DD293137A5 - Verfahren zur herstellung von ubichinon-8 mittels bakterien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-8 mittels Bakterien. Erfindungsgemaesz wird eine chemostatisch auf Methanol erzeugte Biomasse des Bakterienstammes Methylobacillus IMET-Nr. 11070 so weiter vermehrt, dasz das Substratangebot immer groeszer ist, als tatsaechlich wachstumsbedingt verbraucht werden kann. Die Weitervermehrung erfolgt nach dem fed-batch-Prinzip, wobei es besonders vorteilhaft ist, diese Phase nach Verdopplung der Zellkonzentration durch Stickstofflimitation zu beenden. Die Steigerungsrate hinsichtlich der Konzentration an Ubichinon in der Bakterienbiomasse betraegt 50-100% gegenueber herkoemmlicher chemostatischer Kultivierung.{Ubichinon-8; Bakterien; Kultivierung; Chemostat; Methylobacillus; Limitation; Methanol; Substratueberschusz}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-8 unter Nutzung von Bakterien als Quelle.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Ubichinonesind dem systematischen Namen nach 2,3-Dimethoxy-5-methyl-4-benzochinone, die in 6-Stellung des Chinonringes eine Isoprenseitenkette variabler Länge tragen. In Hefemitochondrien und Bakterien kommen Homologe vor, die entsprechend der Zahl der isoprenoiden Einheiten als z. B. Q-8, Q-9 oder Q-10 bezeichnet werden. Das Vorkommen und die Verteilung der Ubichinonhomologen in Mikroorganismen ist stammspezifisch und besitzt taxonomische Relevanz. Ubichinone haben wegen ihrer vielfältigen pharmakologischen Wirkungen und die biochemischen Aktivität kommerzielles Interesse erlangt. Mikroorganismenbiomasse enthält in der Regel zu sonstigen natürlichen Quellen um 1 bis 2 Größenanordnungen höhere Ubichinonkonzentrationen und wird deshalb als Rohstoff für die Gewinnung von Ubichinonen bevorzugt. Die bekannten Verfahren haben überwiegend die Gewinnung von Ubichinon 10 zum Ziel, da dieses auch im menschlichen Gewebe vorkommt. Beschrieben wurde u.a. die mikrobielle Herstellung mit Arten der Gattung Rhodotorula, Candida, Sporobolomyces, Aureobasidium, Trichosporon (US-PS 1.343066). Bekannt ist weiterhin, daß eine Reihe fakultativ methylotropher Bakterien Ubichinone unterschiedlichster Kettenlänge enthalten. So bilden Spezies der Gattungen Protomonas, Ancylobacter, Acetobacter und Thiobacillus Ubichinone vom Typ Q-10. Hyphomicrobium-Spezies enthalten Q-9, während in Spezies der Gattungen Methylobacillus und Methylophaga Q-8 vorkommt. (Urakami, T., Komagata, K., J.Gen. Appl. Microbiol. 32,317-341 [1986].)

Das Patent DD 236552 beansprucht Acetobacter methanolicus, kultiviert auf Methanol allein oder methanolhaltigen mit organischen Verbindungen belasteten Ab- und Nebenprodukten der chemischen Industrie, als Produzent für Ubichinon-10. Die Ubichinonbildung erfolgt durch kontinuierliche Vermehrung und unter unsterilen Bedingungen. In der SU-PS 1.353808 wird die Gewinnung von Ubichinon-9 mit Rhodopseudomonas-Spezies beschrieben.

