DE1642690A1 - Fermentationsverfahren zur Gewinnung von extracellularen Aminosaeuren - Google Patents

Description

Dr. K. Th. Hegel Dr. H. Meys

Patentanwälte

Telefon 89 2S O3 Telegramm-Adresse: Dollnerpatent

2OOO Hamburg 62

Giesestr. β Postfach 52Ο 38Ο

8. Mai I967 Dr.M./Tou.

ESSO RESEARCH GND ENG.CO

Beschreibung

ESSO RESEARCH AND ENGINEERING COMPANY Elizabeth, New Jersey, (V.St.A.)

Hermentationsverfahren zur Gewinnung von extracellularen Aminosäuren

Für diese Anmeldung wird die Priorität vom 25· Mai I966 aus der USA-Patentanmeldung Serial No. 552,726 in Anspruch genommen.

Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung /on extracellularen Aminosäuren und betrifft insbenondere die Herstellung von extraeellularen /Uriirr,.;äurc-n in einem unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen fj.u reu lyjA'xhvlea Perm en ta tlons verfahren. Das erfind ungs gemäße ahren ermöglicht e,^r:>₃ qualitativ hochwertige extracellular

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Aminosäuren in hohen Ausbeuten de.durch zu gewinnen, daß nrui eine spezielle Kohlenwassersboffraktion in Verbindung mi ο einem Organismus einsetze. PIs Fraktion verwendet m-ui eine solche Kohlenwasse-rs 'eof fraktion, aie einen hohen Clef ingehalt aufweist, wobei die; Olefine zv,^Tischen etwa 15 bis 22 Kohlenstoff atome, vorzugsweise 17 bis 19 Kohlenstoff& tome im Molekül enthalten.

Bisher mußten für die mikrobiologische Gewinnung von extrazellulären "minosäuren, wie beispielsweise Lysin oder Glutaminsäure und dergleichen aufwendige Substrate und Vorverbindungen, die der Fermentationsbrühe zugesetzt werden mußten, verwendet v/erden. Dabei war en jedoch die Ausbeuten für die Mehrzahl der extrazellulären Aminosäuren, die bei diesen bekannten Verfahren erziele wurden, sehr gering, und die Geschwindigkeit der .Anreicherung an Produkt lag ebenfalls sehr niedrig. Der Erfindung liegt demzufolge die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von extracellularen Aminosäuren zu schaffen, bei dem man ein spezielles, wenig aufwendiges Substrat einsetzen kann, das durch Mikroorganismen in einfacher Weise zu Aminosäuren mio hoher Ausbeute umgesetza werden kann.

Es ist bekannt, d&ß man Eiweiß für Ernährung^zwecke biologisch unter Anwendung einer Mikroorganismen-Kultur und eines Erdöl-Substrates synthetisieren lcnnn. Diese Synthese wird üblicherweise in einem wäßrigen Biosynthese-Bad durchgefüurc, das eine Kohlenw^sserstoff-fiuGgfUifssubsu-'nz enthält., :nit dein darauf zu züchtenden Mikroorgi-alsmus beimpft ist und ein v;^:i;3riges Nähruiedlutn, Sauerstoff und sonstige notwendige?

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i-r-hrungsstoffe besitzt. Bei dieser Arbeitsweise kann man Kohlenwasserstoff-Ausgangssubstanzen einsetzen, die weniger aufwendig als Kohlenhydrate sind und die üblicherweise keine aufwendigen Wachstumsfaktoren, wie Vitamine, Aminosäuren und dergleichen für ein sicheres und gutes Wachstum der Mikroorganismen-Zellen benötigen. Nachdem die Synthese vollständig durchgeführt ist, wird das Protein in einer geeigneten Weise von der Gärbrühe getrennt. Die Gärbrühe enthält bei den üblichen Fermentations-Techniken geringe Mengen an Aminosäuren, üblicherweise nicht mehr als 0,5 g je Liter.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden hohe Ausbeuten an gewünschten .Aminosäuren erzielt, wobei ein Kohl enwasserstoff subs trat; mit einem hohen Gehalt an Olefinen, deren Anzahl an Kohlenstoffatomen im Bereich von etwa 15 bis 22, vorzugsweise etwa VJ bis 19 Kohlenstoffatomen, liegt, eingesetzt. Das für die Kultur der vorgenannten Art der Erfindung verwendete Nährmedium sur Herstellung der /.rnino-'säuren kann beträchtlich variieren; es sollte jedoch darin zusätzlich zu dem Kohlenwasserstoffsubstrat als im wesentlichen einzige Kohlenstoffquelle eine Stickstoffquelle und Hiaex^e Is al ze vorhanden sein. Wie zuvor angegeben, dient als Kohlenwasserstoffsubstrat vorzugsweise eine Olefin-Praktion mit '■'[ bis 19 Kohlenstoffatomen im Molekül.

