DE1965974A1

DE1965974A1 - Verfahren zur Herstellung von Diarthronsaeure-trehaloseester

Info

Publication number: DE1965974A1
Application number: DE19691965974
Authority: DE
Inventors: Takeo Suzuki; Katsunobu Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-02-01
Filing date: 1969-01-31
Publication date: 1971-01-28
Also published as: DE1965972A1; DE1905472A1; FR2001118A1; DE1965973A1; DE1965975A1; GB1211674A; US3637461A

Description

1965374

K 947

PATENTANWALT!
Dr.-Ing. HANS RUSCHKB DIpL-In₈. HEINZ AQULAH BERLIN S3

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung von Di-arthransäure-treh&loseester

(Ausscheidung III - Stammanmeldung P 19 05 47^.9-41)

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Diarthronsäure-trehaloseester durch Fermentation. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Kohlenwasserstoffe assimilierenden Mikroorganismus der Gattung Microcoeous, und : speziell Micrococcus epldermidis ATCC 155 urter aeroben Bedingungen i in einen w&ssrlgen Nährmedium züchtet, das einen Kohlenwasserstoff i oder ein Kohlenwasserstoffgemisch als Hauptkohlenetoffquelle ent-¹ hält, und den Fettsäureester in der erhaltenen Kulturflüssigkeit anreichert.

j Es wurde gefunden, dass Mikroorganismen, die mit Hilfe der Verj Wertung bzw. Nutzbarmachung von Kohlenwasserstoffen wachsen können i im allgemeinen in ihren Zellen oder an der Oberfläche der Zellen oberflächenaktive Substanzen aufweisen. Ferner wurde durch Extraktion und Identifizierung dieser Substanzen festgestellt, dass es sich um die Fettsäureester von verschiedenen Zuckern handelt.

I

009885/1310

BAD ORIGINAL

Ester von Zuckern werden im grossen Umfange als oberflächenaktive Mittel und in verschiedenen Industriezweigen verwendet. Demzufolge besteht ein dringendes Bedürfnis nach einem Ferroentationsverfahren zur Oewinnung der Fettsäureester von Zuckern auf wenig kostspieli* ge Weise und innerhalb kurzer Zeit.

Mit der Erfindung wurde ein Verfahren zur Herstellung von Diarthronsäure-trehaloseester gefunden, das in wirksamer und verhältnismässig einfacher Weise und vorteilhaft in industriellem Maßstab, bei niedrigen Kosten und mit hoher Produktausbeute durchgeführt^ werden kann.

Erfindungsgemäss zeigte sich, dass erhebliche Mengen an Di-arthronaäure-trehaloseester in der FermentationsflUssigkeit produziert und angesammelt werden, trenn man bestimmte zur Verwertung von Kohlenwasserstoffen befähigte Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet. Diese Mikroorganismen sollten imstande sein, Kohlenwasserstoffe zu assimilieren und nutzbar zu machen. Hierzu zählt ein Mikroorganismus der Gattung Microcooeus, Micrococcus epldermidls ATCC 155.

Unabhängig von Gattung und Familie existieren zahlreiche Mikroorganismen, die Fettsäureester von Zuckern unter Verwertung von Kohlenwasserstoffen ale Hauptkohlenstoff quelle produzieren und anreichern. So wird in der deutschen Patentanmeldung P 19 05 472. ■ 9-41 ein Verfahren sur Herstellung von Arthronsäure-glukoseester , und Arthronsäure-trehaloaeester durch Züchten des Mikroorganismus [ Arthrooacter paraffineus ATCC. 15 591» in der deutschen Patentan- j j meldung (heute eingereichte Auescheidung Z, X 945) ein Verfahren ' ; zur Herstellung eines C₂₀H^,ⁿ _o-Fettsäure-trehaloeeesters durch Züchten des Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15 592, in der deutschen Patentanmeldung (heute eingereichte Ausscheidung II, K 946) ein Verfahren zur Herstellung von Dist«arln*£ure-trehaloseester, ArthronsHure-glukoseester und Mono- ' und Trl-stearinsäure-saccharoseester durch Züchten dea MikroorganÜs Arthrobacter roseoparafflneus ATCC 15 534, und in der deutecheh

•9Mft/1ft·

BAD ORIGINAL

Patentanmeldung (ueute eingereichte oisscneidung IV, K 9^8) ein Verfahren zur Hei stellung des Trehaloseesters der einbasischen Fettsäure C^-H j, G, aurch Züchten dex· Mikroorganismen Mycobacterium sp. ATCC 12 297 und Mlcrococcus p^raffinolytlcus ATCC 15 582 vorgeschlagen.

Für die Züchtung dec erfindungsgemäsceii Stammes Mx c ro coccus epldernildls ATCC \\}j k--nr. entweder ein sy η the tii.ci.es ode:· ein natürliches Nährmedium ve.wendet werden, solange es die für das 'Wacnstum des Mikroorganismus erforderlichen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt unc umfassen Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle* anorganische Verbindungen und dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in angemessenen Mengen nutzbar geraucht werden.

