DD293137A5

DD293137A5 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF UBICHINONE-8 BY BACTERIA

Info

Publication number: DD293137A5
Application number: DD33833990A
Authority: DD
Inventors: Wolfgang Babel; Dietmar Miethe; Roland Mueller; Heinz Seidel; Beate Voigt; Rolf Dueresch; Carsten Hampel; Torsten Schulze; Hans-Peter Richter
Original assignee: Chemie Ag Bitterfeld-Wolfen,De
Priority date: 1990-03-02
Filing date: 1990-03-02
Publication date: 1991-08-22

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-8 mittels Bakterien. Erfindungsgemaesz wird eine chemostatisch auf Methanol erzeugte Biomasse des Bakterienstammes Methylobacillus IMET-Nr. 11070 so weiter vermehrt, dasz das Substratangebot immer groeszer ist, als tatsaechlich wachstumsbedingt verbraucht werden kann. Die Weitervermehrung erfolgt nach dem fed-batch-Prinzip, wobei es besonders vorteilhaft ist, diese Phase nach Verdopplung der Zellkonzentration durch Stickstofflimitation zu beenden. Die Steigerungsrate hinsichtlich der Konzentration an Ubichinon in der Bakterienbiomasse betraegt 50-100% gegenueber herkoemmlicher chemostatischer Kultivierung.{Ubichinon-8; Bakterien; Kultivierung; Chemostat; Methylobacillus; Limitation; Methanol; Substratueberschusz}The invention relates to a process for the production of ubiquinone-8 by means of bacteria. According erfindungsgemaesz a chemostatically generated on methanol biomass of the bacterial strain Methylobacillus IMET no. 11070 further increased so that the substrate supply is always greater than can actually be consumed due to growth. The further propagation takes place according to the fed-batch principle, wherein it is particularly advantageous to terminate this phase after doubling the cell concentration by nitrogen limitation. The rate of increase in the concentration of ubiquinone in the bacterial biomass is 50-100% compared to conventional chemostatic culture. {Ubiquinone-8; Bacteria; Cultivation; chemostat; Methylobacillus; limitation; methanol; Substratueberschusz}

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-8 unter Nutzung von Bakterien als Quelle.The invention relates to a process for the production of ubiquinone-8 using bacteria as a source.

