DD224867A1 - Verfahren zur substratlimitierenden steuerung kontinuierlicher kulturen vom turbidostat-typ - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steuerung kontinuierlicher Kulturen von Mikroorganismen und anderen Zellen fuer biotechnische Verfahren zur Stoffwandlung mit Hilfe wachsender Zellen und fuer die Selektion von Hochleistungsstaemmen fuer solche Verfahren. Die Erfindung bezweckt, die guenstigen Eigenschaften von Chemostat- und Turbidostatkulturen zur Erzielung hoher Raum-Zeit-Ausbeuten bei effektivster Substratausnutzung so zu vereinigen, dass die Instabilitaeten des Chemostaten bei hohen Wachstumsraten und des Turbidostaten bei Substratlimitation umgangen werden. Das Wesen der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass in einer nach einem der bekannten Turbidostatprinzipien geregelten kontinuierlichen Kultur mindestens ein wachstumsessentieller Naehrstoff nicht in der ueber die Regelung zufliessenden Naehrloesung enthalten ist, der Kultur gesondert mit konstanter Geschwindigkeit zugefuehrt und praktisch vollstaendig verbraucht wird. Durch die Kombination der Selektionswirkungen der beiden bekannten Kultivierungsverfahren bewirkt die Steuerung nach dem erfindungsgemaessen Verfahren bei C-Limitation eine Autoselektion des jeweils effektivsten Stammes fuer eine Biomasseproduktion und bei anderer Limitation das Verbleiben der leistungsfaehigsten Produktbildner in der Kultur.

Description

Verfahren zur substratlimitierenden Steuerung kontinuierlicher Kulturen vom Turbidostat-Typ

Anwendungsgebiet der Erfindung

Verfahren zur substratlimitierenden Steuerung kontinuierlicher Kulturen vom Turbidostat-Typ für biotechnische Stoff-Wandlungsprozesse mit Hilfe wachsender Zellen und für die Modellierung industrieller Prozeßführungen "bei der Verfahrensentwicklung

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Kontinuierliche Verfahren werden für die Produktion von mikrobiellem Eiweiß wie auch für die biotechnische Gewinnung organischer Substanzen wegen der besseren Auslastung der Anlagen und dem günstigen Arbeitsablauf bevorzugt, wenn die erwünschten Leistungen von stabilen, wachsenden Zellpopulationen erbracht werden können. 7/achstum und Stoff wechseile istungen von Mikroorganismen hängen in starkem Maße von den Kultivierungsbedingungen ab, wobei die Wirkung einzelner Faktoren dieser Kultivierungsbedingungen von der Größe anderer zugehöriger Faktoren abhängen kann.

iur die Auswahl von Mikroorganismen für bestimmte Produktionsverfahren ergibt sich daraus folgendes Problem: 7/erden die Untersuchungen im Labor bei Kultivierungsbedingungen durchgeführt, die von denen des technischen Verfahrens

abweichen, so kann ein Organismus ausgewählt werden, der zwar unter den Laborbedingungen, aber nicht im industriellen Prozeß optimale Leistungen zeigt, während ein anderer Stamm, der unter den Bedingungen des technischen Yerfahrens am besten geeignet ist, unter Umständen im Laborversuch nient als solcher ernannt und daher nicht der kleintechnischen Erprobung zugeführt wird·

Eine bevorzugte Methode bei der Yerfahr ens entwicklung für biotechnische 7erfahren zur Hutzung wachsender Zellen besteht darin, die dafür benötigten Hochleistungsstämme durch Autoselektion in kontinuierlichen Kulturen im Labormaßstab zu gewinnen.

Da in jeder kontinuierlichen Kultur Selektionsprozesse ablaufen, deren Richtung und Wirkung maßgeblich von dem für die Prozeßführung gewählten Steuerungsprinzip abhängt, sind nicht selten leistungsmindemde Veränderungen des Yerhal-· tens der Zellpopulation bei der Überführung eines Kochleistuhgsstammes vom Labormaßstab zum Industrieverfahren zu beobachten.