An Versuche zur Steigerung der Konzentration und der Ausbeute an Ubichinon als mg/1 (bezogen auf die Zellkonzentration im Fermentor) hat es nicht gefehlt. In einigen Fällen, so z. B. bei der mikrobiellen Synthese von Ubichinon-10, wurden bekannte Maßnahmen mit der speziellen Leistungsfähigkeit eines Stammes kombiniert, wobei der wesentliche Effekt durch die Auswahl potentieller Stämme bzw. Selektion von Mutanten erzielt wird (DD 236552, JP-PS 54-119079, JP-PS 5526). Weiterhin wurden Präkorsuren dem Nährmedium zugesetzt (US-PS 4220719, DE-OS 2838252, US-PS 4070244, US-PS 4367289). Die erzielten Effekte halten sich in Grenzen. In Rechnung zu stellen ist außerdem, daß die Herstellung der Präkorsuren einen ziemlichen präparativen Aufwand zur Voraussetzung hat und Mutanten hinsichtlich der Vermehrung nicht problemlos sind. Das trifft auch auf die mikrobielle Gewinnung von Ubichinonen kürzerer Kettenlängez. B. von Q-8 zu. Hinzu kommt, daß sich die bekannten Q-8 bildenden methylotrophen Stämme für eine massenweise Vermehrung unter unsterilen Bedingungen nicht eignen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein kostengünstiges Verfahren zur bakteriellen Herstellung von Ubichinon kürzerer Kettenlänge zu entwickeln, wobei der Schwerpunkt auf hoher Konzentration in der Trockensubstanz liegt.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Erhöhung der Konzentration von Ubichinon-8 in der Bakterienmasse zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, indem Bakterien der Gattung Methylobacillus, die zunächst auf bekannte Weise durch eine chemostatische, substratlimitierte Kultivierung unter Verwendung von Methanol als C-und Energiequelle gewonnen wurden, anschließend so weitervermehrt werden, daß das Substratangebot stets größer ist als wachstumsbedingt

verbraucht werden kann. Dieser Substratüberschuß kann durch ein molares Kohlenstoff/Stickstoffverhältnis von mindestens 30:1 charakterisiert werden. Die Weitervermehrung der erzeugten Biomasse erfolgt vorteilhafterweise nach dem fed-batch-Prinzip, wobei die Zulauf rate des Substrates so eingestellt wird, daß sie größer ist als die wachstumsbedingte Verbrauchsrate. In einer anderen Ausgestaltungsvariante wird in der Weitervermehrungsphase das Wachstum der Biomasse bei Substratüberschuß das Wachstum der Biomasse etwa nach einer Verdoppelung der initialen Biomassekonzentration durch Stickstoffmangel limitiert.

Ein besonders vorteilhaft geeigneter Bakterienstamm zur Durchführung des Verfahrens ist der Stamm Methylobacillus ZIMET11070, der in der Kulturensammlung des Zentralinstitutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena enthalten ist. Die Stammbeschreibung und seine Kultivierungsbedingungen sind im DD-WP 239197 angegeben. Die chemostatische Kultivierung dieses Stammes unter heterotrophes Substrat limitierten Bedingungen führt zu einer Biomasse mit < 0,1 % Ubichinon-8 in der Trockensubstanz, in der Regel zwischen 0,05 und 0,08%.

Der Vorteil der vorliegenden Erfindung drückt sich darin aus, daß gegenüber normaler chemostatischer Kultivierung eine Steigerung des Gehaltes an Wirkstoff in der Bakterientrockenmasse von ca. 50% erreicht wird, wenn eine Weitervermehrungsphase unter Substratüberschuß realisiert wird und von ca. 100%, wenn zusätzlich eine Stickstofflimitation erfolgt.

Die Isolierung des Ubichinon-8 aus der Biomasse erfolgt nach bekannter Weise.

Nachfolgend wird die Erfindung durch Ausführungsbeispiele erläutert.