Characteristic of the known state of the art

Ubichinonesind dem systematischen Namen nach 2,3-Dimethoxy-5-methyl-4-benzochinone, die in 6-Stellung des Chinonringes eine Isoprenseitenkette variabler Länge tragen. In Hefemitochondrien und Bakterien kommen Homologe vor, die entsprechend der Zahl der isoprenoiden Einheiten als z. B. Q-8, Q-9 oder Q-10 bezeichnet werden. Das Vorkommen und die Verteilung der Ubichinonhomologen in Mikroorganismen ist stammspezifisch und besitzt taxonomische Relevanz. Ubichinone haben wegen ihrer vielfältigen pharmakologischen Wirkungen und die biochemischen Aktivität kommerzielles Interesse erlangt. Mikroorganismenbiomasse enthält in der Regel zu sonstigen natürlichen Quellen um 1 bis 2 Größenanordnungen höhere Ubichinonkonzentrationen und wird deshalb als Rohstoff für die Gewinnung von Ubichinonen bevorzugt. Die bekannten Verfahren haben überwiegend die Gewinnung von Ubichinon 10 zum Ziel, da dieses auch im menschlichen Gewebe vorkommt. Beschrieben wurde u.a. die mikrobielle Herstellung mit Arten der Gattung Rhodotorula, Candida, Sporobolomyces, Aureobasidium, Trichosporon (US-PS 1.343066). Bekannt ist weiterhin, daß eine Reihe fakultativ methylotropher Bakterien Ubichinone unterschiedlichster Kettenlänge enthalten. So bilden Spezies der Gattungen Protomonas, Ancylobacter, Acetobacter und Thiobacillus Ubichinone vom Typ Q-10. Hyphomicrobium-Spezies enthalten Q-9, während in Spezies der Gattungen Methylobacillus und Methylophaga Q-8 vorkommt. (Urakami, T., Komagata, K., J.Gen. Appl. Microbiol. 32,317-341 [1986].)Ubiquinones are the systematic name for 2,3-dimethoxy-5-methyl-4-benzoquinones bearing an isoprene side chain of variable length in the 6-position of the quinone ring. In yeast mitochondria and bacteria are homologues, which correspond to the number of isoprenoid units as z. Q-8, Q-9 or Q-10. The occurrence and distribution of ubiquinone homologues in microorganisms is strain-specific and of taxonomic relevance. Ubiquinones have gained commercial interest because of their diverse pharmacological effects and biochemical activity. As a rule, microorganism biomass contains 1 to 2 orders of magnitude higher ubiquinone concentrations than other natural sources and is therefore preferred as raw material for the production of ubiquinones. The known methods have mainly the extraction of ubiquinone 10 to the target, since this also occurs in human tissue. Was described u.a. the microbial production with species of the genus Rhodotorula, Candida, Sporobolomyces, Aureobasidium, Trichosporon (US Patent 1.343066). It is also known that a number of facultative methylotrophic bacteria contain ubiquinones of different chain lengths. Species of the genera Protomonas, Ancylobacter, Acetobacter and Thiobacillus Ubichinone type Q-10. Hyphomicrobium species contain Q-9, while species of the genera Methylobacillus and Methylophaga Q-8 occur. (Urakami, T., Komagata, K., J. Gen. Appl. Microbiol 32, 327-341 [1986].)

Das Patent DD 236552 beansprucht Acetobacter methanolicus, kultiviert auf Methanol allein oder methanolhaltigen mit organischen Verbindungen belasteten Ab- und Nebenprodukten der chemischen Industrie, als Produzent für Ubichinon-10. Die Ubichinonbildung erfolgt durch kontinuierliche Vermehrung und unter unsterilen Bedingungen. In der SU-PS 1.353808 wird die Gewinnung von Ubichinon-9 mit Rhodopseudomonas-Spezies beschrieben.Patent DD 236552 claims Acetobacter methanolicus cultivated on methanol alone or methanol-containing organics-contaminated by-products of the chemical industry, as a producer of ubiquinone-10. The Ubichinonbildung takes place by continuous propagation and under unsterile conditions. SU-PS 1,353,808 describes the recovery of ubiquinone-9 with Rhodopseudomonas species.

An Versuche zur Steigerung der Konzentration und der Ausbeute an Ubichinon als mg/1 (bezogen auf die Zellkonzentration im Fermentor) hat es nicht gefehlt. In einigen Fällen, so z. B. bei der mikrobiellen Synthese von Ubichinon-10, wurden bekannte Maßnahmen mit der speziellen Leistungsfähigkeit eines Stammes kombiniert, wobei der wesentliche Effekt durch die Auswahl potentieller Stämme bzw. Selektion von Mutanten erzielt wird (DD 236552, JP-PS 54-119079, JP-PS 5526). Weiterhin wurden Präkorsuren dem Nährmedium zugesetzt (US-PS 4220719, DE-OS 2838252, US-PS 4070244, US-PS 4367289). Die erzielten Effekte halten sich in Grenzen. In Rechnung zu stellen ist außerdem, daß die Herstellung der Präkorsuren einen ziemlichen präparativen Aufwand zur Voraussetzung hat und Mutanten hinsichtlich der Vermehrung nicht problemlos sind. Das trifft auch auf die mikrobielle Gewinnung von Ubichinonen kürzerer Kettenlängez. B. von Q-8 zu. Hinzu kommt, daß sich die bekannten Q-8 bildenden methylotrophen Stämme für eine massenweise Vermehrung unter unsterilen Bedingungen nicht eignen.Attempts to increase the concentration and the yield of ubiquinone as mg / l (based on the cell concentration in the fermentor) were not lacking. In some cases, such. As in the microbial synthesis of ubiquinone-10, known measures have been combined with the specific performance of a strain, the essential effect of which is achieved by the selection of potential strains or selection of mutants (DD 236552, JP-PS 54-119079, JP -PS 5526). Furthermore, precursors were added to the nutrient medium (US Pat. No. 4,220,719, DE-OS 2,838,252, US Pat. No. 4,070,244, US Pat. No. 4,367,289). The effects achieved are limited. It should also be taken into account that the preparation of the precorsors requires quite a preparative effort and mutants are not without problems in terms of propagation. This also applies to the microbial recovery of ubiquinones of shorter chain length. From Q-8 too. In addition, the known methylotrophic strains forming Q-8 are not suitable for mass propagation under unsterile conditions.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein kostengünstiges Verfahren zur bakteriellen Herstellung von Ubichinon kürzerer Kettenlänge zu entwickeln, wobei der Schwerpunkt auf hoher Konzentration in der Trockensubstanz liegt.The aim of the invention is to develop a cost-effective method for the bacterial production of ubiquinone shorter chain length, the emphasis is on high concentration in the dry matter.

