DD248031A3 - Verfahren zur pruefung der degenerationsgeschwindigkeit von antibiotikumbildenden selektanten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung dient als eine Methode der Optimierung von Produktbildungsverfahren in der technischen Mikrobiologie. Ziel der Erfindung ist die Beschreibung eines Verfahrens, das eine Langzeitpruefung der Stabilitaet einer Biosyntheseleistung von mycelbildenden Bakterien und Pilzen unter kontaminationsfreien Bedingungen mit Mediumselementen, die dem technischen Medium relevant sind, ermoeglicht. Erfindungsgemaess wird diese Aufgabe durch Kombination des bekannten Verfahrens zur kontinuierlichen Kultivierung von Mikroorganismen in Chemostaten und einer Mediumskombination, die den oekonomisch begruendeten Produktionsmedien adaequat ist in Verbindung mit einer maximalen Scherkraftbelastung, die nicht den Zelltod zur Folge hat, geloest.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prüfung der Degenerationsgeschwindigkeit von mycelbildenden Antibiotikumproduzenten in Abhängigkeit der Anzahl der Massenverdopplungen der Biomasse. Die Erfindung dient als eine Methode der Optimierung von Produktbildungsverfahren in der technischen Mikrobiologie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß die Stabilität des Geno- und Phänotyps von mycelbildenden Mikroorganismen, die für Fermentationsprozesse zur Produktgewinnung eingesetzt werden, einer ständigen Prüfung bedarf. Erleichtert wird diese· Prüfung bei solchen produktbildenden Mikroorganismen, deren maximale Biosynthese mit der Ausbildung von morphologischen Markern korreliert. In diesem Fall kann in herkömmlicher Weise die Prüfung der Stabilität der Biosynthese der verwendeten Mikroorganismen mit der Auswertung von vorher angelegten Oberflächenkulturen erfolgen. Die überwiegende Zahl dermikrobiellen Produktbildner erfordert jedoch aufwendige, zu den Fermentationen parallel laufende Prüfverfahren in Schüttelkolben oder Kleinfermentern, um nach deren analytischer Auswertung die richtige Wahl eines geeigneten Stammes für die Hochleistungsfermentation abzusichern.

Für die genotypische Optimierung mit klassischen Mutations- und Selektionsmethoden werden chemisch definierte oder komplexe Medien mit Streßfaktoren verwendet, die im Vergleich zu den ökonomisch begründeten Fermentationsmedien Alternativmedien darstellen. Entscheidend für die Auswahl von mit bekannten Methoden geprüften mikrobiellen Produzenten ist jedoch auch die Stabilität der Biosynthesekapazität in den ökonomisch begründeten Fermentationsmedien unter Scherkraftbelastung. Neben den emersen Stammerhaltungspassagen sind ca. 30 Massenverdopplungen der Biomasse bis zum Zeitpunkt einer produktinduzierenden Substratlimitation im Großfermenter erforderlich. Während dieser Wachstumsphasen in den Anzuchtstufen und in der abschließenden Großfermenterstufe sollen keine Subpopulationen ohne oder mit geminderter Produktbildung auftreten, da dieser unproduktive Biomasseanteil für das Wachstum und den Erhaltungsstoffwechsel unökonomisch Substrate verbraucht.

Die Identifizierung dieser mikrobiellen Kommensalen, die bis zu einem Anteil von 20% einer Gesamtpopulation während eines mikrobiellen Fermentationszyklus anwachsen können, erfolgt durch Rückisolationen auf geeigneten Emersmedien. Die experimentellen Ergebnisse für die Wertung dieses Kriteriums sind erst nach dem Einsau einer mikrobiellen Selektante in den Produktionsfermentern zugänglich.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, das es ermöglicht, eine Langzeitprüfung der Stabilität einer Biosyntheseleistung von mycelbildenden Bakterien und Pilzen unter kontaminationsfreien Bedingungen mit Mediumselementen durchzuführen, die dem technischen Medium relevant sind.

