DD209945A3 - Verfahren zur semikontinuierlichen biomassegewinnung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zuechtung von Mikroorganismen, um Biomasse bei hohen Produktivitaeten zu gewinnen, niedrige spezifische Stoffverbraeuche und/oder hohe Nutzungsgrade des Kohlenstoffsubstrates zu realisieren.Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, das es auf dem Weg ueber die Kontrolle der Nutzung der Energie- und Kohlenstoffquelle durch die Mikroorganismen ermoeglicht, das Ziel, hohe Ausbeuten und niedrige Betriebskosten, zu erreichen. Die Aufgabe wird erfindungsgemaess durch eine Steuerung des Austausches von Fermentationsmedium bei der semikontinuierlichen Zellenzuechtung nach dem Zustand der Mikroorganismen erreicht. Der Zustand der Mikroorganismen kann durch das Verfolgen des Anteiles wachsender Zellen, wie z.B. sprossender Hefezellen, an der Gesamtpopulation aus dem mikroskopischen Bild ermittelt werden. Der Austausch vorzugsweise der Haelfte des Fermentationsmediums gegen ein Naehrmedium, das vorzugsweise fuer eine Verdopplung der Zellzahl und -masse bilanziert wurde, erfolgt am Ende der Wachstumsphase.

Description

Titel

Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen.

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur semikontinuierliehen Züchtung von Mikroorganismen zur Biomasseproduktion Die Erfindung ist in die IPK C 12 IT einzuordnen..

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Aus der Patentliteratur ist ein seinikontinuierliches Zulaufverfahren zur Herstellung von Eiweiß- und Backhefe iⁿ einem belüfteten Permenter bekannt, wobei nach einer Zeit Λ tp ein Gewicht Δ g an Hefesuspension geerntet wird und ein Quotient Δ g/ Δ t„ so groß gewählt wird, . daß Δ t₂>0 wird (DE-OS 27 52485 32), Die Hefekultur wird in zwei sich wechselseitig ablösenden Phasen gezüchtet. In der Phase I der Dauer Δ t.

wird dem Reaktor iiährmedium, das Kohlenhydrate, Ammonium-Iactat und/oder Milchsäure enthalten kann, zugeführt. In der Phase II wird dem Permentor kein llährmedium zugeführt. Die Kultivierung wird bis zur Auszehrung der Kohlen stoff- und Energiequellen und der Stoffwechselprodukte geführt und danach dem Permentor ein Gewicht Δ g an Hefesusoension entnommen*

Sachteil dieses Verfahrens ist die hohe Aufenthaltszeit der Hefezellen im Reaktor (bis zu 30 Stunden) sowie die Möglichkeit der Aufnahme überschüssiger Bestandteile der Nährlösung durch die Mikroorganismen in dieser Zeitspanne« 5' Das kann zu hohen spezifischen Materialverbräuchen und Kühlkosten des Verfahrens führen (Heinritz, B., Dissertation A, Leipzig 1978).

In der Patentliteratur sind weiterhin zweistufige kontinuierliche Verfahren bekannt, die neben der Biomassege-* winnung eine erhöhte Nutzung der Kohlenstoff- und Energiequellen, z»B» eine hohe Ausnutzung der Paraffine des Erdöldestillats bei dessen Verhefung zum Ziel haben (DD-TO 105 825).

Bei einer Verweilzeit von 10 Stunden und einem Srdöldestillatanteil von 10 Ma,% mit einem Paraffingehalt von 38 Ma„% wurden eine Produktivität von 2,6 g HTS/kg h und ein spezifischer Paraffinverbrauch von 1,3 s/g HTS erreicht. Nach einer Aufenthaltszeit der Mikroorganismen in den beiden Fermentationsstufen der Srdöldestiilatkonvertierung von 10 Stunden wurde lediglich ein Stockpunkt des Dieselkraftstoffes von - 30⁰C erzielt.

Nachteil dieses Verfahrens- ist die hohe Aufenthaltszeit der Mikroorganismen in den beiden Fermentationsstufen, die zu hohen spezifischen Stoffverbräuchen und Wärmebildüngen sowie zur Speicherung von Reservestoffen, wie Lipiden oder Kohlenhydraten, in den Zellen führen kann·

Ziel der Erfindung;

Ziel der Erfindung ist die Senkung der spezifischen Stoffverbräuche, die Erhöhung der Biomassebildungsraten und/ oder hohe Nutzungsgrade der Nährstoffe, insbesondere eine hohe Ausnutzung des Kohlenstoffsubstrates bei der Biomasse Or ο duk ti on .

Darlegung; des Wesens der Erfindung;

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, das es auf dem Weg über die Kontrolle der Nutzung der Energie- und Kohlenstoffquelle durch die Mikroorganismen ermöglicht, .das Ziel, hohe Ausbeuten und niedrige Betriebskosten, zu erreichen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Steuerung des Austausches von Fermentationsmedium bei der semikontnuierlichen Zellenzüchtung nach dem Zustand der Mikroorganismen

TO erreicht.

