DD248031A3

DD248031A3 - METHOD FOR TESTING THE DEGENERATION SPEED OF ANTIBIOTIC FORMING SELECTORS

Info

Publication number: DD248031A3
Application number: DD26931684A
Authority: DD
Inventors: Arnulf Christner; Erhard Wolleschensky; Kaete Meyer; Ingeborg Heller; Guenter Ruhland; Dorothea Macha; Anneliese Kaestner; Margrit Loest
Original assignee: Jenapharm Veb
Priority date: 1984-11-09
Filing date: 1984-11-09
Publication date: 1987-07-29

Abstract

Die Erfindung dient als eine Methode der Optimierung von Produktbildungsverfahren in der technischen Mikrobiologie. Ziel der Erfindung ist die Beschreibung eines Verfahrens, das eine Langzeitpruefung der Stabilitaet einer Biosyntheseleistung von mycelbildenden Bakterien und Pilzen unter kontaminationsfreien Bedingungen mit Mediumselementen, die dem technischen Medium relevant sind, ermoeglicht. Erfindungsgemaess wird diese Aufgabe durch Kombination des bekannten Verfahrens zur kontinuierlichen Kultivierung von Mikroorganismen in Chemostaten und einer Mediumskombination, die den oekonomisch begruendeten Produktionsmedien adaequat ist in Verbindung mit einer maximalen Scherkraftbelastung, die nicht den Zelltod zur Folge hat, geloest.The invention serves as a method of optimizing product formation processes in technical microbiology. The aim of the invention is the description of a method which allows a long-term examination of the stability of a biosynthetic performance of mycelium-forming bacteria and fungi under contamination-free conditions with medium elements which are relevant to the technical medium. According to the invention, this object is achieved by combining the known method for the continuous cultivation of microorganisms in chemostats and a medium combination which works well for the production media based on economy, in conjunction with a maximum shear force load which does not result in cell death.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prüfung der Degenerationsgeschwindigkeit von mycelbildenden Antibiotikumproduzenten in Abhängigkeit der Anzahl der Massenverdopplungen der Biomasse. Die Erfindung dient als eine Methode der Optimierung von Produktbildungsverfahren in der technischen Mikrobiologie.The invention relates to a method for testing the rate of degeneration of mycelium-producing antibiotic producers as a function of the number of mass doublings of the biomass. The invention serves as a method of optimizing product formation processes in technical microbiology.

Characteristic of the known technical solutions

Es ist bekannt, daß die Stabilität des Geno- und Phänotyps von mycelbildenden Mikroorganismen, die für Fermentationsprozesse zur Produktgewinnung eingesetzt werden, einer ständigen Prüfung bedarf. Erleichtert wird diese· Prüfung bei solchen produktbildenden Mikroorganismen, deren maximale Biosynthese mit der Ausbildung von morphologischen Markern korreliert. In diesem Fall kann in herkömmlicher Weise die Prüfung der Stabilität der Biosynthese der verwendeten Mikroorganismen mit der Auswertung von vorher angelegten Oberflächenkulturen erfolgen. Die überwiegende Zahl dermikrobiellen Produktbildner erfordert jedoch aufwendige, zu den Fermentationen parallel laufende Prüfverfahren in Schüttelkolben oder Kleinfermentern, um nach deren analytischer Auswertung die richtige Wahl eines geeigneten Stammes für die Hochleistungsfermentation abzusichern.It is known that the stability of the genotype and phenotype of mycelium-forming microorganisms used for product recovery fermentation processes requires constant testing. This testing is facilitated in those product-forming microorganisms whose maximum biosynthesis correlates with the formation of morphological markers. In this case, in a conventional manner, the testing of the stability of the biosynthesis of the microorganisms used with the evaluation of previously applied surface cultures. However, the vast majority of the microbial product formers require complex, parallel to the fermentations running test methods in shake flasks or small fermenters to ensure their analytical evaluation, the right choice of a suitable strain for high-performance fermentation.

