DE1912797A1

DE1912797A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsaeure

Info

Publication number: DE1912797A1
Application number: DE19691912797
Authority: DE
Inventors: Kazuo Kimura; Katsunobu Tanaka; Masaki Yamamoto
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-03-09
Filing date: 1969-03-07
Publication date: 1969-09-18
Also published as: DK119873B; NO126923B; SE357386B; CH496094A; NL6903525A; DE1912797C3; GB1208874A; DE1912797B2; FR2003585A1; US3711373A

Description

Verfahren zur wirtschaftlichen Herstellung von L-G-lutaminsäure durch Fermentation in industriellem Maßstäbe, wobei Corynebacterium alcanum ATCC 21194, Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 oder Brevibacterium butanicum ATCC 21196 in einem wässrigen, einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium gezüchtet wird. Die Verwendung von gasförmigen Kohlenwasserstoffen, wie z.B. Äthan, Propan und Butan, macht das Verfahren wirtschaftlich interessant. Der Zusatz eines nichtverwertbaren Kohlenwasserstoffs, eines oberflächenaktiven Mittels oder eines Antibiotikums zu dem Medium beschleunigt die Fermentation und fördert die Erhöhung der Ausbeute- an L-G-lutaminsäure.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-G-lutaminsäure, insbesondere durch Fermentation und speziell unter Verwendung neuartiger Stämme, die zur Assimilierung von Kohlenwasserstoffen, speziell gasförmigen Kohlenwasserstoffen, befähigt sind.

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Vor dieser Erfindung sind bereits Verfahren zur Herstellung von L-G-lutaminsäure unter Verwendung von wenig kostspieligen Kohlenwasserstoffen als Ausgangs-Kohlenstoffquelle geprüft worden, und es wurde auch bereits über die Ergebnisse mit Bakterien berichtet, welche die Fähigkeit besitzen, L-G-lutaminsäure aus η-Paraffinen zu produzieren. Als Ergebnis weiterer Untersuchungen wurden nunmehr neue Arten von Bakterien aufgefunden, die imstande sind, L-Glutaminsäure aus gasförmigen Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstoffquelle in hoher Ausbeute zu produzieren. Bin solches Verfahren ist deshalb von speziellem Vorteil, weil L-Glutaminsäure eine höchst brauchbare Substanz sowohl auf' dem biochemischen Gebiet, als auch auf dem Nahrungsmittelsektor ist.

Ziel "der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung der brauchbaren Aminosäure L-Glutaminsäure, das die Nachteile und Mängel der bisherigen Verfahren ausschaltet.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-G-lütaminsäure durch Fermentation, das in wirksamer und verhältnismäßig einfacher Weise durchgeführt werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren .zur Her,-stellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation, das vorteilhaft in industriellem Maß stäbe und mit geringen .Unko^en _?.aus wenig kostspieligen Materialien unter Erzielung, hoher.Produkt ausbeuten durchgeführt werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die wie oben angegeben hergestellte L-G-lutaminsäure.

Biese und weitere Ziele und Vorteile der Erfindung gehen für den Fachmann aus der folgenden Beschreibung und den Patentansprüchen hervor.

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Die Fermentation unter Verwendung der neuartigen erfindungsgemäß beschriebenen Mikroorganismen-Arten, sowie der gasförmigen Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle, hat insbesondere zahlreiche Vorteile hinsichtlich der industriellen Produktion von L-Glutaminsäure im Vergleich zu den üblichen Fermentationen, bei denen zuckerhaltige Materialien oder flüssige Kohlenwasserstoffe als Ausgangsmaterial verwendet werden; zu diesen erfindungsgemäßen Vorteilen gehört z,B. (1) daß das als Kohlenstoffquelle verwendete Ausgangsmaterial im Überfluß vorhanden und wenig kostspielig ist, (2) daß die Lagerung und der Transport des Ausgangsmaterials, sowie dessen Zufuhr zum Züchtungsmedium leicht ausgeführt werden können, (3) daß die Wiedergewinnung des restlichen Ausgangsmaterials bequem ist, (4) daß die Regelung der Konzentration der Kohlenstoff quelle während der Züchtung leicht ist, (5) daß die Züchtungsflüssigkeit nach Beendigung der Fermentation klar ist und (6) daß die Abtrennung und Reinigung des Produktes von dem zurückbleibenden Material auf verhältnismäßig einfache Weise durchgeführt werden kann. Aus diesen Gründen ist anzunehmen, daß das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem L-Glutaminsäure direkt aus gasförmigen Kohlenwasserstoffen durch \ Fermentation unter Verwendung der vorliegenden neuartigen Mikroorganismen-Arten produziert wird, das am wenigsten kostspielige L-G-lutaminsäure-Herstellungsverfahren darstellt, welches jemals beschrieben worden ist.