Die erfindungsgemäße Lösung sieht den Austausch des Fermentationsmediums am Ende der Wachstumsphase der Mikroorganismen vor, Das Ende der Wachstumsphase kann zuverlässig durch . das Verfolgen der Zellenzahl und/oder durch Ermittlung des Anteils sich vermehrender Zellen,z,B* des Anteils sprossender Zellen an der G-esamtpopulation aus dem mikroskopischen Bild ermittelt werden*

Da die Dauer der Wachstumsphase in einem Fermentationssystem bei semikontinuierlicher Zellenzüchtimg unter gegebenen Fermentationsbedingungen konstant bleibt, sind einmalige mikroskopische Untersuchungen im technischen maßstab ausreichend. Der Austausch des Pensentationsmediuns erfolgt so, daß die Hälfte oder mehr als die Hälfte, vorzugsweise die Hälfte des Fermentationsmediums abgelassen wird* Anschließend wird Nährmedium mit für eine bis drei, vorzugsweise für eine Verdopplung der Zellzahl und -masse ausreichender Sahrstoffmenge zugeführt. Der Wachstumsprozeß ist über die Kohlenstoff- und Energiequelle zu begrenzen, da dies die Bildung von Reservestoffen einschränkt, Ein geringfügiger Überschuß an Sauerstoff sowie den anderen für das mikrobielle Wachstum essentiellen Elementen ist zu empfehlen* Bei der Fermentation sauerstoffreier Kohlenstoffsubstrate ist großer Wert auf die Einhaltung eines geringfügigen Sauerstoffüberschusses zu legen,

Dadurch können hohe Biomasseausbeuten, hohe Proteingehalte der Zellsubstanz sowie niedrige Kühlkosten des Verfahrens erzielt werden. Dies gilt auch für die milcrobielle Verwertung mehrerer Kohlenstoff- und Energiequellen bei deren optimalem Kohlenstoff- und Energieverhältnis,

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Ausführungsbeispiel·

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert:

Beispiel 1

Ziel der semikontinuierlichen Erdöldestillatfermentation ist die Erzielung hoher Paraffinnutzungsgrade und niedriger Stockpunkte des Erdöldestillats nach der Fermentation» Hefen der Art Lodderomyces elongisporus wurden auf Erdöldestillat (ED) als einziger Kohlenstoffquelle semikontinuierlich in einem 10 1 Rührferinentor kultiviert, Die Fermentationsbedingungen waren:

Kohlenstoffangebot (ED-Angebot) 20 Ma,% n-Paraffingehalt im ED 22 Ma,%

Hährlösungszusammensetzung: 21,1 g (1IH)₉SO₇, pro Liter 4,0 g KH₀PO.,' pro Liter

1j3 g H^PO^ 85% pro Liter 0,85 g MgSO₄. 7 H₉O pro Liter pH-Wert: 4,2 (Regelung mit 10% NaOH) Temperatur: 32° C Belüftungsrate: 80 l/kg ~h Fermentorinhalt: 5 kg

Zu Beginn v/erden 4 1 ITährlösung und 1,2 1 ED in den Reaktor gefüllt, belüftet, temperiert und mit Hefesuspension beimpft. Die Hefepopulation wurde diskontinuierlich bis zum Ansteigen des pH-Wertes und/oder der Gelöstsauerstoffkonzentration des Fermentationsmediums gezüchtet* Zu diesem Zeitpunkt werden 2,5 kg Fermentationsmedium dem Reaktor entnommen und danach 2 1 nährlösung some 0,6 1 ED dem im Reaktor verbleibenden Fermentationsmedium zugeführt,

Die SD-Fermentation wird bis sum Absinken des Anteils sprossender Zellen an der Population auf ca, 30 % und/oder dem Ansteigen der Gelöstsauerstoffkonzentration im Fermentationsmedium geführt.

Erneut v/erden aus dem Reaktor 2,5 kg Fermentationsmedium abgelassen und der Prozeß wird wie bereite beschrieben fortgesetzt.,

Durch Anwendung des beschriebenen Verfahrens wurden die folgenden Prozeßkennziffern erreicht: n-Paraffin

^_x 1-1 g/s

± 2,8g HTS/kg h

Erdöldestillateinsatz 100 ml ED/h

-IO Restparaffingehalt des ED nach der Fermentation 3 >5 Ma,% Stockpunkt des SD nach der Fermentation - 46° C Biomassekonzentration im Ablauf 34 g HTS/ kg mittlere Aufenthaltszeit der Hefezellen im Reaktor 12 h Paraffinnutzungsgrad 86 %