Für die genotypische Optimierung mit klassischen Mutations- und Selektionsmethoden werden chemisch definierte oder komplexe Medien mit Streßfaktoren verwendet, die im Vergleich zu den ökonomisch begründeten Fermentationsmedien Alternativmedien darstellen. Entscheidend für die Auswahl von mit bekannten Methoden geprüften mikrobiellen Produzenten ist jedoch auch die Stabilität der Biosynthesekapazität in den ökonomisch begründeten Fermentationsmedien unter Scherkraftbelastung. Neben den emersen Stammerhaltungspassagen sind ca. 30 Massenverdopplungen der Biomasse bis zum Zeitpunkt einer produktinduzierenden Substratlimitation im Großfermenter erforderlich. Während dieser Wachstumsphasen in den Anzuchtstufen und in der abschließenden Großfermenterstufe sollen keine Subpopulationen ohne oder mit geminderter Produktbildung auftreten, da dieser unproduktive Biomasseanteil für das Wachstum und den Erhaltungsstoffwechsel unökonomisch Substrate verbraucht.For the genotypic optimization with classical mutation and selection methods, chemically defined or complex media with stress factors are used, which represent alternative media compared to the economically justified fermentation media. However, the stability of the biosynthetic capacity in the economically justified fermentation media under shear stress is also decisive for the selection of microbial producers tested using known methods. In addition to the emersed stammering passages, approximately 30 mass doublings of the biomass are required until the time of product-inducing substrate limitation in the large-scale fermenter. During these stages of growth in the growing stages and in the final large fermenter stage, no subpopulations are expected to occur with or without reduced product formation, as this unproductive biomass fraction is uneconomically consumed by substrates for growth and maintenance metabolism.

Die Identifizierung dieser mikrobiellen Kommensalen, die bis zu einem Anteil von 20% einer Gesamtpopulation während eines mikrobiellen Fermentationszyklus anwachsen können, erfolgt durch Rückisolationen auf geeigneten Emersmedien. Die experimentellen Ergebnisse für die Wertung dieses Kriteriums sind erst nach dem Einsau einer mikrobiellen Selektante in den Produktionsfermentern zugänglich.Identification of these microbial commensals, which can grow up to 20% of a total population during a microbial fermentation cycle, is achieved by back-isolation on suitable Emers media. The experimental results for the evaluation of this criterion are only accessible after the incorporation of a microbial selector into the production fermenters.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, das es ermöglicht, eine Langzeitprüfung der Stabilität einer Biosyntheseleistung von mycelbildenden Bakterien und Pilzen unter kontaminationsfreien Bedingungen mit Mediumselementen durchzuführen, die dem technischen Medium relevant sind.The aim of the invention is to provide a method which makes it possible to carry out a long-term test of the stability of a biosynthetic performance of mycelium-forming bacteria and fungi under contamination-free conditions with medium elements which are relevant to the technical medium.

Durch die Erhöhung der Anzahl technisch relevanter Kriterien wird die richtige Auswahl der geeigneten Mikroorganismen für Hochleistungsfermentationen mit einer gegebenen Substratkomposition gefördert.By increasing the number of technically relevant criteria, the right choice of suitable microorganisms for high performance fermentations with a given substrate composition is promoted.

Explanation of the essence of the invention

Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches es erlaubt, die Prüfung der Stabilität der Biosyntheseleistung neben bekannten Kriterien zusätzlich in enger Anlehnung an die Zusammensetzung technischer Nährmedien unter Scherkraftbelastung rechtzeitig und unabhängig von Produktionsfermentern durchzuführen. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch Kombination des bekannten Verfahrens zur kontinuierlichen Kultivierung von Mikroorganismen in Chemostaten und einer Mediumskombination, die den ökonomisch begründeten Produktionsmedium adäquat ist, in Verbindung mit einer maximalen Scherkraftbelastung, die nicht den Zelltod zur Folge hat, gelöst. Dabei werden die mycelbildenden mikrobiellen Produzenten kontinuierlich im Chemostaten unter hoher Scherkraftbelastung in den Prüfmedien kultiviert, wobei entweder nach konstanter Verdünnungsrate oder variierter Verdünnungsrate im Abstand von 5 bis 10 Generationen Kulturproben aseptisch entnommen und von diesen in bekannter Weise Oberflächenkulturen angelegt werden. Auf diesen Oberflächenkulturen können Subpopulationen, die von den Normkriterien des eingeimpften Ursprungstammes abweichen, erkannt werden. Für mycelbildende Bakterien und Pilze, deren maximale Biosyntheseleistung mit der Ausprägung eines bestimmten Phänotyps korrelieren, können abweichende morphologische Kriterien der Generationszahl im PrüfmediumThe object of the invention is to provide a method which makes it possible to carry out the testing of the stability of the biosynthetic performance in addition to known criteria in addition to close to the composition of technical nutrient media under shear stress in a timely manner and independent of production fermenters. According to the invention, this object is achieved by combining the known method for the continuous cultivation of microorganisms in chemostats and a medium combination that is adequate for the economically justified production medium, in conjunction with a maximum shear stress that does not result in cell death. Here, the mycel-forming microbial producers are continuously cultivated in the chemostat under high shear stress in the test media, either a constant dilution rate or varying dilution rate at a distance of 5 to 10 generations aseptically removed culture samples and applied by these in a known manner surface cultures. Subpopulations that deviate from the standard criteria of the inoculated parent strain can be detected on these surface cultures. For mycel-forming bacteria and fungi whose maximum biosynthetic performance correlates with the expression of a particular phenotype, deviating morphological criteria of the generation number in the test medium can be used