Die verwendete Kohlenwasserstoffraktion sollte in einem Überschuß von etwa 95> vorzugsweise etwa 98 bis 100 % der Olefine vorliegen. Die Menge an Olefin-Kohlenwasserstol'ffriktiori, die ιη?.·η einsetzt, sollte so bemessen sein, daß in

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der GUrbrühe eine Olefinkonzentration im Bereich von etwa 0,1 bis 30 Gew.$, vorzugsweise etwa 1,0 bis K₃O Gew.%, beispielsweise 2 Gew./»'j vorhanden ist.

Es istbekannt, in Fermentationsverfahren verschiedene biologische Katalysatoren zu benutzen. So kann man das biosynthetische Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Biosynthese allerMikroorganismen, einschliesslich Bakterien und Hefen, die die Fähigkeit haben, auf C,_[t- bis C^-Glefinltohlenwasserstoff-.Ausgangssubstanzen zu wachsen, anwenden. Uenneleich das erfindungsgemäße Verfahren für eine große Gruppe von Mikroorganismen brauchbar ist, gibt es neun Mikroorganismen, die sich ganz besonders für die Assimilrtion von Kohlenwasserstoffen eignen. Diese Mikroorganismen sind nachstehend mit ihren entsprechenden A .T.C.C.-Registriernummern, die erhalten wurden dadurch, daß Proben bei der American Type Culture Collection in Washington, D.C. niedergelegt wurden, zusammengestellt.

Namen der Mikroorganismen A.T.C.C.-Hummer

Micrococcus cerificans !^987

Pseudomonas ligustri 15522

Fseudomonas pseudomallei 155^5

Pseudomonas orvilla 15524

Alcaligenes sp. 15525

Cellumonas galba 1552b

Brevibacterium insectiphilium 15528 Corynebacterium so. - = Corynebacteriurn pourometaboIum

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PUr das erfindungsgemäße Verfahren ganz speziell geeignete Organismen sind jedoch folgende:

(a) Aspergillus flavus 9I7O

(b) Brevibacterium incertum 8363

(c) Micrococcus rosens I78

(d) Nocardia erythropolis 4277

(e) Pseudomonas riboflavina 9526

Diese Organismen haben folgende bestimmte Eigenschaften:

(a) Sehr ähnlich dem Stamm von Aspergillus flavus; rasch ausbreitende Kolonien - gelb bis gelblich grün bis bräunlich grün mit zunehmendem Alter; Sporen lose strahlenförmig und kolonnenartig; Bläschen gewölbeartig geformt, Coridide. birnenförmig und rauh; Quelle- aus Boden isoliere.

(b) ivhnelt sehr stark dem Stamm von Brevibacterium incertum; gram-variable kurze Stäbchen von etwa. 1,5 Mikron, nicht beweglich; Gelatine - keine Verflüssigung; Nähragar dünnes, grau-weißes, geringes Wachstum; Brühe - etwas Wachstum; Lackmuslösung - keine änderung; Indol - nicht gewonnen; ILS - nicht gewonnen; Glucose - Säure, kein Gas; Saccharose Säure, kein Gas; Maltose - Säure, kein Gas; Nitrite aus Nitraten nicht gewonnen; Quelle - aus Boden isoliert.

(c) Ahnelt r-jehr stark dem Stamm von Micrococcus rosonrj; rx^m- /nrihbl-e Kokken, nicht beweglich, ungefähr i,5 Mikron ir.-j iAironrne.sGer·; .' par-Kolonient kreisförmig, >/oilstän~ clir;, i-i'V- \ iSrUhfj: etwar; Trübung, rosafarbenes Sediment;

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Mannitol - sauer; aus Nitraten werden Nitrite hergestellt; 'T-Is Stickstoff quelle wird HHuHpPO^ verwendet; Quelle - aus Boden isoliert.

(d) Ähnelt sehr stark dem Stamm von Noeardie erythro^olis; langfaserig, gram-positiv, nichu sauer; Gelatine - keine Verflüssigung, faserförmige Funktitrlinie; Ag-r-Koloriien rund, 2 bis 3 mro_ Durchmesser, v.'äßrig weiß; Brühe - schwaches Wachstum; LackmusIosung - keine Reaktion, jedoch rosafarbene Häutchen; Glucose - keine Säure; Lactose - keine Säure; Saccharose - keine Säure; Nitrate - nicht produziert; Quelle c-.us Boden isoliert.