Im Rahmen der vorliegenden hrfindung wiixi uie Fermentation in einem wässrigen Nährmediuni durchgeführt, das eiron Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffgemisch als lUuptkohlenstjffquelle enthält. Zu derartigen Kohlenwasserstoffen gehcrer; geradkettlge and vei·- ^weigtkettige Pai^affine (Alkane) mit 6 bis 2S Koalenstcffutomen,

n-Ilexadecan wie z,B. η-Hexan, n-Octan* n-D-car^n-Dodecanj/IT-Eieosan, Iscoctan usw., Cycloparaffirie, wie Cyclckexan und Cyciocctan, ger:<.dkettige und verzweigtkettige Olefine, wie Hexen-1, Coten-1, Odten-2 usw., Cycloolefine, wieCyclohexen, aromatische KciilenWc.sserstcffe, wie Benzol, die isomeren Xylole usw. sowie Gemische uavon und ausserdem Kohlenwasserstoffe, die sich von Erdöl ableiten, z.B. Kerosin, Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle usw. Zusammen mit dem Kohlenwasserstoff können in dem Fermentationsnedium geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen verwendet werden, !wie Kohlenhydrate, -.3. Glucose, Fructose, Maltese, Sucrose, ctärke, Stärkehydioiys^te, Melassen usw., oder *gsndeine andere ^eeignete i.ohlenstcffquelle, wie organische Säuren, ^,B. Essigsäure, Milchsäure usw. Diese Substanzen können entweder einzeln oder im Gemisch von zweien oder mehreren verwendet werden.

,Als Kohlenstcffquelle können verschiecene Arten anorganischer oder !organischer Sulse oder Verbindungen verwendet werden; wie Harnstoff

O098SS/13 BAD

wässriges Ammoniak oder Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwusser, Hefeextrekt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, BaLllon, Caseinhydi'olysate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Heiskleieextrakt usw. Auch diese Substanzen können entweder einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren verwendet weraen.

Anorganische Verbindungen, die dem Züchtungsmedium hinzugesetzt werden können, sind z.'3. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kalündinydrogienphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, !Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat usw.

Ausserdem kann es bei bestimmten Stämmen noch notwendig sein, zu dem ZUchtungsmedium bestimmte essentielle Nährstoffe hinzuzufügen, wie Aminosäuren, z.B. Asparaginsäure, Threonin, Methionin usw. und/oder Vitamine, z.B. Biotin, Thiarain, Cobalanin und dj..

Für die Durchführung der erfindungsgemässen Züchtung wird das Züchtungsmedium sterilisiert, und dann wird der zu verwendende Mikroorganismus in dieses eingeimpft. Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z.B. als aerobe Schüttelkultur oder unter Kühren und Belüften einer Subner^cultur, und zwar bei einer Temperatur von beispielsweise etwa 25 bis 40° C und bei einem pH-Wert von beispielsweise etwa 4 bis 9. Während der Züchtung wird der pH-Wert auf den angegebenen Bereich ( vorzugsweise pH 6 bis 8 ) eingestellt, und zwar durch Zusatz z.B. von Harnstofflösung, wässrigem Ammoniakoder einer Ammoniumcarbonatlösung zu dem Medium. Die Züchtung ist üblicherweise innerhalb von 2 bis •h Tagen vollständig abgelaufen. In der Praxis ist die Züchtung beendet, wenn die Kcüsung de. Geca.-ntectc·- 2 ine π Maximalwert ergibt.

Das Pettsäui-eesterprodukt ieo Zuckere sammelt sich vomnrnlich in der öligen Schicht cer ZUcntur^sflUsoigkeit an. D-n,-ufol£e wird nach vollständig:*. Ablauf aer Zücntung lev wässrige Anteil der unteren cc.üoht aer Fermentation::::flüssigkeit entfernt, indem man

009835/1380

BAD ORIGINAL ',

die Fermentationsf Bissigkeit ruhig in einem kalten Raum stehen lässt oder indem man eine Trennung durch Zentrifugieren anwendet. Eine gemischte Chloroform-Methanol-Lösung (1:1) wird zu der oberen Schicht hinzugefügt, um die Gesamtmenge an Lipoiden darauf ''zu entfernen. Das Lösungsmittel wird dann unter vermindertem Druck bei 40° C entfernt und der ölige Anteil der oberen Schicht wird durch Zentrifugen-Abtrennung gewonnen. Die so erhaltene Ölschicht wird durch eine Silicagelsäule hindurchgeleitet, und es wird eine Elution mit Hexan voi-genommen, um die vorhandenen n-Paraffine zu entfernen.· Anschliessend werden polare Verbindungen durch Elution mit Chloroform entfernt. Der Fettsäureester des | Zuckers wird erhalten nach Durchführung einer Elution mit einem Chlorofr^m-Methanol-Gemiseh, Auffangen der jeweiligen Fraktionen, Entfernen des Lösungsmittels, Hinzufügen von kaltem Aceton, Sammeln der erhaltenen Niederschläge und schliesslich Reinigen mit Hilfe von Aceton.