unter Scherkraftbelastung zugeordnet werden. Bei fehlender Korrelation muß die Prüfung der Biosynthese der auf den Oberflächenkulturen in Erscheinung tretenden Klone in bekannter Weise mit der Batch-Kultivierung erfolgen. In Verbindung mit diesen Kulturen kann die Prüfung isolierter Mikroorganismenpopulationen zusätzlich unter Streßeinwirkung erfolgen. Diese Streßbelastung beinhaltet die Testung einer Biosynthese unter C-, N-, PO₄-P-Belastung sowie mit spezifischen Inhibitoren des mikrobiellen Stoffwechsels, soweit diese Resistenzmarkerfür den Ursprungstamm im Chemostaten sind. Für die Prüfung der Reaktion der Gesamtpopulation auf die Scherkraftbelastung im Prüf medium werden dem Chemostaten im Abstand von t Proben entnommen und einer Tüpfelmethode nach Roth, M. et. al. Z. AIIg. Mikrobiol. 22, 557 bis 563,1982 unterworfen. Die Ökonomie des Lösungsprinzipes ergibt sich vor allem aus der Sicherung einer maximalen Biosyntheseleistung durch Einsatz eines mikrobiellen Produzenten, der rechtzeitig mit biotechnologisch relevanten Kriterien geprüft wurde, in großvolumigen Fermentatoren (V_A40m³).be assigned under shear stress. In the absence of correlation, the biosynthesis of the clones appearing on the surface cultures must be checked in a known manner by batch cultivation. In conjunction with these cultures, testing of isolated microorganism populations may additionally be done under stress. This stress load involves the testing of biosynthesis under C, N, PO ₄ -P loading as well as with specific inhibitors of microbial metabolism, insofar as these are resistance markers for the source strain in the chemostat. To test the reaction of the total population on the shear stress in the test medium samples are taken from the chemostat at intervals of t and a spotting method according to Roth, M. et. al. Z. Allg. Microbiol. 22, 557 to 563, 1982. The economy of the solution principle results above all from ensuring maximum biosynthetic performance by using a microbial producer, which was tested in good time with biotechnologically relevant criteria, in large-volume fermenters (V _A 40m ³ ).