Die¹'neuartigen Mikroorganismen-Stämme, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, sind als Corynebacterium alkanum, Brevibacterium butanicum und Brevibacterium paraffinolyticum bezeichnet worden. Sie sind natürliche Isolate aus dem Boden und besitzen die folgenden bakteriologischen Merkmale:

Gorynebacterium alkanum

A) Morphologische Eigenschaften:

Form des Bakteriums: Gewöhnlich werden kurze. Stäbchen, häufig unvollkommene Spaltzellen, verästelte Zellen und Zellen vom Knicktyp (engl. snapping-type) festgestellt. Größe: 0,5 x 2,5 - 5,0 Mikron

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_₄_ 191279?

Beweglichkeit: unbeweglich Sporen: nicht ausgebildet Geissein: nicht ausgebildet Gram-Färbung: positiv Säurefestigkeit: nicht säurefest

B) Züehtungseigenschaften :

(1) Agar-Kolonien, mittleres Wachstum, kreisrund·, glatt, vollständig, konvex, gelblich-grau, glitzernd und opak.

(2) Schrägagar, mittleres Wachstum, fadenförmig, glitzernd, gelblich-grau, geruchlos, butyrös; das Züchtungsmedium wird nicht verändert.

(3) Nährbrühe, das Oberflächenwachstum ist schwach, mäßig trübe. ■ .

(4) G-elatine-Stichkultur, kein Wachstum oder nur dürftig an der Oberfläche j keine Gelatine-Verflüssigung.

C) Physiologische Eigenschaften:

(1) Optimaltemperatur: 25° - 3O⁰C (das Wachstum bei 35⁰C ist gering).

(2) Optimal-pH: 5,0 - 9,0 (kein Wachstum bei pH 4,0).

(3) Säuerstoff-Bedürfnis: aerob

(4) Lakmus-Milch: nicht verändert oder alkalisch

(5) Schwefelwasserstoff: wird erzeugt

(6) Indol: nicht erzeugt

(7) Stärke: wird nicht abgebaut

(8) Nitrite werden aus Nitraten erzeugt.

(9) Katalase: positiv

(10) Ammonium-Produktion: negativ (ti) Voges-Proskauer Test: negativ

(12) Nutzbarmachung von Zuckern: Säure wird aus Glucose, Fructose, Mannose, Sucrose, Lactose, Mannit und Sorbit erzeugt.

(13) Assimilatorische Eigenschaft für Kohlenwasserstoffe: aesimilie.vt Propan, η-Butan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecas, n-Pentadecan, n-Hexadecan und n-Heptadecan.

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Brevibacterium butanicum

(A) Morphologische Eigenschaften: ·

Form des Bakteriums: Gewöhnlich werden kurze, stabförmige Zellen, häufig unvollständige Spaltzellen und solche vom Knicktyp festgestellt, jedoch keine verästelten Zellen.
Größe: 0,5 x 3,0 - 6,0 Mikron
Beweglichkeit: unbeweglich
Sporen: nicht ausgebildet
Geissein: nicht ausgebildet
Gram-Färbung: positiv
Säurefestigkeit: nicht säurefest

(B) Züchtungseigenschaften:

(1) Agarkolonien, reiches Wachstum, kreisförmig? glatt, vollständig, buckelartig, blaßbraun, stumpf und opak.

(2) Schräg-Agar, reiches Wachstum, igeiförmig, stumpf, blaßbraun, geruchlos, butyrös, das Züchtungsmedium wird nicht verändert.

(3) Nährbrühe, das Wachstum an der Oberfläche ist membranartig, fast klar, keine Ablagerung.

(4) Gelatine-Stichkultur, das Wachstum des oberen Teiles ist besser als das des unteren und es wird keine Verflüssigung beobachtet.

(C) Physiologische Eigenschaften:

(1) Optimal-Temperatur: 25° - 30⁰C (das Wachstum bei 37⁰C ist dürftig).