Beispiel 2

Hefen der Art Lodderomyces elongisporus wurden auf Erdöldestillat (EI)) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle semikontinuierlich in einem 10 1 Rührfermentor gezüchtet. Die Fermentationsbedingen waren:

Kohlenstoffsubstratangebot (ED-Angebot): 20 Ma,$ n-Paraffingehalt des ED: 12 Ma,% ITährlösungszusammensetzung: 10,6 g (HH^)₂ S0_d pro Liter 2,0 g KH₂PO₁ ' pro Liter

0,7 g H-PO^ '3552 pro Liter

0,4 g MgSO^ · 7 ^H2° P^{ro Lli;e;r} pH-Wert: 4,2 (pH-Regelung mit 10% UaOH) Temperatur 32° G Belüftungsrate 50 l/kg h Fermentorinhalt 5 kg

Zu Beginn wurden 4 1 Nährlösung und 1,2 1 ED in den Reaktor- gefüllt, belüftet, temperiert und mit Hefesuspension angeiunof t.

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Die Hefezellenpopulation wurde diskontinuierlich bis zum Ansteigen des pH-Wertes und/oder der Gelöstsauerstoffkonzentration gezüchtet* Eine Masse von 2,5 kg der Hefesuspension wird dem Reaktor entnommen und danach 2 1 Hährlösung und 0,6 1 ED dem im Reaktor verbliebenen Fermentationsmedium zugesetzt.

Die SD-Fermentation wird bis zum Absinken des Anteils sprossender Hefezellen an der Population auf ca« 30 % und/oder dem Ansteigen der Gelostsauerstoffkonzentration des Fermentationsmediums geführt.

Erneut wird dem Reaktor die Hälfte des Masseinhaltes entnommen und der Prozeß wie bereits beschrieben fortgesetzt.

Durch Anwendung,.dieser erfindungsgemäßen Lösung wurden folgende Prozeßkennziffem erreicht: n-Paraffin

,0 g/g HTS

_x g

χ 1,35 g HTS/kg h

Erdöldestillateinsatz 100 ml ED/h

Restparaffingehalt des ED nach der Fermentation 3,5 Ma,% Stockpunkt des ED nach der Fermentation - 46° C Biomassekonzentfation im Ablauf 16 g HTS/kg h mittlere Aufenthaltszeit der Mikroorganismen im Reaktor 12h Paraffinnutzungsgrad ⁷^

75

Beispiel 3

Ziel der semikontinuierlichen Zellenzüchtung waren hohe Wachstumsgeschwindigkeiteri, niedrige spezifische Kohlenstoff substratverbräuche, Sauerstoffverbrauche und Wärmebildungen sowie die Auszehrung der zugeführten Kohlenstoff- und Energiequelle„

Hefen der Art Lodderomyces elongisporus wurden auf einem Paraffingemisch der Kettenlänge C.q bis C->_n als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle in einem 10 1 Rührferment or kultiviert,

Folgende Fermentationsbedingungen wurden gewählt:

Paraffinangebot pro Phasenkultur: 11,4 g Paraffin/2 h

Nährlösungszusammensetzung:

9,6 g (MH₄)₂ SO₄ pro Liter

0,9 g K₂CO.. pro Liter

0,7 g H₃PO₁ 85% pro Liter

0,4g MgSOzT₁H₂O pro Liter pH-Wert 4,2 (pH-Regelung mit 10 % ITaOH) Temperatur 32° C Belüftungsrate 80 l/kg h Fermentorinhalt 4 kg

Zu Beginn v/erden 4 1 Nährlösung in den Reaktor gefüllt, temperiert, belüftet und mit Hefesuspension beimpft«, Der Wachstumsprozeß wird bis zur Auszehrung der Kohlen- und Energiequelle, die sich durch Absinken des Anteiles sprossender Zellen auf ca. 20 %, Ansteigen des pH-Wertes, der Gelöstsauerstoffkonzentration des Permentationsmediums, Abfall des Kohlendioxidgehaltes in der Luft, Ansteigen des Sauerstoffgehaltes der Abluft und Absinken der Wärmebildung ankündigt, geführt,

2 kg des Fermentorinhaltes γ/erden dem Reaktor entnommen. Danach werden 2 1 Nährlösung dem im Reaktor verbliebenen Fermentationsmedium zugesetzt. Die Hefepopulation wird erneut bis zur Auszehrung der Kohlenstoff- und Energiequelle kultiviert.