Presentation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Erhöhung der Konzentration von Ubichinon-8 in der Bakterienmasse zu entwickeln.The invention has for its object to develop a method for increasing the concentration of ubiquinone-8 in the bacterial mass.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, indem Bakterien der Gattung Methylobacillus, die zunächst auf bekannte Weise durch eine chemostatische, substratlimitierte Kultivierung unter Verwendung von Methanol als C-und Energiequelle gewonnen wurden, anschließend so weitervermehrt werden, daß das Substratangebot stets größer ist als wachstumsbedingtAccording to the invention, the object is achieved by bacteria of the genus Methylobacillus, which were first obtained in a known manner by a chemostatic, substrate-limited cultivation using methanol as a C and energy source, are then so weitervermehrt that the substrate supply is always greater than growth-induced

verbraucht werden kann. Dieser Substratüberschuß kann durch ein molares Kohlenstoff/Stickstoffverhältnis von mindestens 30:1 charakterisiert werden. Die Weitervermehrung der erzeugten Biomasse erfolgt vorteilhafterweise nach dem fed-batch-Prinzip, wobei die Zulauf rate des Substrates so eingestellt wird, daß sie größer ist als die wachstumsbedingte Verbrauchsrate. In einer anderen Ausgestaltungsvariante wird in der Weitervermehrungsphase das Wachstum der Biomasse bei Substratüberschuß das Wachstum der Biomasse etwa nach einer Verdoppelung der initialen Biomassekonzentration durch Stickstoffmangel limitiert.can be consumed. This substrate excess can be characterized by a molar carbon / nitrogen ratio of at least 30: 1. The further propagation of the biomass generated is advantageously carried out according to the fed-batch principle, wherein the feed rate of the substrate is adjusted so that it is greater than the growth-related consumption rate. In another embodiment variant, in the propagation phase, the growth of the biomass in the case of substrate excess limits the growth of the biomass approximately after a doubling of the initial biomass concentration due to a lack of nitrogen.

Ein besonders vorteilhaft geeigneter Bakterienstamm zur Durchführung des Verfahrens ist der Stamm Methylobacillus ZIMET11070, der in der Kulturensammlung des Zentralinstitutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena enthalten ist. Die Stammbeschreibung und seine Kultivierungsbedingungen sind im DD-WP 239197 angegeben. Die chemostatische Kultivierung dieses Stammes unter heterotrophes Substrat limitierten Bedingungen führt zu einer Biomasse mit < 0,1 % Ubichinon-8 in der Trockensubstanz, in der Regel zwischen 0,05 und 0,08%.A particularly suitable bacterial strain for carrying out the method is the strain Methylobacillus ZIMET11070, which is contained in the culture collection of the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy Jena. The description of the strain and its cultivation conditions are given in DD-WP 239197. The chemostatic cultivation of this strain under heterotrophic substrate limited conditions leads to a biomass with <0.1% ubiquinone-8 in the dry matter, usually between 0.05 and 0.08%.