(2) Optimal pH : 6,0 - 9,0

(3) Säuerstoff-Bedürfnis: aerob

(4) Lakmus-Milch: nicht verändert oder alkalisch

(5) Schwefelwasserstoff: wird produziert

(6) Indol: nicht produziert

(7) Stärke: wird nicht abgebaut

(8) Nitrite werden aus Nitraten erzeugt

(9) Katalase: positiv

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(10) Ammoniumproduktion: negativ

(11) Voges-Proskauer Test: negativ

(12) Nutzbarmachung von Zuckerns Säure wird produziert aus Glucose, Fructose, Arabinose, Mannose, Sucrose, Xylose, Mannit und Sorbit.

(13) Assimilatorische Eigenschaft für Kohlenwasserstoffet assimiliert Propan, η-Butan, n-Decan, n-Uhdecan, n-Dodeean, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan und n-Heptadecan.

Brevibacterium paraffinolyticum

(A) Morphologische Eigenschaften:

Form des Bakteriums: Stäbchen, häufig werden Spaltzellen vom Knicktyp festgestellt, Jedoch keine verästelten

Zellen beobachtet.

Größe; 0,5 x 2,5 - 5,0 Mikron Beweglichkeit; unbeweglich Sporen: nicht„ausgebildet Geissein: nicht ausgebildet Gram-Färbung: positiv Säurefestigkeit: nicht säurefest

(B) Züchtungseigenschaften:

(1) Agar-Kolonien, reiches Wachstum, kreisförmig, glatt, vollständig, konvex bis kopfförmig, blaßrosa, glitzernd und undurchsichtig

(2) Schräg-Agar, reiches Wachstum, fadenförmig, glitzernd, gelblich-grau, geruchlos, butyrös;

das Züchtungsmedium wird nicht verändert.

(3) Nährbrühe, das Wachstum auf der Oberfläche ist schwach und mäßig trübe.

(4) Gelatine-Stichkultur, kein Wachstum oder nur schwaches an der Oberfläche j nicht verflüssigt.

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(C). Physiologische Eigenschaften:

(1) Optinial-Temperatur: 25° - 30⁰C (das Wachstum bei 35⁰G ist äußerst gering).

(2) Optimal-pH: 5,0 - 9,0 (Wachstum ist bei pH 4,0 . nicht bemerkbar).

(3) Sauerstoff-Bedürfnis: aerob

(4) Lakmus-Milch: nicht verändert oder alkalisch

(5) Schwefelwasserstoff: Wird erzeugt

(6) Indol: wird nicht erzeugt

(7) Stärke: wird nicht abgebaut

(8) Nitrite werden aus Nitraten erzeugt

(9) Katalase: positiv

(10) Ammonium-Produktion: negativ

(11) Voges-Proskauer Test: negativ

(12) Nutzbarmachung von Zuckern: Säure wird erzeugt aus Glucose, Fructose, Sucrose, Lactose, Mannit und Sorbit.

(13) Assimilatorische Eigenschaft für Kohlenwasserstoffe: assimiliert Propan, η-Butan, n-Undecan₉ n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan und n-Heptadecan.

Auf der Grundlage der oben angeführten Eigenschaften wurde die taxonomische Einordnung von Corynebacterium alkanum geprüft unter Berücksichtigung von "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7.Ausgabe (1957). Dieser Mikroorganismus gehört zur Familie der Corynebacteriaceae seiner stabförmigen Zellen wegen, die nicht säurefest sind und wegen der Nicht-Ausbildung von Triehomen, wegen der Gram-positiven Eigenschaft, der Nichtausbildung von Endosporen, der Bildung von verzweigten Zellen und der Tatsache, daß Zucker nicht aerob fermentiert werden. Ferner gehört dieser Stamm zur Gattung Corynebacterium wegen der rundlichen und knickförmigen Spaltzellen und der positiven Katalase-Eigenschaft, die für diese Familie.charakteristisch ist. Der Stamm steht Corynebacterium agropyri und Corynebacterium rathayi unter den Arten

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innerhalb der Gattung Corynebacterium ganz nahe. Dennoch ist dieser Stamm, wie in Tabelle 1 gezeigt wird, von Corynebacterium agropyri verschieden, und zwar hinsichtlich seiner Größe, der Gram-Färbungs-Eigenschaft und des Wachstums in einer Bouillon-Schrägagarkultur. Er ist auch verschieden von Gorynebacterium rathayi hinsichtlich Größe, Wachstum und Gelatine-Verflüssigung. Weiterhin ist er von den oben erwähnten zwei Arten verschieden wegen seiner Koloniebildungs-Eigenschaften und seiner Fähigkeit, gasförmige und flüssige Kohlenwasserstoffe zu assimilieren. Dieser Stamm ist also offensichtlich eine neue Art und wurde daher Gorynebacterium alkanum benannt.