Durch die Erhöhung der Anzahl technisch relevanter Kriterien wird die richtige Auswahl der geeigneten Mikroorganismen für Hochleistungsfermentationen mit einer gegebenen Substratkomposition gefördert.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches es erlaubt, die Prüfung der Stabilität der Biosyntheseleistung neben bekannten Kriterien zusätzlich in enger Anlehnung an die Zusammensetzung technischer Nährmedien unter Scherkraftbelastung rechtzeitig und unabhängig von Produktionsfermentern durchzuführen. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch Kombination des bekannten Verfahrens zur kontinuierlichen Kultivierung von Mikroorganismen in Chemostaten und einer Mediumskombination, die den ökonomisch begründeten Produktionsmedium adäquat ist, in Verbindung mit einer maximalen Scherkraftbelastung, die nicht den Zelltod zur Folge hat, gelöst. Dabei werden die mycelbildenden mikrobiellen Produzenten kontinuierlich im Chemostaten unter hoher Scherkraftbelastung in den Prüfmedien kultiviert, wobei entweder nach konstanter Verdünnungsrate oder variierter Verdünnungsrate im Abstand von 5 bis 10 Generationen Kulturproben aseptisch entnommen und von diesen in bekannter Weise Oberflächenkulturen angelegt werden. Auf diesen Oberflächenkulturen können Subpopulationen, die von den Normkriterien des eingeimpften Ursprungstammes abweichen, erkannt werden. Für mycelbildende Bakterien und Pilze, deren maximale Biosyntheseleistung mit der Ausprägung eines bestimmten Phänotyps korrelieren, können abweichende morphologische Kriterien der Generationszahl im Prüfmedium

unter Scherkraftbelastung zugeordnet werden. Bei fehlender Korrelation muß die Prüfung der Biosynthese der auf den Oberflächenkulturen in Erscheinung tretenden Klone in bekannter Weise mit der Batch-Kultivierung erfolgen. In Verbindung mit diesen Kulturen kann die Prüfung isolierter Mikroorganismenpopulationen zusätzlich unter Streßeinwirkung erfolgen. Diese Streßbelastung beinhaltet die Testung einer Biosynthese unter C-, N-, PO₄-P-Belastung sowie mit spezifischen Inhibitoren des mikrobiellen Stoffwechsels, soweit diese Resistenzmarkerfür den Ursprungstamm im Chemostaten sind. Für die Prüfung der Reaktion der Gesamtpopulation auf die Scherkraftbelastung im Prüf medium werden dem Chemostaten im Abstand von t Proben entnommen und einer Tüpfelmethode nach Roth, M. et. al. Z. AIIg. Mikrobiol. 22, 557 bis 563,1982 unterworfen. Die Ökonomie des Lösungsprinzipes ergibt sich vor allem aus der Sicherung einer maximalen Biosyntheseleistung durch Einsatz eines mikrobiellen Produzenten, der rechtzeitig mit biotechnologisch relevanten Kriterien geprüft wurde, in großvolumigen Fermentatoren (V_A40m³).

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Von einer Lyophilkonserve oder einer versporten Oberflächenkultur des Stammes Penicillium chrysogenum werden eine oder mehrere submerse Anzuchtpassagen in Schüttelkolben angelegt, die analog zum jeweiligen Verfahren der Produktionsstufe Medien mit Sojamehl als Sojapepton, Melasse als Saccharose und Fe⁺⁺⁺-Verbindungen, NH4NO3, Na₂S₂O₃ und anorganische Salze in Aqua dest, enthalten. Nach der Kultivierung auf Rundschwingtischen bei 25°C erfolgt zwischen der 24. h und 48. h die Übertragung der Kultur in den Chemostaten. Die Chemostatenapparatur hat ein Arbeitsvolumen von 250 ml und ist nicht Gegenstand der Erfindung. Die Kultivierung im Chemostaten erfolgt bei einer Rührung von 1100 bis 1 600U min"¹ und einer Belüftung von 10Ih"¹ sowie mit einer Temperaturregelung und einer pH-Kontrolle. Das Medium, das aus Sojapepton 0,50g/l; Melasse 5,OgZIiNH₄NO₃ 0,143g/l; Na₂S₂O₃2,5g/l besteht, wird mittels einer Rollenpumpe so dosiert, daß eine Verdünnungsrate von 0,08 bis 0,1h"'realisiert wird. Das Medium hat einen pH-Wert vor und nach der Autoklavierung (60 min 120^oC)von7,0bis7,1. Die Regulierung der cH⁺ im Chemostaten erfolgt durch den ständigen Zulauf neuen Mediums mit entsprechender Zulaufrate. Der Rührer, der in diesem Zusammenhang Gegenstand der Erfindung ist, besteht aus Glas oder Metall mit einem trapezförmigen und einem dreieckigen Rührerblatt. Das trapezförmige Blatt mit angeschärften Kanten befindet sich 1 bis 2cm über dem dreieckigen Rührblatt, das ebenfalls scharfe Kanten besitzt und im Winkel von 90° am Rührwellenende befestigt ist. Mit dieser Rührblattanordnung wird eine genügend hoheTurbulenz mit entsprechender Scherkrafrwirkung in der Kulturlösung bei ruhiger Oberfläche erreicht.