Der SproSzustand der Hefezellen dient der Steuerung des Austausches von Fermentationsmedimn gegen ein äquivalentes Gewicht an Nährlösung, Der Austausch erfolgt beim Absinken des Anteiles sprossender Hefezellen an der Population auf ca, 20 %,

Die Phasenkulturen werden über die Konzentration der Kohlenstoff- und Energiequelle (Paraffinkonzentration) begrenzt. Ein geringfügiger Überschuß der übrigen Nährstoffkomponenten v,a, des Phosphorangebotes und Sauerstoffangebotes in der- Luft führen zu niedrigen spezifischen Materialverbräuchen und Wärmebildungen

Durch Anwendung des beschriebenen Verfahrens wurden folgende Prozeßkennziffern erreicht:

x 5,3 g HTS/kg h

Paraffine X _v 1,08 g Parffin/g HTS Phosphor

dC 9,3 mg Phosphor/g HTS

⁰P X^ 2,2 g 0₂/g HTS x

Wärme _{?>5 kcal/g HTS} (_{31)4 kJ}/_{g HTS})

^' ζ

Aufenthaltszeit der Hefezellen im Reaktor 4 h Biomassekonzentration im Ablauf 21,2 g HTS/kg

Beispiel 4

Ziel der semikontinuierlichen Zellenzüchtung waren hohe Wachstumsgeschwindigkeiten, niedrige spezifische Kohlenstoff sub stratverbräuche, Sauerstoffverbräuche und Wärmebildungen sowie eine vollständige Verwertung der Kohlenstoffund Energiequellen, Hefen der Art Lodderomyces elongisporus wurden auf einem Paraffingemisch der Kettenlänge CLq bis Cp₀ und Saccharose im Verhältnis 15 Ma*% zu 85 Ma.% als Kohlenstoff- und Energiequellen in einem 10 1 Rührfermentor kultiviert.

Die ?ermentationsbedingungen waren: Paraffinangebot pro Phasenkultur: 0,91 g/1,1 h Saccharoseangebot pro Phasenkultur: 8,5 g/1,1 h

Uährlö'sungszusanffiiensetzung: 4,8 g (IH₄)₂SO₄ pro Liter 0,45 g K₂CO₃ pro Liter 0,35 g H₃PO₄ pro Liter 0,2 g MgSO. * 7 H₂O pro Liter pH-Wert 4,2 (pH-Regelung mit 10 % JIaOH) Temperatur 32⁰C

Belüftungsrate 40 l/kg h Permentorinhalt 5 kg

Zu Beginn werden 5 1 Nährlösung in den Permentor gefüllt, belüftet, temperiert, mit Hefesuspension beimpft. Bei Absinken des Anteiles sprossender Zellen nach Durchlaufen eines Maximums auf ca, 20 % werden 2,5 kg Hefesuspension dem Reaktor entnommen und danach 2,5 1 Nährlösung in den Permentor gegeben,

Die Kultivierung der Hefe wird bis zur Auszehrung der Kohlenstoff- und Energiequellen, die sich durch Absinken des Anteiles sprossender Zellen auf 20 %, Ansteigen des pH-Wertes, der Gelöstsauerstoffkonzentration des Fermentationsmediums, Abfallen des Kohlendioxidgehaltes der Abluft, Abfallen der Wärmeproduktion sowie Ansteigen des Sauerstoffgehaltes der Abluft ankündigt, geführt, 2 kg Permentationsmedium werden gegen ein äquivalentes Gewicht Nährlösung ausgetauscht und der beschriebene Prozeß beliebige Male wiederholt, Der Austausch wird nach dem Sproßzustand gesteuert.

Auf diese Art und V/eise wurden folgende Prozeßkennziffern erreicht:

Produktivität 4,55 g HTS/kg h

spezifischer Substratverbrauch 1,74 g/g HTS spezifischer Phosphorverbrauch 7,5 mg/ g HTS spezifischer Sauerstoffverbrauch 1,02 g/ g HTS spezifische V/ärme produkt ion 3,4 kcal/ g HTS 5 Aufenthaltszeit der'Mikroorganismen im Reaktor 2,2 h Biomassekonzentration in Ablauf 10 g/kg

Claims (3)

Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur semilcontinuierlichen Biomassegewinnung auf einer oder mehreren Kohlenstoff- und Energiequellen, dadurch gekennzeichnet, daß das llährmedium, das ifährstoffe für eine bis drei, vorzugsweise für eine Verdopplung der Zellzahl und -masse enthält, in Zeitintervallen zugegeben wird, die gleich der Dauer der Wachstumsphase der synchronisierten Mikroorganismenpopulation ist,

2* Verfahren nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß zum Zeitpunkt der Zuführung des Uährmediums die Hälfte oder mehr als die Hälfte, vorzugsweise die Hälfte des Permentationsmediums abgelassen wird und eine äquivalente Menge von Mhrmedium zugegeben wird»

3» Verfahren nach Punkten. 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß das mikrobielle Wachstum durch die Kohlenstoff- und Energiequelle begrenzt wird und ein niedriger Überschuß aller anderen für das Wachstum essentiellen Elemente eingehalten wird.

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