Die taxonomisehe Einordnung von Brevibacterium butanicum wurde nach der gleichen Methode bestimmt wie oben beschrieben. Es gehört zur Familie der Brevibacteriaceen der stabförmigen Zellen wegen, weil es nicht säurebeständig ist, keine Trichome bildet, wegen der grampositiven Eigenschaft, der Nicht-Ausbildung von Endosporen und der Tatsache, daß nicht-verzweigte Zellen gebildet werden. Ferner gehört es zur Gattung Brevibacterium wegen der nicht verzweigten Stäbchen, die keine Fäden bilden. Dieser Stamm wird als sehr naher Verwandter von Brevibacterium maris, Brevibacterium fuscum und Brevibacterium ammoniagenes innerhalb dieser Gattung angesehen. Dennoch ist dieser Stamm, wie in Tabelle 2 gezeigt wird, (a) verschieden von Brevibacterium maris hinsichtlich seiner Größe, des Farbtones, der Höhe der Agarkolonien, der Produktion von Schwefelwasserstoff und der Wirkung auf Sucrose, (b) verschieden von Brevibacterium fuscum hinsichtlich Größe, Farbton, Höhe der Agarkolonien, des Wachstums in einer Gelatine-Stich- und in einer Bouillonkultur und (c) verschieden von Brevibacterium ammoniagenes hinsichtlich seiner Größe, der Höhe der Agarkolonien und des Farbtons seiner Kolonien. Weiterhin ist dieser Stamm verschieden von zwei dieser Arten in Bezug auf die Beschaffenheit im Schrägagar und hinsichtlich der Fähigkeit, gasförmige und flüssige Kohlenwasserstoffe zu assimilieren. Daher wird er als eine

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neue Art von Mikroorganismus betrachtet und als Brevibaeterium butanicum bezeichnet.

Die taxonomische Einordnung von Brevibaeterium paraffinolyticum wurde auf die gleiche Weise vorgenommen wie oben beschrieben. Es gehört zur Familie der Brevibacteriaceen wegen seiner stabförmigen Zellen, weil es nicht säurebeständig ist, keine Trichome bildet, eine grampositive Färbung aufweist und keine Endosporen oder nichtverzweigten Zellen bildet. Es gehört zur Gattung Brevibaeterium der nichtverzweigten Zellen wegen, die keine Fäden bilden. Es ist nahe verwandt dem Brevibaeterium maris, Brevibaeterium fuscum und Brevibaeterium ammoniagenes innerhalb der Stämme dieser Gattung. Dennoch, wie in Tabelle 2 gezeigt wird, ist es verschieden von Brevibaeterium maris (a) hinsichtlich seiner Größe, des Farbtones, des Wachstums in einer Bouillon-Kultur, der Wirkung auf Sucrose und der Produktion von Schwefelwasserstoff, (b) verschieden von Brevibaeterium fuscum hinsichtlich Größe und Wachstum in einer Gelatine-Stichkultur und verschieden (c) von Brevibaeterium ammoniagenes nach Größe und Farbton. Weiterhin ist dieser Stamm verschieden von zweien dieser Arten in Bezug auf seine Beschaffenheit im Schrägagar und hinsichtlich seiner Fähigkeit, gasförmige und flüssige Kohlenwasserstoffe zu assimilieren. Daher wird dieser Stamm ebenfalls als eine neue Art betrachtet und Brevibaeterium paraffinolyticum benannt. Schließlich wird dieser Stamm für unterschiedlich von Brevibaeterium butanicum gehalten, und zwar wegen Farbton, Glanz und Fähigkeit, Zucker zu verwerten.