(e) Sehr ähnlich dem Stamm von Pseudcrnona.s riboflavina; bewegliche dünne gram-negative Stäbchen; Gelatine keine Verflüssigung; Hefeextrskt - Glucose - Brühe - klebrig zäh; Lackmuslösung - langsamer Stärke abbau j -sus Nitraten werden Nitrite gewonnen; J-IRVP (Methylrot Voges-Proskauer)-Prüfung - negativ; Mannitol - keine Säure oder Gas; Saccnarose - keine Säure oder Gas; Lactose - keine Säure oder Gas; Maltose Iceine Säure oder Gas; Harnstoff - nicht gebraucht; Stärke nicht hydrolysiert; Quelle - aus Boden isoliert.

Säuerstoff wird dem Mährmedium in einer beliebigen Form, in der er von dem aufgeimpften Mikroorganismus einfach assimiliert werden kann, zugegeben. Es können sauerstoffhaltige Verbindungen verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie das Wachstum der Mikroorganismen-Zellen tmd CIe !Jmwf-.nälung der Kohlenwasserstoff-Wahrung in imzvoov^i.nlßt\e:i -Γ-olleri nicht negativ beeinflussen. Sohr ^'e^cniiäir rlv\. ü-^ä-ou La Joiva eines sr-uei'Stoffh^-lCif-'en G-^ses, beLs ■ieisv.el^^ Lia'w die

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zwischen etwr 19 und etwa 22 Gew.;£ Sauerstoff enthält, zugegeben. Veimcleich man vorzugsweise Luft verwendet, kann men r-.uch mit Sauerstoff rngereicherte Luft, die uehr als 22 Gew.-5 ■Γ.Π Sauerstoff enth'ilc, einsetzen. Im allgemeinen werden zwischen ear 0,1 und iO, vorzugsweise zwischen etwa O₃L und eiw 2,5 Volumen ε.η Luft je Minute und je Volumen des vorhcndenen flüssigen Biosynthese-Bades dem Real·:tor zugeführt.

Stickstoff ist wesentlich für das biologische Wachstum. Als Stickstoffquelle kann man irgendeine beliebige organische oder anorganische Stickstoff enthaltende Verbindung einsetzen, aus der der Stickstoff in einer solchen Form frei xvird, daß er von den wachsenden Mikroorganismen für den Stoffwechsel brauchbar ist. In die Gruppe solcher organischer Stickstoff enthaltender Verbindungen, die man für die vorliegenden Zwekke verwenden kann, fallen beispielsweise Proteine, säureaydrolysierte Proteine, enzymatisch aufgeschlossene Proteine, Aminosäuren, Hefeextrakte, Asparagin, Harnstoff usw. Aus wirtschaftlichen Gründen verwendet man gewöhnlich vorzugsweise anorganische Verbindungen, wie beispielsweise Ammoniak, Ammoniumhydroxyd oder dessen Salze, wie beispielsweise Ammoniumphosphat, Ammoniumeitrat, Ammoniumsulfat, saures /.mmoniumphosphat, usw. Eine sehr angenehme und günstige Methode der Stickstoffzugabe ist die Verwendung von Ammoniumhydroxyd, Ammoiiiumphosphat oder saurem Ammoniumphosphat, die als solche als Salze zugegeben werden oder in dem wäßrigen Gärnedium in situ durch Hindurchleiten von gasförmigem Ammoniak durch die Brühe, zu der man zuvor Phosphorsäure zugegeben hat, gewonnen werden können, wobei sich saures Ammonium-

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phosphat bildet.

Zusätzlich zu der Energiequelle und der Stickstoffquelle ist es erforderlich, die notwendigen Mengen an ausgewählten Mineral-Nährmittel dem Nährmedium zuzugeben, damit man ein gutes Wachstum der Mikroorganismen und eine maximale Selektivität erreicht, d.h. eine guce /ssimilation der Kohlenwasserstoffe durch die Mikroorganismen-Zellen. Demzufolge sind in dem wäßrigen WachstumsmediuM Kalium, Natrium, Eisen, Magnesium, Calcium, Mangan, Phosphor und andere Nährstoffe enthalten. Diese notwendigen Materialien können in Form ihrer Salze, vorzugsweise in Form ihrer wasserlöslichen Salze zugefügt werden. Beispielsweise kann man Kalium als Kaliumchlorid, -phosphat, -sulfat, -citrat, -acetat, -nitrat, usw. zugeben. Eisen und Phosphor können in Form der Sulfate bzw. Phosphate beigegeben werden, beispielsweise als Eisensulfet oder Eisenphosphat. Gewöhnlich wird die größte Menge des Phosphors als Ammoniumphosphat zugesetzt.

