulässige Norm ansteigt. Dabei kann der zunehmende Sauerstofflimitationsgrad entweder durch eine sinkende Durchflußrate oder sinkenden Sauerstoffpartialdruck bedingt sein.

Bei Ansteigen der Nitritkonzentration ist es erforderlich, die Konzentrationen von Stickstoff, Sauerstoff und der Kohlenstoff quelle, den Sauerstoffpartialdruck sowie die Durchflußrate der wäßrigen Nährlösung zu "bestimmen und Abweichungen von den Normwerten zu korrigieren.

Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß bei Abweichungen von den optimalen Prozeßbedingungen die Nitritkonzentration sofort ansteigt und eine Störung des Prozesses signalisiert wird, lange bevor diese Störung an einer Änderung anderer p^rozeßtechnischer Kenngrößen (z. B* bei Verminderung des Biomasseertrages) ersichtlich wird« Das entstehende Nitrit hat

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keinen negativen Einfluß auf das Wachstum der Mikroorganismen, solange nicht inhibierende Konzentrationen größer als 20 mg Nitritstickstoff/l erreicht werden.

Dieses Steuerverfahren kann "bei kontinuierlichen und diskontinuierlichen Fermentationsprozessen angewendet werden, wobei es ohne Bedeutung ist, ob die Kultivierung bei Normaldruck oder erhöhtem Systemdruck durchgeführt wird« Die Bestimmung der Nitritkonzentration erfolgt kolorimetrisch nach Diazotierung mit Sulfanilsäure und Kupplung mitOC-Naphthylamin in einem Reaktionsschritt.

Zur Herstellung des Nachweisreagens werden 2 g Sulfanilsäure in 400 ml 2 η Essigsäure und 0,4 g°c-Naphthylaminhydrochlorid unter Erwärmen in 80 ml Wasser gelöst, gemischt und mit 2 η Essigsäure zum Liter ergänzt. Kulturfiltrat und Reagens werden im Verhältnis 1 : 1 (V/V) gemischt, die rotviolette Färbung nach 10 Minuten im Spektralphotometer bei = 534 nm gemessen. Die Farbintensität wird mit der einer Sichkurve verglichen. Als'Testsubstanz dient wasserfreies Natriumnitrit. Der Nachweisbereich beträgt 0,03 bis 0,4 mg Nitrit-N/1.

Die Nitritbestimmung kann kontinuierlich nach dem Analysen-Prinzip unter Verwendung eines Spekol des VEB Carl Zeiss Jena mit Durchflußküvette erfolgen.

Beispiel 1

Der methanutilisierende Bakterienstamm Methylococcus capsulatus sp. wurde im kontinuierlichen Prozeß unter folgenden Bedingungen kultiviert: Temperatur: 40 ⁰C

pH : 5,6 Begasungsintensität: 40 1/lh ..vO Verhältnis Erdgas zu Luft: 1:3 Durchflußrate; . 0,25 h""^

Die Zusammensetzung der !Nährlösung war wie folgt: (für 1 g Biomasse)

KCl 0,025 g

MgSO₄ . 7H₂O 0,02 g

H₃PO₄ (SCf.ig) 0,09 g

FeSO₄ . 7H₂O 0,1 mg .

ZnSO₄ . 7H₂O 0,3 mg

HnSO₄ . 4H₂O 0,5 mg

CuSO₄ . 5H₂O 0,5 mg . · ;· .

HoBOo 0j3 mg

Ha₂MoO₄ . 2H₂O 0,045 mg

Die pH-Hegelung erfolgte mit einer 10%igen LTH₁₁OH-Losung, diese diente zugleich der Stickst01fversorgiing der Organismen« Unter diesen Prozeßbedingungen wurde im steady state eine Bio-Blassekonzentration von 10 g/l erreicht. Alle halben Stunden wurde der Nitritgehalt der Kulturflüssigkeit Tdestimrat. In der · 20. Kultivierungsstunde erhöhte sich die Nitritstickstoffkonzentration bis auf Werte von 2,5 mg U/l. Es wurde der Ammoniuiu-Stickst off gehalt der Kulturflüssigkeit sowie die Begasung überprüft. Die Analysen zeigten, daß die Ammonium-Stickstoffkonzentration 400 mg N/l betrug. Um diesen hohen Stickstoffgehalt des Eermentationsmediums zu vermindern, wurde die pH-Begelung auf eine 10;5ige NaOH-Lösung umgestellt. Each zwei Stunden lag der Ammonium~Stickstoffgehalt wieder innerhalb der optimalen Grenzen, die 1-Iitritkonzentration verringerte sich auf <0,3 mg N/l«