Die im Labormaßstab üblichen Yerf ahren zur kontinuierlichen Kultur sind Ghemostate und verschiedene, nach dem Turbidostatprinzip geregelte Kulturen wie z.B. der pH-Auxostat (pH-Stat). In Chemostatkulturen bewirkt der Selectionsdruck die Auslese desjenigen Stammes, der ein limitierendes Substrat s-r bei einer vorgegebenen Wachstumsgescnwindigkeit am besten ausnutzen kann. Diese Wachstumsgeschwindigjseit liegt stets deutlicn unterhalb der von dem jeweiligen Mikroorganismus maximal erreichbaren. Es wird also derjenige Stamm ausgelesen, der diese submaxi τη, ale Wachstumsrate bei der geringsten Restkonzentration s des limitierenden 'Substrats in der KulturflüssigJseit erreicht. Sine verbesserte Raum-Zeit-Ausbeute an Biomasse wird nach diesem Selektionsverfahren durch Umwandlung eines größeren Anteils des limitierenden Substrats in Biomasse erreicnt, wobei die vom jeweiligen Mikroorganismus erreichbare maximale spezifische Wachstumsrate keinen Einfluß auf das Ergebnis der Selektion nat.

In allen Kulturen vom Turbidostat-Typ müssen sämtliche im iTährmedium enthaltenen wachstumsessentiellen Komponenten im Überschuß vorhanden sein, andernfalls tritt in diesen Kulturen Wachstumsstillstand ein. Der Selektionsdruck in diesen Kulturen bewirkt die Auslese desjenigen Stammes, der unter den gegebenen Bedingungen die höchste spezifische Wachstumsrate zeigt. Hierbei wird eine verbesserte Raum-Zeit-Ausbeute durch erhöhte maximale spezifische Wachstumsrate erreicht, wobei kein Selektionsdruck in Richtung auf günstige Substratausnutzung wirkt.

Die Bildung von Produkten, wie z.B. Aminosäuren, erfordert eine zusätzliche StoffWechselleistung der Zellen, so daß Stämme mit hoher Produktausscheidung gegenüber Stämmen mit kleinerer Produktbildungsrate meist weniger konkurrenzfähig sind. .Kontinuierliche .Verfahren zur Produktgewinnung sind daher mit dem Risiko behaftet, daß z.B. durch auftretende Revertanten oder Infektion mit dem Wildstamm der Produktionsstamm durch einen weniger leistungsfähigen Stamm aus der Kultur verdrängt wird. Ss wurden daher verschiedene Verfahren entwickelt, die eine stabile kontinuierliche Produkt gewinnung ermöglichen. Diese beruhen vorwiegend auf der Züchtung von produktbildenden Stämmen, die gleichzeitig eine Resistenz gegenüber einer wachstumshemmenden Substanz auf weisen« Diese Substanz muß dann, der Kultur ständig zugeführt werden, wodurch zusätzliche Kosten und mitunter Probleme bei der Reinigung des Produktes von dieser Substanz auftreten und Kompromisse hinsichtlich der Leistungsfähigkeit des Stammes (Raum-Zeit-Ausbeute der Produktbildung) nötig sind«

Im industriellen Verfahren-werden· die Kultivierungsbedingungen so gewählt, daß das Produkt aus spezifischer Wachstumsrate und Biomassekonzentration bei der effektivsten Nutzung der teuersten Substrate einen Maximalwert erreicht und weitere spezifische Randbedingungen erfüllt werden. Die beiden zur Wahl stehenden Labormethoden zur kontinuierlicnen Kultur erlauben jedoch jeweils nur die „Selektion nach einem dieser beiden 3ffektivitätskriterien.

Literatur

Petschurkin, N. S., Terskov, I. A. "Autoselektionsprozesse in kontinuierlichen Kulturen von Mikroorganismen" (russ.), Nauka, Nowosibirsk, 1973

Martin, G. A., Hempfling, W.. P. "A metnod for the Regulation of Microbial Population Density during Continuous Culture at'High Growth Rates", Arch. Microbioi. 107, 41, (1976)

Oltman, L. F., et al. "Modification of the pH-Auxostat Culture Method for the Mass Cultivation of Bacteria", Bioteehnol. Bioeng· 20, 921 (1978)

Ziel der Erfindung;

Ss ist das Ziel der Erfindung, das Risiko bei der überführung von im Labor isolierten Produktions stammen durch Änderung des Steuerprinzips der im Labor- und Technikumsmaßstab für die Selektion genutzten kontinuierlichen Kulturen zu senken und gleichzeitig zur Verkürzung der Entwicklungszeit von biotechnischen Verfahren beizutragen, indem mehrere technisch wichtige Selektionskriterien bei einem Selek— tionsschritt zur Wirkung gebracht werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung;