Ausführungsbeispieleembodiments

example 1

Von einer Lyophilkonserve oder einer versporten Oberflächenkultur des Stammes Penicillium chrysogenum werden eine oder mehrere submerse Anzuchtpassagen in Schüttelkolben angelegt, die analog zum jeweiligen Verfahren der Produktionsstufe Medien mit Sojamehl als Sojapepton, Melasse als Saccharose und Fe⁺⁺⁺-Verbindungen, NH4NO3, Na₂S₂O₃ und anorganische Salze in Aqua dest, enthalten. Nach der Kultivierung auf Rundschwingtischen bei 25°C erfolgt zwischen der 24. h und 48. h die Übertragung der Kultur in den Chemostaten. Die Chemostatenapparatur hat ein Arbeitsvolumen von 250 ml und ist nicht Gegenstand der Erfindung. Die Kultivierung im Chemostaten erfolgt bei einer Rührung von 1100 bis 1 600U min"¹ und einer Belüftung von 10Ih"¹ sowie mit einer Temperaturregelung und einer pH-Kontrolle. Das Medium, das aus Sojapepton 0,50g/l; Melasse 5,OgZIiNH₄NO₃ 0,143g/l; Na₂S₂O₃2,5g/l besteht, wird mittels einer Rollenpumpe so dosiert, daß eine Verdünnungsrate von 0,08 bis 0,1h"'realisiert wird. Das Medium hat einen pH-Wert vor und nach der Autoklavierung (60 min 120^oC)von7,0bis7,1. Die Regulierung der cH⁺ im Chemostaten erfolgt durch den ständigen Zulauf neuen Mediums mit entsprechender Zulaufrate. Der Rührer, der in diesem Zusammenhang Gegenstand der Erfindung ist, besteht aus Glas oder Metall mit einem trapezförmigen und einem dreieckigen Rührerblatt. Das trapezförmige Blatt mit angeschärften Kanten befindet sich 1 bis 2cm über dem dreieckigen Rührblatt, das ebenfalls scharfe Kanten besitzt und im Winkel von 90° am Rührwellenende befestigt ist. Mit dieser Rührblattanordnung wird eine genügend hoheTurbulenz mit entsprechender Scherkrafrwirkung in der Kulturlösung bei ruhiger Oberfläche erreicht.From a Lyophilkonserve or a verzorten surface culture of the strain Penicillium chrysogenum one or more submerse cultivation passages are created in shaking flasks, which analogously to the respective process of the production stage media with soybean meal as soy peptone, molasses as sucrose and Fe ⁺⁺⁺ compounds, NH4NO3, Na ₂ S ₂ O ₃ and inorganic salts in distilled water. After culturing on rotary tables at 25 ° C., the culture is transferred to the chemostat between 24 h and 48 h. The chemostat apparatus has a working volume of 250 ml and is not the subject of the invention. The cultivation in the chemostat carried out at a stirring 1100-1 600U min ^"1 and an aeration of 10Ih" ¹ as well as with a temperature control, and pH control. The medium made from soy peptone 0.50g / l; Molasses 5, OgZiiNH ₄ NO ₃ 0.143 g / l; Na ₂ S ₂ O _{3 is} 2.5 g / l, is metered by means of a roller pump so that a dilution rate of 0.08 to 0.1 h "'is realized.The medium has a pH before and after autoclaving (60 min 120 ^o C) von7,0bis7,1. the regulation of the cH ⁺ takes place in the chemostat by the constant feed the new medium with the appropriate feed rate. the stirrer, which is the subject of the invention in this context, is made of glass or metal with a trapezoid and The trapezoidal blade with sharpened edges is 1 to 2 cm above the triangular blade, which also has sharp edges and is secured at 90 ° to the stirrer shaft end achieved a quiet surface.

Die Kultivierung von Penicillium chrysogenum-Stämmen im Chemostaten wird unter den genannten Bedingungen bis zu 150 Generationen geführt. Im Abstand von 5 bis 10 Generationen werden der Apparatur Proben entnommen und nach einer Verdünnung von 10~³ auf Emersmedien, die die Substanzen des Chemostatenmediums oder Anzuchtpassagen enthalten, aufgespatelt. Nach einer 9 bis 12tägigen Kultivierung bei 25°C werden die unversporten koloniebildenden Einheitender Emerskulturen gezählt und die Biosyntheseleistung der versporten koloniebildenden Einheiten in Schüttelkulturen getestet. Die Anzahl der unversporten degenerierten koloniebildenden Einheiten im Verhältnis zur Generationszahl oder die Zahl der biosynthesegeminderten- bzw. biosynthesefreien koloniebildenden Einheiten im Verhältnis zur Generationszahl sind die gefundenen technisch relevanten Kriterien des in den Chemostaten eingeimpften Stammes.The cultivation of Penicillium chrysogenum strains in the chemostat is conducted under the conditions mentioned up to 150 generations. At intervals of 5 to 10 generations, the apparatus samples are taken and spiked after a dilution of 10 ~ ³ on Emers media containing the substances of Chemostatenmediums or breeding passages. After 9-12 days of culture at 25 ° C, the uncolored colony-forming units of the emercultures are counted and the biosynthetic performance of the delayed colony-forming units is tested in shake cultures. The number of unprotected degenerate colony-forming units in relation to the generation number or the number of biosynthesegeminderten- or biosynthesis-free colony forming units in relation to the generation number are the found technically relevant criteria of the vaccinated in the chemostat tribal.