Beispiel 2

Die Kultivierung des methanutilisierenden Bakterienstammes Llethylococcus capsulatus sp. erfolgte wie im Beispiel 1 beschrieben. In der 47. Kultivierungsstunde stieg der Nitritgehalt der Kulturflüssigkeit auf 3 mg N/l an. Ss wurde der Ammonium-Stickstoffgehalt der Kulturflüssigkeit sowie die Begasung überprüft. Dabei wurde festgestellt, daß.

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die Stickstoffkonzentrat ion innerhalb der optimalen Grenzen lag, das Verhältnis von Erdgas : Luft betrug jedoch 1 : 7· Der Prozeß wurde durch Methan limitiert.

Nach Veränderung des Verhältnisses Erdgas : Luft auf 1:4 sank die Hitritkonzentration der,Kulturflüssigkeit auf 0,15 mg N/1.

Beispiel 3

Methanutilisierende Bakterien vom Stamme Methylococcus capsulatus sp. wurden im diskontinuierlichen Prozeß unter sonst gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 kultiviert.

Die Zugabe der Nährsalze erfolgte in Form eines Konzentrates stufenweise.

Die Zelldichte wuchs exponentiell auf 9 S Trockensubstanz/1 an, ohne daß ein Anstieg des Nitritgehaltes zu verzeichnen war. Mit einer v/eiteren Zunahme der Zelldichte stieg auch der Nitritgehalt auf Werte -y-1 mg N/l an. Der Ammonium-Stickstoff gehalt der Kulturflüssigkeit wurde überprüft und innerhalb der Norm befunden. Durch Erhöhung des Gaseintrags sank der Nitritgehalt auf 4.0,3 mg N/l ^a"b· Der aus einer Wachstumskurve nur ungenau bestimmbare Zeitpunkt des Beginns öer Gaslimitation konnte so mit hoher Genauigkeit bestimmt werden·

Claims (3)

-b-

1« Verfahren zur Steuerung des Kultivierungsprozesses von-Mikroorganismen bei konstanter Temperatur und konstantem . pH-Wert, kontinuierlicher Belüftung mit einer Sauerstoffquelle und Durchmischung unter Zufuhr einer flüssigen oder gasförmigen Kohlenstoffquelle in einer wäßrigen -Nährsalzlösung, nach einem gebildeten Stoffwechseiprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß mit dem Ziel der Vereinfachung der Steuerung und Verkürzung der Zeit zur Ermittlung der Faktoren, die die Führung des Prozesses der Kultivierung negativ beeinflussen, die Steuerung des Prozesses nach der Konzentration der gebildeten Nitrite in der Kulturflüssigkeit so durchgeführt wird, daß bei Ansteigen der Konzentration der Nitrite über, die für einen gegebenen Prozeß zulässige Norm die Konsentration von Stickstoff in der Kulturflüssigkeit, die Konzentration der Kohlenstoffquelle und des Sauerstoffs in der Kulturflüssigkeit oder im Abgas und die Durchflußrate der wäßrigen Nährsalzlösung im Falle der kontinuierlichen Fermentation, bestimmt werden und sie auf den für den gegebenen Kultivierungsprozeß optimalen Wert eingestellt wordene

2. Verfahren zur Steuerung gemäß Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die'optimalen Parameter des Kultivierungsprozesses verschiedener Mikroorganismen in Abhängigkeit ihrer für die normale Entwicklung notwendigen Verbrauchswerte für Stickstoff, Kohlenstoff, Sauerstoff und ihrer Wachstumsgeschwindigkeit einstellte

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3· Verfahren zur Steuerung gemäß Punkt 2, dadurch, gekennzeichnet, daß man methanutilisierende Bakterien kultiviert, für die die optimalen Bedingungen sind: Gehalt in der Kulturflüssigkeit an Ammonium-Stickstoff = 20 bis 80 mg/1; < 0,3 mg N/l, Durchflußrate der wäßrigen Nährsalzlösung nahe der kritischen Durchflußrate, Limitation des Prozesses durch Sauerstoff· .