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Tabelle

Verwertung von Zuckern Glucose

Sucrose Lactose

	Corynebacterium agropyri	■	Corynebacterium rathayi	Corynebacterium alkanum
Größe	0,4-0,6 χ 0,6-1,1 Mikron	0,6-0,75 x 0,75-1,5 Mikron	0,5 x 2,5-5,0 Mikron
Farbton in einer Bouillon-S ehrag- agar-KUltur	gelb	gelb	gelblich-grau
Gram-Färbung	variabel	positiv	positiv

produziert Säure ] produziert Säure produziert Säure
produziert Säure
produziert Säure

{ produziert Säure I produziert Säure \ produziert Säure

Stärke-Abbaufähigkeit

™ Gelatine-Stich-Kultur

schwach keine

nicht verflüssigt graduell verflüssigt
nach 7 Wochen

■ nicht verflüssigt

Farbton und Wachstum in einer Bouillon-Agarplattenkultur

gelb I schwach !j sehr viskoses 1_ Wachstum gelb ,

> langsames
■■ Wachstum

gelblich-grau _ mittleres Waohtiun butyrös

CD I Ν)' TCD

a b e 1 1 e 2

Brevibacterium Brevibacterium Brevibacterium Brevibacterium Brevibacterium xaaris fuscum ammoniagenes paraffinolyti- butanicum

cum

Größe

0,7-0,8 χ

. 0,6 χ 1,5

1,0-1,2 Mikron i Mikron

: 0,8 χ 1,4-1,7 I Mikron

0,5 x 2,5-5,0 Mikron

0,5 χ 2,5-5,0

Mikron

Bouillon-Agar-i orange-gelb; Plattenkultur : konvex

bräunlich-gelbji grau oder leicht konvex [ hellgelb ; i flach

hellrosa; konvex bis kopfförmig

hellbraun; bücke If b'rmig

G-elatine-Stichkultur

nicht verflüssigt

graduell verflüssigt

nicht verflüssigt

nipht verflüssigt

nicht verflüssigt

O CD OD

Nährbrühe

klar mit orange

Häutchen und Sediment

Irübung mit Häutchen und S ediment

mäßige Trübung nahe der Oberfläche

geringes Oberflächenwachstum; mäßig wolkig

von Zuckern Sucrose

Lactose

keine

keine produziert Säure

produziert Säure

prO'duziert Säure

produziert Säure

Schwefelwasserstoff

nicht produ ziert produziert

produziert

Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen neuartigen Stämme sind bei der American Type Culture Collection hinterlegt, und ihnen sind die folgenden Bezeichnungen gegeben worden:

Corynebacterium alkanum ATCC 21 194 Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21 195 Brevibacterium butanicum ATCC 21 196

Es kann erfindungsgemäß entweder ein synthetisches oder natürliches Nährmedium verwendet werden, solange es die für das Wachstum des speziell verwendeten Stammes notwendigen Nährstoffe enthält, und solange es wegen der Kohlenwasserstoff-Assimilationseigenschaften der hier verwendeten Stämme einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthält. Derartige Nährstoffe sind dem lachmann bekannt und sie umfassen Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoff quelle, anorganische Verbindungen und dergl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen nutzbar gemacht werden.

Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann man als Kohlenstoffquelle sowohl gasförmige als auch flüssige Kohlenwasserstoffe verwenden. Es werden gasförmige Kohlenwasserstoffe mit 2-4 Kohlenstoffatomen verwendet, wie z.B. Äthan, n-Propan, Isopropan, η-Butan, sec-Butan, Isobutan und tert-Butan. Flüssige aliphatische Kohlenwasserstoffe mit 5-18 Kohlenstoffatomen sind geeignet, z.B. n-Pentan, n-Octan, n-Decan, n-Dodecan, n-Hexadecan, Isopentan, Isooctan, usw., Cycloparaffine wie Cyclohexan und Cyclooctan, gerad- und verzweigtkettige Olefine, wie P_enten-2, Hexen-1, Octen-1, Octen-2, usw., Cycloolefine, wie Cyclohexen und dgl.. Es ist ebenfalls möglich, als Kohlenstoffquelle aromatische Kohlenwasserstoffe zu verwenden, z.B. Benzol, die isomeren Xylole usw. und Gemische davon, sowie Kohlenwasserstoffgemische, wie Kerosin, leichtöle, Schweröle, Paraffinöle usw.. Selbstverständlich kann man in dem Medium Gemische von zweien oder mehreren dieser Substanzen verwenden.

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Geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen, wie Zucker oder Zuckeralkohole, z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen usw., oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie organische Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure usw. und Alkohole, wie Äthanol, n-Butanol usw., können in dem Medium verwendet werden. Auch diese Substanzen können entweder allein oder im Gemisch von zweien oder mehreren verwendet werden.