Die Kultivierung von Penicillium chrysogenum-Stämmen im Chemostaten wird unter den genannten Bedingungen bis zu 150 Generationen geführt. Im Abstand von 5 bis 10 Generationen werden der Apparatur Proben entnommen und nach einer Verdünnung von 10~³ auf Emersmedien, die die Substanzen des Chemostatenmediums oder Anzuchtpassagen enthalten, aufgespatelt. Nach einer 9 bis 12tägigen Kultivierung bei 25°C werden die unversporten koloniebildenden Einheitender Emerskulturen gezählt und die Biosyntheseleistung der versporten koloniebildenden Einheiten in Schüttelkulturen getestet. Die Anzahl der unversporten degenerierten koloniebildenden Einheiten im Verhältnis zur Generationszahl oder die Zahl der biosynthesegeminderten- bzw. biosynthesefreien koloniebildenden Einheiten im Verhältnis zur Generationszahl sind die gefundenen technisch relevanten Kriterien des in den Chemostaten eingeimpften Stammes.

Beispiel 2

Die Anzucht des Stammaterials verläuft unter analogen Bedingungen zum Beispiel 1. Der zu prüfende Stamm ist in seinem Phosphormetabolismus dereguliert und besitzt als Marker die Resistenz gegenüber hohen PO4-P-Konzentrationen. Das Medium enthält zusätzl ich 2,0 g PO4-P/I als KH₂PO₄. In Abstand von 5 bis 10 Generationen werden dem Chemostaten Proben entnommen, das Zellmaterial dreimal in 0,1 M KCI-Lösung bei t = 25°C gewaschen und folgenden Emersmedien mit einer stumpfen 3 ml-Pipette aufgetüpfelt.

Basalmedium und: Saccharose 7,5g/l, NH₄CL 1,43g/l, PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l; Glukose 7,5g/l, NH₄C11,43g/l, PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l; Fruktose 7,5g/l, NH₄CI 1,43g/l, PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l; Laktose 7,5g/l, NH₄C11,43g/l, PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l; Stärke 7,5g/l, NH₄CI 1,43g/l, PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l; Casein 5,0g/l PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l. Die Tüpfelkulturen werden 24h bis 30h bei 25°C kultiviert und dann mit einem Testmedium, das den penicillin-sensiblen Teststamm Bacillus subtilis enthält, überschichtet. Diese Kulturen werden bei 34⁰C 20 h kultiviert. Die Ausbildung der Hemmhöfe in Abhängigkeit der verschiedenen C-Substrate und der PO₄-P-Konzentrationen ist ein Maß der Biosynthese und des Vorhandenseins des geforderten physiologischen Status des zu prüfenden Penicilliumstammes. Anstelle von Submersmycel können auch Konidien mit einer Impföse auf die aufgeführten Emersmedien aufgetüpfelt werden. In diesem Falle beträgt die Kultivierungszeit 48 h bei t = 25°C.

Claims (2)

1. Verfahren zur Prüfung der Degenerationsgeschwindigkeit von antibiotikumbildenden Selektanten, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien oder Pilze in einem Chemostaten, der ein Medium enthält, das sich aus Mediumselementen des Impf- und/oder Produktionsfermenters eines Hochleistungsverfahrens zusammensetzt, unter Scherkraftbelastung kultiviertwerden,unddaßdie Stabilität eines Phänotyps, insbesondere von mycelbildenden Bakterien und Pilzen unter technisch relevanten Bedingungen geprüft wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Scherkraftwirkung in der Kultur durch einen Rührer erzeugt wird, der sich aus einem oder mehreren scharfkantigen trapezförmigen Blättern und einem scharfkantigen, dreieckigen Blatt, das horizontal im Blattmittelpunkt am Wellenende befestigt ist.