Durch die Erfindung werden die in Chemostaten und Turbidostatkultüren jeweils nur'einzeln realisierten technisch günstigen Selektionswirkungen so miteinander vereinigt, daß durch Auto selektion in der erfindungsgemäßen iJiontinuierli-' chen Kultur diejenigen Stämme'ausgelesen werden, deren Eigenschaften dem komplexen Optimalitätskriterium für technische Verfahren, einer hohen Raum-Zeit-Ausbeute bei effektiver Nutzung ausgewählter Nährstoffe, am besten entsprechen, wobei in bestimmten Fällen eine Verknüpfung mit weiteren technisch-ökonomisch günstigen Selektionswirkungen möglich ist.

Das Wesen der Erfindung bestent darin, eine nach dem .üblichen Turbidostatprinzip geregelte kontinuierliche Kultur, bei der sich die Durchflußrate D der Nährlösung auf den Wert der spezifischen Wachstums rate μ der 3iomasse iia Permentor einstellt, dahingehend zu verändern, daß mindestens einer der wachstumsessentiellen oder wachstumsfördernden Nährstoffe (z. B. die C-Quelle) nicht in der über die Regelung gesteuert zufließenden Nährlösung enthalten ist, sondern getrennt von dieser, der Kultur mit konstanter Geschwindigkeit zugeführt wird. Die Biomassekonzentration wird nach dem für die jeweilige Form der Turbidostatkultur üblicnen Verfahren.auf einen bestimmten Wert χ eingestellt· Das Verhältnis der Geschwindigkeit des gesonderten Substratzuflusses zu der Biomassen onz en tr ation s: wird vorzugsweise so gewählt, daß bei der zu erwartenden Verdünnungsrate D das gesondert zugefünrte Substrat praktisch vollständig verbraucht wird und die im Kulturmedium verbleibende Rest-Konzentration ir die ^/achstumsgescnwindigkeit der Kultur limitiert. Bei dieser Porm. der Substratlimitation von Turbidostat-Kultüren tritt kein Wachstumsstillstand auf, 'da durch die kontinuierliche Zufuhr des limitierenden Substrates stets nach einer gewissen, von der spezifischen Wachstumsrate und der Biomassekonzentration abhängigen Zeit derjenige Biomassezuwacüs erreicht wird, bei dem die Regelung eine weitere Zugabe von Nährlösung zur Kultur und eine entsprechende Verdünnung derselben auslöst«

Damit bleibt der für Turbidostate charakteristische Selektionsmechanismus erhalten, bei dem die Seilen desjenigen Stammes in der Kultur verbleiben, die unter den gegebenen Bedingungen die nöcaste spezifische Wachstumsrate μ aufweisen«

Zu den Bedingungen, die den Wert μ stark beeinflussen, gehört bei dieser Kultur (im Unterschied au üblichen (Pur— bidostaten) die Konzentration i- des limitierenden Substrates S-J- in der Suspension, so daß der Selektionsdruck diejenigen Zellen begünstigt, die bei kleinen Konzentrationen

Sx hohe spezifische Wachstumsraten erreichen. Die Konzentration s^ im Fließgleichgewicht in dieser Kultur ergibt sich, aus folgender Bilanz

^T. (1)

Dabei "bedeuten sA-r die Konzentration des gesondert zugeführten Substrates, D¹ das Verhältnis 5"/T, wobei F¹ die Geschwindigkeit des konstanten Zuflusses und T das Kulturvolumen ist. Y^ ist die Menge Biomasse, die pro Mengeneinheit an verbrauchtem limitierendem Substrat gebildet wird. Steigen ja und D vorübergehend über den Fließgleichgewichtswert an, dann steigt die Geschwindigkeit des Substratverbrauches μ · 2/Xr und der Substratabführung aus der Kultur D · s. Bei der gleichbleibenden Zuführungsgescnwindigkeit D · Srvr für das limitierende Substrat muß damit die Gleichgewichtskonzentration St sinken, wodurch im Bereich limitierender Konzentrationen die spezifische Wachstumsrate p. sinkt und damit auch die Yerdünnungsrate D, Sin Stamm kann demnach eine umso höhere spezifische ?iachs— tumsrate erreichen, je mehr Biomasse er aus der gleichen Menge des limitierenden Substrates bildet (kleinere Ter— brauchsgeschwindigkeit) und je kleiner die Restkonzentration St ist, die er für das Wacnstum benötigt (geringere Substratabführung D · s)·