Bei der vorliegenden Erfindung können als Stickstoffquelle die anorganischen und organischen Stickstoffquellen benutzt werden, wie man sie üblicherweise bei Glutaminsäurefermentationen einsetzt. Hierzu gehören verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze bzw. Yerbindungen, wie Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Kaseinhydrolysate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt usw.. Auch diese Substanzen können wieder entweder einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren verwendet werden.

Zu anorganischen Verbindungen, die zu dem Züchtungsmedium hinzugefügt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat usw. .

Die fermentation oder Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen ausgeführt, z.B. als aerobe Schüttelkultur oder unter Rühren und Belüften einer Submerskultur bei einer Temperatur von beispielsweise etwa 20 - 5O⁰O und einem pH-Wert von beispielsweise etwa 4-,O - 9,0. Nach etwa 3-7 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen haben sich große Mengen an L-Glutaminsäure in der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit angereichert.

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-H-

Wenn gasförmige Kohlenwasserstoffe angewendet werden, werden sie als gasförmige Gemische mit Luft oder Sauerstoff zugeführt , und eine Arbeitsweise unter Belüftung wird angewendet. Die Konzentration der verwendeten Gase braucht nicht auf irgend einen bestimmten Wert beschränkt zu werden.

Für die vorliegende Erfindung können die verschiedenen Arbeits~ weisen benutzt werden, die man üblicherweise für Fermentationen unter Verwendung von zuckerhaltigen Materialien oder flüssigen Kohlenwasserstoffen anwendet. Die Züchtungsgeschwindigkeit kann beispielsweise außerordentlich beschleunigt werden durch Zusatz geringer Mengen von nicht verwertbaren Kohlenwasserstoffen, wie Pristan, zu dem Medium, wobei andere Substanzen ähnliche Effekte haben, oder durch Zusatz oberflächenaktiver Mittel, um- die Auflösungsgeschwindigkeit der gasförmigen Kohlenwasserstoffe im Zuchtungsmedium heraufzusetzen.

Die Züchtung ist beendet, wenn die L-Glutaminsäureproduktion einen Maximalwert zeigt. Mach Abschluß der Züchtung kann man die L-Glutaminsäure durch übliche Maßnahmen gewinnen, z.B. ; durch Ionenaustauscherharzbehandlung, Lösungsmittelextraktion, Ausfällen, Adsorption, Chromatographie oder dergl.. Eine bevorzugte Arbeitsweise besteht darin, die Züchtungsflüssigkeit durch ein Ionenaustauscherharz zu schicken, um die L-Glutamin— säure zu adsorbieren. Sie wird dann eluiert, konzentriert und abgekühlt. Die erhaltenen Kristalle werden gewonnen und erwünscht enf alls weiter umkristallisiert, um reine Kristalle zu erzielen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern aber nicht begrenzen. Wenn nicht anders vermerkt, beziehen sich die Proζentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

Gorynebacterium alkanum ATCC 21194 wurde als Einsaat-Mikroorganismus verwendet. Es wurde unter aerobem Schütteln 24 Stun-

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den lang bei einem pH-Wert von 7,2 In einem Einsaat-Medium, das 0,25% Hefeextrakt, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Pepton, Q,25°/o Natriumchlorid und 2,0% Sorbit enthält, gezüchtet, um eine Einsaatkultur herzustellen. Die erhaltene Einsaatkultur wurde in einem Verhältnis von 10 YoI.-% in 2,7 Liter eines zuvor sterilisierten Züchtungsmediums, das in einem 5-Liter-Jar-Fermenter enthalten war und folgende Zusammensetzung auf wies , eingeimpft:

0,05% KH₂PO₄
0,05% Na₂HPO₄-12H₂O 0,01% MgSO₄-7H₂O 0,001% MnSO₄-4H₂O 0,001% FeSO₄-7H₂O 0,001% ZnSO₄-7H₂O 0,001% OaCl₂-2H₂O 10 J/J H₃BO₃
10 fi/X Na₂MoO₄-2H₂O CuSO₄ -5H₂O

10 pjt CaCl₂-2H₂O 50 I/Jt NiCl₂-6H₂O 0,05% Maisquellwasser 1,5%

Der pH-Wert des Mediums betrug 7,2.

Die Züchtung wurde bei 30°C während 96 Stunden unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 600 rpm. und unter Belüftung mit einem gasförmigen Gemisch aus η-Butan und Luft (50 s 50 Vol./Vol.) bei einer Geschwindigkeit von 1 Liter pro Minute durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wurde während der Züchtung durchjzusatz von wässrigem Ammoniak zum Medium auf 7,2 gehalten. Nach Beendigung der Züchtung betrug die in der Kulturflüssigkeit produzierte und angereicherte Menge

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an !-Glutaminsäure 18'mg/ml.