Der Vorteil der vorliegenden Erfindung drückt sich darin aus, daß gegenüber normaler chemostatischer Kultivierung eine Steigerung des Gehaltes an Wirkstoff in der Bakterientrockenmasse von ca. 50% erreicht wird, wenn eine Weitervermehrungsphase unter Substratüberschuß realisiert wird und von ca. 100%, wenn zusätzlich eine Stickstofflimitation erfolgt.The advantage of the present invention is expressed in the fact that compared to normal chemostatic culture an increase of the active ingredient content in the bacterial dry matter of about 50% is achieved if a Weitervermehrungsphase is realized under substrate excess and of about 100%, if in addition a nitrogen limitation he follows.

Die Isolierung des Ubichinon-8 aus der Biomasse erfolgt nach bekannter Weise.The isolation of ubiquinone-8 from the biomass is carried out in a known manner.

Nachfolgend wird die Erfindung durch Ausführungsbeispiele erläutert.The invention will be explained by embodiments.

example 1

Methylobacillus IMET11070 wurde in einem für aerobe Kultivierung geeigneten Fermentor bei 32°C vermehrt. Der pH-Wert von 6,8-0,1 wurde durch automatische Zugabe von NaOH konstant gehalten. Die Gelöstsauerstoffkonzentration bewegte sich zwischen 20 bis 40% des Sättigungswertes. Die Kultivierung erfolgte kontinuierlich (C-Iimitiert) auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle bei einer Verdünnungsrate von 0,12 h~¹ auf einem Mineralmedium folgender Zusammensetzung (in mg/g BTS):Methylobacillus IMET11070 was grown in a fermenter suitable for aerobic culture at 32 ° C. The pH of 6.8-0.1 was kept constant by automatic addition of NaOH. The dissolved oxygen concentration ranged between 20 to 40% of the saturation value. The cultivation was carried out continuously (C-imitation) on methanol as carbon and energy source at a dilution rate of 0.12 h ^-1 on a mineral medium of the following composition (in mg / g BTS):

NH₄CINH ₄ Cl 44 600600 ZnSO₄-7H₂OZnSO ₄ -7H ₂ O 0,150.15 KH₂PO,KH ₂ PO, ,-7H₂O, -7H ₂ O 105105 MnSO₄-4H₂OMnSO ₄ -4H ₂ O 0,280.28 MgSO₄ _MgSO4 2H₂O2H ₂ O 55 CuSO₄-5H₂OCuSO ₄ -5H ₂ O 0,260.26 CaCI₂ ·CaCl ₂ · -7H₂O-7H ₂ O 77 Na₂MoO₄-2H₂ONa ₂ MoO ₄ -2H ₂ O 0,080.08 FeSO₄ FeSO ₄ 1,71.7

Die so erzeugte Biomasse wurde in einem zweiten Kultivierungsschritt in einem für aerobe Bedingungen geeigneten Fermentor weiter vermehrt. Dazu wurde Methanol jetzt nach dem fed-batch-Prinzip so zugesetzt, daß die wachstumsbedingte Verbrauchsrate geringer als die Zulaufrate war. Die anderen Kultivierungsbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und Gelöstsauerstoffkonzentration bewegten sich im oben angegebenen Bereich.The biomass thus produced was further propagated in a second cultivation step in a fermenter suitable for aerobic conditions. For this purpose, methanol was now added according to the fed-batch principle so that the growth-related consumption rate was lower than the feed rate. The other culturing conditions such as temperature, pH and dissolved oxygen concentration were in the above range.