Beispiel 1

Methylobacillus IMET11070 wurde in einem für aerobe Kultivierung geeigneten Fermentor bei 32°C vermehrt. Der pH-Wert von 6,8-0,1 wurde durch automatische Zugabe von NaOH konstant gehalten. Die Gelöstsauerstoffkonzentration bewegte sich zwischen 20 bis 40% des Sättigungswertes. Die Kultivierung erfolgte kontinuierlich (C-Iimitiert) auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle bei einer Verdünnungsrate von 0,12 h~¹ auf einem Mineralmedium folgender Zusammensetzung (in mg/g BTS):

NH4CI	4	600	ZnSO4-7H2O	0,15
KH2PO,	,-7H2O	105	MnSO4-4H2O	0,28
MgSO4	2H2O	5	CuSO4-5H2O	0,26
CaCI2 ·	-7H2O	7	Na2MoO4-2H2O	0,08
FeSO4	1,7

Die so erzeugte Biomasse wurde in einem zweiten Kultivierungsschritt in einem für aerobe Bedingungen geeigneten Fermentor weiter vermehrt. Dazu wurde Methanol jetzt nach dem fed-batch-Prinzip so zugesetzt, daß die wachstumsbedingte Verbrauchsrate geringer als die Zulaufrate war. Die anderen Kultivierungsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und Gelöstsauerstoffkonzentration bewegten sich im oben angegebenen Bereich.

Nach etwa einer Verdoppelung der Biomassekonzentration wurden die Zellen mit geeigneten Methoden aus der Suspension abgetrennt und getrocknet. Der Gehalt an Ubichinon-8 im Biomassetrockenprodukt wurde nach alkalischer Hydrolyse der Probe aus dem unverseifbaren Anteil über die Farbreaktion mit Cyanessigsäureethylester photometrisch bestimmt (CRAVENS-Test). Methylobacillus IMET11070 auf Methanol ein Ubichinon-8-Gehalt von 0,068% ermittelt. Durch Anschluß der zweiten Kultivierungsphase erhöhte sich der Gehalt auf 0,103%

Das entspricht einer Steigerung um ca. 50%.

Beispiel 2

Methylobacillus IMET121070 wurde kontinuierlich (C-Iimitiert) auf Methanol wie in Beispiel 1 beschrieben vermehrt. In einer zweiten Kultivierungsstufe wurde Methanol nach dem fed-batch-Prinzip so angeboten, daß die wachstumsbedingte Verbrauchsrate geringer als die Zulaufrate war. Stickstoff wurde in dieser Wachstumsphase so eingesetzt, daß nach etwa einer Verdoppelung der initialen Biomassekonzentration derZuwachs durch Stickstoffmangel begrenzt wurde. Danach wurde weitere 2 Stunden kultiviert.

Die so erzeugte Biomasse wurde bezüglich des Ubichinon-Gehaltes analysiert. Danach wies die chemostatisch auf Methanol erzeugte Biomasse mit 0,073% Ubichinon einen der in Beispiel 1 erzeugten vergleichbaren Gehalt auf. Nach Anschluß der zweiten Kultivierungsstufe dagegen stieg die Konzentration in der Trockenmasse auf 0,124% an. Das entspricht einer Steigerung des Gehaltes um etwa 70%.

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-8 mittels Bakterien der Gattung Methylobacillus, die durch eine chemostatische Kultivierung unter Verwendung von Methanol als C- und Energiequelle gewonnen wurde, gekennzeichnet dadurch, daß die auf diese Weise erzeugte Biomasse anschließend so weitervermehrt wird, daß das Substratangebot stets größer ist als wachstumsbedingt verbraucht werden kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Substratüberschuß durch ein molares Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis von mindestens 30:1 charakterisiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Weitervermehrung der Bakterienbiomasse nach dem fed-batch-Prinzip erfolgt und die Zulaufrate des Substrats so eingestellt wird, daß sie größer ist als die wachstumsbedingte Verbrauchsrate.

4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß in der Weitervermehrungsphase das Wachstum der Bakterienbiomasse etwa nach einer Verdopplung der initialen Biomassekonzentration durch die Stickstoffkonzentration limitiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Verwendung von Bakterien des Stammes Methylobacillus ZIMET11070.