Die Mikroorganismenzellen wurden nach Beendigung der Züchtung von der Züchtungsflüssigkeit mit Hilfe einer Zentrifuge abgetrennt. Danach wurde der pH-Wert der Flüssigkeit auf 2,0 eingestellt. Die Flüssigkeit wurde durch das Kationenaustauscherharz Amberlite IR-120 (Η-Typ) hindurchgeleitet, und das Harz mit wässrigem Ammoniak eluiert. Das erhaltene Eluat wurde eingeengt und abgekühlt. Als Ergebnis wurden 41 g kristalliner L-&lutaminsäure erhalten.

Beispiel 2

Die Züchtung wurde in der gleichen Weise wie nach Beispiel 1 unter Verwendung von Brevibacterium butanicum ATCC 21196 durchgeführt, jedoch mit der Abwandlung, daß als Hauptkohlenstöffquelle ein Gasgemisch aus Propan und Luft mit einem Mischungsverhältnis von 50 : 50 (Vol./Vol.) benutzt wurde. Nach 96 Züchtungsstunden betrug die in der sich ergebenden Züchtungsflüssigkeit angereicherte Menge an L-Glutaminsäure 15 mg/ml.

Als Ergebnis eines in Beispiel 1 beschriebenen GewinnungsVerfahrens wurden etwa 33 g L-Glutaminsäure erhalten.

Beispiel 3

Als Einsaatstamm wurde brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 verwendet. Er wurde unter aerobem Schütteln bei einem pH-Wert von 7,2 während 24 Stunden in einem Einsaatmedium, das 0,25 Io Hefeextrakt, 0,5^ Fleischextrakt, 0,5 % Pepton, 0,25 % Natriumchlorid und 2,0 % Sorbit enthielt, gezüchtet, um eine Einsaatkultur zu erhalten. Die eriialtene Einsaatkultur wurde in einem Verhältnis von 10 Vol.-# in 2,7 Liter eines zuvor sterilisierten und in einem 5-Liter-Jar-Fermenter enthaltenen Züchtungsmedium der folgenden Zusammensetzung eingeimpft :

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0,05% KH₂PO₄ .

0,05% Na₂HPO₄-12HgO

0,01% MgS0,'7H_o0

0,001% MnSO₄'4HgO

0,001% FeSO₄-7HgO

0,001% ZnSO₄'7HgO

0,001% CaCIg-2H₂O -

10 ψ I H₃BO₃

10 pi Na₂MoO₄.2H₂O

50 pJ CuSO₄-5H₂O

¹⁰ ϊ/1 CoCl₂·2Η₂0

50 ρ I NiOl₂-6H₂O

0,3% Maisquellwasser 1,5% (NH₄)₂S0₄

Der pH-Wert des Mediums betrug 7,2.

Die Züchtung wurde in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurden. Nach 30 Züchtungsstunden wurden weiterhin 50 Einheiten/ml Penicillin G-Kaliumsalz zu dem Medium hinzugefügt, und die Züchtung wurde fortgesetzt. Nach 96 Züchtungsstunden sind 10 mg/ml L-Glutaminsäure in der Züchtungsflüssigkeit produziert worden.

Als die Züchtung in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben, nur ohne Penicillin-Zusatz durchgeführt wurde, betrug die Menge der produzierten L-Glutaminsäure 0,3 mg/ml.

Beispiel 4 ........

Es wurden 2,7 Liter eines Züchtungsmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 5-Liter-Jar-Fermenter hergestellt und sterilisiert:

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0,05%	KH₂PO₄	PO	4·12H₂O	LP-20
0,05%	Na₂H	4*	7H₂O
0,01%	MgSO	4*	4H₂O
0,001%	MnSO	•	7H₂O
0,001%	PeSO	• 4	7H₂O
0,001%	ZnSO	2*	2H₂O
0,001%	CaCl	3
10 pi	H₃BO	oO	₄*2H₂0
10 γ//	Na₂M	*	5H₂O
50 γ/1	CuSO	2*	2H₂O
io//i	CoCl	2*	6H₂O
50 γ/I	NiCl	qu	ellwass
0,05%	Mais	)₂	SO₄
1,5%	(NH₄		n-Dodecan
1%	Nonion
0,05%

Der pH-Wert des Mediums betrug χ7»2.