Nach etwa einer Verdoppelung der Biomassekonzentration wurden die Zellen mit geeigneten Methoden aus der Suspension abgetrennt und getrocknet. Der Gehalt an Ubichinon-8 im Biomassetrockenprodukt wurde nach alkalischer Hydrolyse der Probe aus dem unverseifbaren Anteil über die Farbreaktion mit Cyanessigsäureethylester photometrisch bestimmt (CRAVENS-Test). Methylobacillus IMET11070 auf Methanol ein Ubichinon-8-Gehalt von 0,068% ermittelt. Durch Anschluß der zweiten Kultivierungsphase erhöhte sich der Gehalt auf 0,103%After about a doubling of the biomass concentration, the cells were separated by suitable methods from the suspension and dried. The content of ubiquinone-8 in the biomass dried product was determined photometrically after alkaline hydrolysis of the sample from the unsaponifiable fraction via the color reaction with ethyl cyanoacetate (CRAVENS test). Methylobacillus IMET11070 on methanol found a ubiquinone 8 content of 0.068%. By connecting the second cultivation phase, the content increased to 0.103%

Das entspricht einer Steigerung um ca. 50%. This corresponds to an increase of approx. 50%.

Example 2

Methylobacillus IMET121070 wurde kontinuierlich (C-Iimitiert) auf Methanol wie in Beispiel 1 beschrieben vermehrt. In einer zweiten Kultivierungsstufe wurde Methanol nach dem fed-batch-Prinzip so angeboten, daß die wachstumsbedingte Verbrauchsrate geringer als die Zulaufrate war. Stickstoff wurde in dieser Wachstumsphase so eingesetzt, daß nach etwa einer Verdoppelung der initialen Biomassekonzentration derZuwachs durch Stickstoffmangel begrenzt wurde. Danach wurde weitere 2 Stunden kultiviert.Methylobacillus IMET121070 was propagated continuously (C-labeled) on methanol as described in Example 1. In a second cultivation stage methanol was offered according to the fed-batch principle so that the growth-related consumption rate was lower than the feed rate. Nitrogen was used in this growth phase so that after about a doubling of the initial biomass concentration, the increase was limited by nitrogen deficiency. Thereafter, cultivation was continued for 2 hours.

Die so erzeugte Biomasse wurde bezüglich des Ubichinon-Gehaltes analysiert. Danach wies die chemostatisch auf Methanol erzeugte Biomasse mit 0,073% Ubichinon einen der in Beispiel 1 erzeugten vergleichbaren Gehalt auf. Nach Anschluß der zweiten Kultivierungsstufe dagegen stieg die Konzentration in der Trockenmasse auf 0,124% an. Das entspricht einer Steigerung des Gehaltes um etwa 70%.The biomass thus produced was analyzed for the ubiquinone content. Thereafter, the chemostatically generated on methanol biomass with 0.073% ubiquinone one of the generated in Example 1 comparable content. On the other hand, after connection of the second culture step, the concentration in the dry matter increased to 0.124%. This corresponds to an increase of the salary by about 70%.

Claims

1. A process for the preparation of ubiquinone-8 by bacteria of the genus Methylobacillus, which was obtained by a chemostatic cultivation using methanol as C and energy source, characterized in that the biomass produced in this way is subsequently increased so that the substrate supply is always larger than can be consumed for growth.

2. The method according to claim 1, characterized in that the substrate excess is characterized by a molar carbon / nitrogen ratio of at least 30: 1.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the further propagation of the bacterial biomass according to the fed-batch principle and the feed rate of the substrate is adjusted so that it is greater than the growth-related consumption rate.

4. The method according to claim 3, characterized in that in the further propagation phase, the growth of the bacterial biomass is limited by a doubling of the initial biomass concentration by the nitrogen concentration.

5. The method according to claim 1, characterized by using bacteria of the strain Methylobacillus ZIMET11070.