Zur weiteren Illustration der Erfindung wurden die fünf zuvor beschriebenen Organismen in einem wie beschriebenen Fermentationsprozeß verwendet. Die Brühe wurde von den Zellen abgetrennt, und die Aminosäuren wurden wie folgt von der Brühe separiert:

Die Bakterienzellen und sonstigen Verunreinigungen wurden durch Zentrifugieren entfernt, und die Menge Jeder in der Brühe vorhandenen Aminosäure wurde l.iliioels der folgenden mikrobiologischen Untersuchungsmethoden bestimmt. Eine solche Serie an Versuchsmethoden ist in der zweiten Auflage von "Microbiological Assay ο,.' the Vitamin B-Comulex rna At.iino

/icidr:" (I952), von E.C.Barton Wright, Pitman Fubliuhinr CV., 109819/0274

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New York, Hew York, beschrieben. Eine weitere Versuchsmethode ist der"Technicon Amino Acid Analyzer".

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle veranschaulicht:

Tabelle I

Fünf Mikroorganismen (Bacteria, Actinomyeetes, Molds), die auf Mineralsalz-Medien mit C „ bis C._q- u-01efinen

als einzige C-Quelle sich entwickelt hatten, produzierten große Mengen an extracellularen Aminosäuren.

Orrsnismen	Gesamtmenge an extracellu laren Amino säuren g/l	einzelne interessante Aminosäuren mg/l
Micrococcus rosens	2,168	Lysin, 782
Uocardia erythropolis	3,023	Lysin, 619ί Glutamin säure, 329
Pseudomonas riboflavina	3,92	Lysin, 743> Glutamin säure, 444
Aspercillus flavus	2,74	Arginin, 505
Br eν i ba c t er ium incertum	2,927	Arginin, 532

Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß unerwartet hohe /-usbeuten -/on qua-litativ hochwertigen Aminosäuren mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen werden können.

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Claims (1)

1. Dr. K. Th. Hegel _{2000 HambulB 52} Jb42690

   DT. H. MeVS Gieseetr.s

   ■ ._ Postfach 52O 58O

   Patentanwälte JQ

   Telefon 89 28 O3 Telearamm-Adresee: Döllnerpatent

   ESSO RESEARCH AND ENGINEERING COMPANY

   Patentansprüche

   Patentansprüche

   1. Fermentationsverfahren zur Herstellung von extraeellularen Aminosäuren, unter Verwendung einer Kohlenwasserstoffraktion in einer aus einem wäßrigen anorganischen Salz als Wachstumsmedium, einem Sauerstoff enthaltenden Gas und einem Mikroorganismus bestehenden Gärlösung, unter das Wachstum fördernden Fermentationsbedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoffraktion eine solche einsetzt, die einen hohen Gehalt an Olefinen aufweist, und als Mikroorganismen solche verwendet, die fähig sind, auf dieser Olefinfraktion zu wachsen.

   2. Fermentationsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzte Kohlenwasserstoffraktion einen Überschuß von 95 % an Olefinen aufweist und diese Olefine etv/a 15 bis 22 Kohlenstoff a tome im Molekül enthalten.

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   ~y. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kohlenviasserstoffraktion einsetzt, die die Olefine in einer Konzentration im Bereich von etwa 98 bis 100 % enthäl υ.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Olefine in einer in der Gärbrühe eine Konzentration im Bereich von O, i bis etwa j?0 Gew.i& sichernden Menge einsetzt.

   3. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man \ die Olefine in einer in der Gärbrühe eine Konzentration im Bereich von etwa 1,0 bis etwa 4,0 Gev;.^ sichernden Menge einsetzt; .

   6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5j dadurch gekennzeichnet, daß nan als Mikroorganismen bakterielle Mikroorganismen verv'endet.

   7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet, daß :.ia.n als Mikroorganismen solche aus der Klasse von A.sperßillus flavus, Brevibacterium incertum, Micrococcus rosens, Kocardia erythropolis oder Pseudomonas riboflavine. einsetzt.

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