Example 2

Die Anzucht des Stammaterials verläuft unter analogen Bedingungen zum Beispiel 1. Der zu prüfende Stamm ist in seinem Phosphormetabolismus dereguliert und besitzt als Marker die Resistenz gegenüber hohen PO4-P-Konzentrationen. Das Medium enthält zusätzl ich 2,0 g PO4-P/I als KH₂PO₄. In Abstand von 5 bis 10 Generationen werden dem Chemostaten Proben entnommen, das Zellmaterial dreimal in 0,1 M KCI-Lösung bei t = 25°C gewaschen und folgenden Emersmedien mit einer stumpfen 3 ml-Pipette aufgetüpfelt.The growth of the parent material proceeds under analogous conditions, for example 1. The strain to be tested is deregulated in its phosphorus metabolism and has as its marker resistance to high PO4-P concentrations. The medium additionally contains 2.0 g PO4-P / I as KH ₂ PO ₄ . At intervals of 5 to 10 generations samples are taken from the chemostat, the cell material washed three times in 0.1 M KCl solution at t = 25 ° C and spotted following Emers media with a blunt 3 ml pipette.

Basalmedium und: Saccharose 7,5g/l, NH₄CL 1,43g/l, PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l; Glukose 7,5g/l, NH₄C11,43g/l, PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l; Fruktose 7,5g/l, NH₄CI 1,43g/l, PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l; Laktose 7,5g/l, NH₄C11,43g/l, PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l; Stärke 7,5g/l, NH₄CI 1,43g/l, PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l; Casein 5,0g/l PO₄-P 2,0 bis 3,0g/l. Die Tüpfelkulturen werden 24h bis 30h bei 25°C kultiviert und dann mit einem Testmedium, das den penicillin-sensiblen Teststamm Bacillus subtilis enthält, überschichtet. Diese Kulturen werden bei 34⁰C 20 h kultiviert. Die Ausbildung der Hemmhöfe in Abhängigkeit der verschiedenen C-Substrate und der PO₄-P-Konzentrationen ist ein Maß der Biosynthese und des Vorhandenseins des geforderten physiologischen Status des zu prüfenden Penicilliumstammes. Anstelle von Submersmycel können auch Konidien mit einer Impföse auf die aufgeführten Emersmedien aufgetüpfelt werden. In diesem Falle beträgt die Kultivierungszeit 48 h bei t = 25°C.Basal medium and: sucrose 7.5g / l, NH ₄ CL 1.43g / l, PO ₄ -P 2.0 to 3.0g / l; Glucose 7.5 g / l, NH ₄ C 11.43 g / l, PO ₄ -P 2.0 to 3.0 g / l; Fructose 7.5 g / l, NH ₄ Cl 1.43 g / l, PO ₄ -P 2.0 to 3.0 g / l; Lactose 7.5g / l, NH ₄ C 11.43g / l, PO ₄ -P 2.0 to 3.0g / l; Starch 7.5 g / l, NH ₄ Cl 1.43 g / l, PO ₄ -P 2.0 to 3.0 g / l; Casein 5.0g / l PO ₄ -P 2.0 to 3.0g / l. The spiked cultures are cultured for 24h to 30h at 25 ° C and then overlaid with a test medium containing the penicillin-sensitive test strain Bacillus subtilis. These cultures are cultured at 34 ⁰ C for 20 h. The formation of the inhibition zones as a function of the various C substrates and the PO ₄ -P concentrations is a measure of the biosynthesis and the presence of the required physiological status of the Penicillium strain to be tested. Instead of submucosal mycosis, conidia can also be spotted on the listed Emers media with a loop. In this case, the culture time is 48 h at t = 25 ° C.

Claims

A method of assaying the rate of degeneration of antibiotic forming selectants, characterized in that the bacteria or fungi are cultured under shear stress in a chemostat containing a medium composed of medium elements of the seed and / or production fermenter of a high performance process, and that the stability of a Phenotype, especially of mycelium-forming bacteria and fungi under technically relevant conditions.

2. The method according to item 1, characterized in that the shearing force effect is produced in the culture by a stirrer, which is composed of one or more sharp-edged trapezoidal leaves and a sharp-edged, triangular leaf, which is fixed horizontally in the leaf center at the shaft end.