Der für technische Verfahren wesentliche effektive Ausbeutekoeffizient Tt₀» der die Menge. Biomasse angibt, die pro Mengeneinheit an zugeführtem. Substrat gebildet wird, errechnet sicn in der Turbidostatkultur mit konstantem Zufluß von St ZU

(0^s)

Wenn also die spezifische Wachstumsrate p. der Kultur durch kleines s_T auf einen Wert begrenzt ist, der kleiner als der -Wert für unlimitiertes Wacnstum unter sonst gleichen

Kultivierungsbedingungen ist, und sich die Kultur* bei vorgewähltem 5 und si-r · D· auf den unter diesen Bedingungen maximal möglicnen Wert von μ = D einstellt, erreicht Y,. ebenfalls einen Maximalwert, Damit wirkt der Selections— druck in dieser Form der kontinuierlichen Kultur so, daß diejenigen Zellen bevorzugt sind und bei einer Autoselek— tion in der Kultur verbleiben, die

a) bei der sich einstellenden Konzentration sV des limitierenden Substrates die höcnste spezifische TJacnstumsrate p. haben,

b) die vorgegebene Biomassekonzentration χ bei geringerem Verbrauch an dem limitierenden Substrat s-r, also mit besserer Ausbeute erreicnen und

c) die höchste Raum-Zeit-Ausbeute an Biomasse bei der gegebenen Substratzuf'ührungsgesch.windigkeit liefern.

Damit sind die in Chemostaten und Turbidostaten jeweils nur einzeln wirkenden Selektionskriterien in der erfin— dungsgemäßen üOrrn der kontinuierlichen Kultur gleichzeitig wirksam.

Wachstumslimitation durch Substratmangel kann zu Verschiebungen des 31offwechseIgIeiengewients und dadurch zur Überproduktion und Ausscheidung bestimmter Zwischenprodukte wie z.B. organische Säuren, Aminosäuren u.a. führen* In den üblichen Chemostatkulturen mit einer solchen Limitation begünstigt der Selektionsdruck die Zellen, die die vorgegebene spezifiscne Wachstumsrate bei der kleinsten Restkonzentration Ί-_ erreichen, wobei die Produktkonzentration nur insofern selektionswirksam werden kann, als sie die Abhängigkeit p. - f (s_T) beeinflußt. Eine hohe Froduktbildungs— rate kann im Chemostaten für einen Stamm, dann ein Selektionsvorteil sein, wenn dieses Produkt das Wacnstum konkurrierender Stämme hemmt. In Kulturen mit Turbiaostatregelung ist SBiJi gegenüber größeren Schwankungen stabiles FIießgleichgev/ient bei wachstumslimitierender Konzentration eines Nährstoffes erreichbar.

Beim Turbidostaten mit konstantem Zulauf von mindestens einer wachstumsessentiellen oder wachstumsfördernden Komponente des iTährmediums, die meist nicht die C-Quelle ist, kann eine hohe Produktbildungsrate unter bestimmten Bedingungen einen direkten Selektionsvorteil bedeuten. Für welche Produkte und welches limitierende Substrat das zutrifft, hängt von der Art des benutzten Turbidostatverfahrens ab. So wird z.B. der BiomasseZuwachs im pH-Auzostaten anhand der Menge ausgeschiedener H⁺-Ionen gemessen. Bezeichnet man mit BG die Menge H⁺-Ionen, die zur Ansäuerung von 11 des zufließenden Hährlösungsgemisches auf den jeweiligen Statier-pH-Wert benötigt wird, dann ist die Biomasse-Konzentration im steady state χ = BC · IVt. Ϊττ beil -Π.

zeichnet die Menge Biomasse, bei deren Heubildung 1 mMol H⁺-Ionen ausgeschieden werden. Setzt man diesen für den pH-Ausostaten spezifischen Ausdruck für Ξ in (2) ein, dann ist

D · BC · Xr_T ¹LC,. (3)

Dementsprechend können bei vorgegebenen ¥/erten von sA-r * D' und BC aus einer Population von Zellen diejenigen eine höhere spezifische 7/achstumsrate und Yerdünnungsrate D erreichen, die einen kleineren I^-Wert und/oder einen höheren I-r -Wert aufweisen und besitzen damit einen direkt Jue

wirksamen Selektionsvorteil.