Es wurde in der gleichen Weise wie gemäß Beispiel 1 eine Einsaatkultur von Corynebacterium alkanum ATCC 21194 hergestellt. Me Einsaatkultur wurde in das oben beschriebene Züchtungsmedium in einem Verhältnis von 10 Vol.-% eingeimpft.

Die Züchtung wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben 96 Stunden lang durchgeführt. Nach Beendigung der Züchtung hatten sich 21 mg/ml L-Glutaminsäure in der Kulturflüssigkeit angereichert.

Aus der vorstehenden Beschreibung geht hervor, daß der Zusatz von Antibiotika oder oberflächenaktiven Mitteln zum Medium die Züchtung beschleunigt und die Ausbeute an L-G-lutaminsäure er—

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ORIGINAL INSPECTED

höht. Beispiele für Antibiotika und oberflächenaktive Mittel (Dispergiermittel), die in diesem Sinne verwendet werden können, sind in der schwebenden Anmeldung Serial Ho. 643 832 vom 6. Juni 1967 aufgeführt. Zu geeigneten Antibiotika gehören Penicillin, Bacitracin, Cycloserin, Kanamycin, Streptomycin, Spiramycin, Gefalotin, Cephaloridin und Novobiocin. Zu geeigneten oberflächenaktiven Mitteln gehören anionische, kationische und nichtionische Substanzen sowie höhere Fettsäuren und organische Ester. Es können auch Gemische von Antibiotika und Dispersionsmitteln verwendet werden.

Die Erfindung kann auf verschiedene Weise variiert werden. Derartige Variationen sind nicht als Abweichung vom Erfindungsgedanken anzusehen, wie er sich für den Fachmann ergibt.

Patentansprüche :

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Claims

Patentansprüche:

Verfahren zur Herstellung von L-G-lut amins äure, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus aus der Gruppe Corynebacterium alkanum ATCC 21194, Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 und Brevibacterium butanicum ATCC 21196 unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Mhrmedium, das einen Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffgemisch als Hauptkohlenstoffquelle enthält, züchtet und in der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit L-Glutaminsäure anreichert.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 20-50⁰C und einem pH-Wert von etwa 4,0 - 9,0 ausführt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als gasförmigen Kohlenwasserstoff einen solchen mit 2-4 Kohlenstoffatomen verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Medium den gasförmigen Kohlenwasserstoff als gasförmiges Gemisch mit Sauerstoff oder Luft zuführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff einen flüssigen Kohlenwasserstoff mit 5-18 Kohlenstoffatomen verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff eine Erdölfraktion verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff Kerosin verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

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einen nicht verwertbaren Kohlenwasserstoff zu dem Medium hinzufügt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem Medium ein oberflächenaktives Mittel hinzufügt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem Medium ein Antibiotikum hinzufügt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antibiotikum Penicillin verwendet.

12. Verfahren zur Herstellung von !-Glutaminsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus aus der Gruppe Corynebacterium alkanum ATCC 21194, Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 und Brevibacterium butanicum ATCC 21.196 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20-50⁰C und einem pH-Wert von etwa 4,0 - 9,0 in einem wässrigen Uährmedium, das einen Kohlenwasserstoff oder ein Gemisch von Kohlenwasserstoffen mit 2-18 Kohlenstoffatomen als Hauptkohlenstoffquelle enthält, züchtet, in der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit !-Glutaminsäure ansammelt und aus dieser die !-Glutaminsäure gewinnt .

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff ein η-Paraffin verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man einen gasförmigen Kohlenwasserstoff mit 2-4 Kohlenstoffatomen verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man den gasförmigen Kohlenwasserstoff dem Medium als gasförmiges Gemisch mit Sauerstoff oder Luft zuführt.

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ORIGINAL

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium alkanum ATCC 21194 verwendet. . :

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, 4a? man als Mikroorganismus Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Brevibacterium butanicum ATCC 21 196 verwendet.

19· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die L-Glutaminsäure mit Hilfe einer Ionen austauscherbehandlung aus der Züchtungsflüssigkeit gewinnt.

20. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem Medium zwecks Beschleunigung der Züchtung einen Zusatzstoff, der ein nichtverwertbarer Kohlenwasserstoff, ein oberflächenaktives Mittel oder ein Antibiotikum sein kann, hinzufügt.

K 883 ! E/Wr

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