Die~H⁺-3?reisetzung wachsender Zellen setzt sich zusammen aus den im Zusammenhang mit der. bei einer ΗΈΪ-Aufnähme frei werdenden H⁺-Ionen (5-6 mMol H⁺ pro Gramm Hefetrockensubstanz bei 2THt als einziger N-Quelle), einem wesentlicn kleineren Anteil aus dem H⁺/K⁺-Austausch sowie H⁺-Ionen aus organischen Säuren, die bei dem Statier-pH-Wert der Kultur in dissoziierter Form vorliegen.

Bei C-Limitation und Tat als einziger N-Quelie variier bei Hefen vorwiegend mit dem Stickstoffgehalt der Trocken-

substanz. Bei hohem C—Angebot und Wachstumslimitation durch mindestens eine andere Komponente der Nährlösung können z.B. organische Säuren in größerer Menge ausgeschieden werden. Wenn diese im Kulturmedium dissoziieren, bewirkt die Säureausscheidung einen verringerten Υτ,-Wert und damit einen Selektionsvorteil für den Stamm mit der höchsten Säureausscheidungsgeschwindigkeit. Damit kann dieses Kultivierungsverfahren zur Autoselektion von Säureproduzenten und zur Stabilisierung einer säureproduaierenden kontinuierlichen Kultur dienen. Der gleiche Mechanismus bewirkt im. pH-Auzostaten mit konstantem, limitierendem Zufluß einen Selektionsvorteil für alle die Produktbildungsprozesse, die mit einer Freisetzung von H⁺-Ionen im Kulturmedium verknüpft sind.

In anderen durch konstanten Zufluß limitierten Auzostaten entstehen Selektionsvorteile für Produktbildner je nach der wachstumsproportionalen Größe, die zur Regelung der Durchflußrate der Kultur benutzt wird.

AusführungsbeisDiele Beispiel A

Selektion eines HefeStammes für die mikrobielle Siweißproduktion

Zur Lösung der Aul'gäbe, aus einer Gruppe von aussichtsreich erscheinenden Hefestämmen den Stamm (oder die stabile Mischpopulation) aufzufinden, der unter bestimmten (technisch—technologisch wünschenswerten) Kultivierungsbedingungen die höchste Raum-Zeit-Ausbeute an rohproteinreicher Biomasse bei möglichst effektiver nutzung der G-Quelle und des Sauerstoffs erreicht, verfährt man wie folgt:

Für die Lösung der Aufgabe wird ein pH-Ausostat eingesetzt, bei dem die C-^uelle mit konstanter Geschwindigkeit zufließt. Ist HE* -die einzige IT-Quells, dann ist T₃-vorwiegend durch die UHj-Aufnähme pro Gra.TP.TH IG bestimmt,

wobei der Selektionsvorteil bei kleinem Y.,,, d.h. hohem Ronproteingenalt der Biomasse auftritt. Die Zugabegeschwindigkeit der G—Quelle wird entsprechend der Bedingung

jxjj 'max H Le

festgelegt, wobei ^_βχ <iie maximale spezifische Wachstumsrate ohne C—Limitation bei den gewählten Kultivierungsbedingungen ist. BG wird ausgehend von der Produktivität des Fermentors CC^-Sintragsleistrung) so gewählt, daß im Fermentor ein dem technischen Terfahren entsprechender Sauerstofi'partialdruck erwartet oder mittels p0p-3tatierung eingestellt werden kann«

Mit pOp-Statierung verbleiben nach ausreichend langer kontinuierlicher Kultivierung (Dauer siehe Diagramme nach Petschurkin u. Terskov, 1973) die Zellen im Fermentor, die bei den vorgegebenen Bedingungen den maximalen Wert für D

D = -*£ ; üi (3a)

BG . X_K

erreichen» Das sind diejenigen Zellen, die je Menge zugeführter G-Quelle die höchste Raum-Zeit-Ausbeute an Biomasse mit dem kleinsten X^-Wert, d· h. bei hoher H⁺-Freisetzung und ΗΞί-Aufnähme liefern.

Wird der pC^-Wert nicht stat±ert, so sinkt er bei ausreichend hoher Biomassekonzentration auf einen Wert, ab, der ebenfalls limitierend auf die spezifiscne Wachstumsrate wirkt. Bs entsteht eine Doppellimitation und ein zusätzlicher Selektionsvorteil für die Zellen, die bei der herrschenden G—Limitation bei dem kleinsten sich einstellenden pOp-Wert die höchste spezifische Wachstumsrate aufweisen, Ss wird 'daner für die oben genannte Aufgabe vorzugsweise unter Op-Limitation ohne pOp-Statierung selektioniert.

Beispiel B

Produktion einer organischen Säure in kontinuierlicher Kultur

In Vorversuchen, z.B. mit Hilfe des eri" in dungs gemäß en Kultivierungsverfahrens, ?;erden das oder die limitierenden Substrate und der günstigste Stamm für eine gewünschte Säureproduktion mit Hilfe wachsender Zellen in sonst üblicher IJeise ermittelt. Als limitierendes, mit konstanter Geschwindigkeit zufließendes Substrat wird vorzugsweise nicht die C-Quelle, sondern beispielsweise die N-Quelle, eventuell in Kombination mit beispielsweise K⁺ oder Phosphat gewählt. Die Kultivierungsbedingungen können nach einem für kontinuierliche Kulturen üblichen Verfahren optimiert werden.

Dabei sind, soweit möglich, solche Kultivierungsbedingungen zu, wählen, die auch im technischen Prozeß eingehalten werden können.

Ss besteht dann die Aufgabe, den technischen Prozeß unter diesen Bedingungen nach dem Regelungsprinzip des pH-Auxostaten mit konstantem, das Wachstum limitierenden Zufluß der ausgewählten Komponenten durchzuführen und auf diese Weise die vorn beschriebene Selektionswirkung zugunsten der effektivsten Produktbildner zu reproduzieren. Zur Lösung der Aufgabe, für die Produktion einer organischen Säure in einem kontinuierlichen Verfahren solche Bedingungen aufzufinden, unter denen der Produktionsstamm einen Selektionsvorteil gegenüber ähnlichen Stämmen mit geringerer Säureproduktionsleistung besitzt und unter denen nur solcne Mutanten, Severtanten oder andere vom ursprünglichen Produktionsstamm abweichenden Formen den Produktionsstamm aus der Kultur verdrängen können, die eine höhere Säureproduktionsleistung als dieser aufweisen, wird vorzugsweise ein pH-Auxostat mit konstantem Zufluß der ausgewählten limitierenden Komponenten des Nährmediums verwendet.

Claims (1)

1. Srfindungsanspruch

   "Verfahren zur substratlimitierenden Steuerung kontinuierlicher Kulturen vom Turbidostat-Typ für biotechnische Stoffwandlungsprozesse mit Hilfe wachsender Zellen und für die Modellierung industrieller Prozeßführungen "bei der Verfahrensentwicklung., durch das in der kontinuierlichen Kultur Selektionsbedingungen entstehen, unter denen diejenigen Zellen in der Kultur einen Selektionsvorteil haben, die einem komplexen Optimalitätskriterium für die industrielle Nutzung, vorzugsweise zur Biomasseproduktion und zur Produktbildung, am besten entsprechen, gekennzeichnet dadurch, daß in einer beliebigen I?orm einer nach dem Turbido— statprinzip geregelten kontinuierlichen Kultur mindestens eine der wachstumsessentiellen oder wachstumsfördernden Komponenten der üblichen nährlösung, wie z.B. die C-Quelle oder ein Yitamin, nicht in der über die Regelung zufließenden nährlösung enthalten ist, sondern getrennt von dieser der Kultur mit einer konstanten Geschwindigkeit zugeführt wird, wobei die Biomassekonzentration nach dem bekannten Prinzip für die geweilige Form der Turbidostatkultur auf einen solchen Wert eingestellt wird, daß bei der zu erwartenden Yerbrauchsgeschwiadigkeit der gesondert zugeführten Komponenten eine praktisch vollständige Futzung derselben und eine Senkung der spezifischen Wachstumsrate μ auf einen Wert unteriialb von P^₃₃. infolge eines relativen Mangels an der oder den gesondert zugeführten Komponenten der nährlösung: auftritt·