Das folgende Beispiel ooll die Erfindung erläutern, sie jedoch nicht beschränken. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht je Liter Fermentationsflüssigkeit.

Beispiel

Micrococcus epldermidis ATCC 155 wird in einem Kulturmedium, welches 2 % Sorbit, 1 % Pepton, 1 % Fleischextrakt Und 0,3 % Natriumchlorid enthält, unter 24-stürtüigem Schütteln gezüchtet. Als Kohlenstoffquelle wird ein Gemisch aus C₁₂ ^pCic -Fraktionen enthaltenden Paraffinen verwendet. Die erhaltene Einsaatkultur wird in einem Verhältnis von 10 Vo1.-,j in ein Züchtungsmedium eingeinift, .dus die folgende Zusammensetzung besitzt:

10 ρ Kerosin
0,2 ,; K^HPO₁.
0,2 ;; KH₂PO₄

, 0,1 η MgSO₄ . 7H₂O

_ _ 0,005 /' MnSO₄ . 4H₂O

009885/1380

BAD ORIGföüfe^iO ·\Ι£8

-C-

ο.	01 ,	FeSO₂. . 7H₂O
1	mg/1	CuS0_Jf . 5H₂O
ι.	0 % \	(NH^)₂SO₄ -
0,	1 %	Maisquellwasser
20	f/1	Thiamin

Der pH-Wert des Mediums wird vor dem Sterilisieren auf 70 eingestellt. Die Züchtung wird unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30° C in einem 5-Liter-Jar-Firir.entor unter Rühren bei einer Rührgeschwindigkeit von 600 Upm und unter Belüftung mit sterilisierter Luft mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 1 Liter je liter pro Minute «lurchgefUhrt. Zu Beginn der Züchtung werden dem Züchtungsmedium 600 ml eines Gemisches von C,g - C,f- n_rParaffinen als Kohlenstoff quelle hinzugefügt, und der pH-Wert des Mediums wird mit ' wässrigem Ammoniak eingestellt. Nach 72-stündiger Züchtungsdauer werden 2,5 Liter· der erhaltenen Kulturflüssigkeit mittels einer Zentrifuge abgetrennt und der wasserlösliche Teil der unteren j SBiicht wird durch Absaugen entfernt. Es werden 0,65 Liter eines _: ! Ölschicht-Anteils erhalten. 4,5 Liter eines Gemisches aus Äthanol und Äther (2:1) werden hinzugefügt, und nach ausreichendem Mischen ■ wird die Lösung filtriert. Es werden 5*1 Liter der Extraktionslösung auf 40° C unter vermindertem Druck erhitzt, um das Lösungsmittel aus derselben zu entfernen, und, nachdem die restliche Lösung erhitzt worden ist, wird die Lösung der oberen Schicht durch Zentrifugen-Abtrennung gewonnen. Die obere Schicht wird abgenommen und η-Hexan zu derselben hinzugefügt. Dann wird die erhaltene Lösung auf 250 ml verdünnt und durch eine Silicagelsäule ( 5,2 cm χ 20cm ) hindurchgeschickt. Danach wird η-Hexan durch die Säule laufen gelassen, um alle zurückgebliebetm n-Paraffine auszuwaschen. Sodana wird Chloroform durch dia Säule geleitet, um nicht-polare Substanzen zu entfernen, Wach Sammlung der Fraktionen, die mit dem Chlorofo^-Methanol-Gemisch ( 95:5 ) eluiert worden waren. Entfernen des Lösungsmittels bei 40° C unter vermindertem Druck, Hinzufügen von warmem Aceton zwecks Auflösung

φ - - ι

des Gemisches und Stehenlassen des Gemisches unbewegt in einem kalten Raum wird ein Niederschlag mit gelatineartiger Konsistenz j

009165/1380

erhalten. K-ei. noc-ini-ili^r.. U:r.fallen werden £,3 £ eines Zucke.■ £i;ter-G-ri;ii;c;ie- alt eier l-Jüterbinöurig von Trehalose ^In Zuckci· komponente und 2 Molen Arthroncäure erhalten.

- Patentanspi-üciie -

009885/1380 BAÖ

Claims

Patentansprüche t

1. Verfahren zur Herstellung von Di-arthronsäure-trehaloseester, dadurch gekennzeichnet, dass man den Kohlenwasserstoffe assimilierenden Mikroorganismus Micrococcus epflsrmldls ATCC 155 unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium züchtet, das «inen Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwaeser- ■ stoffgemisch als Hauptkohlenstoffquelle enthält, und den Fettsäureester in der erhaltenen Kulturflüssigkeit anreichert;·

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

man als Kohlenwasserstoff ein η-Paraffln mit 6 bis 25 Kohlen-'

P stoffatomen verwendet. '

3· Verfahren n&ch Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenwasserstoff Kerosin verwendet.

k. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 25° bis 4Q®C und bei einem pH-Wert von 4 bis 9 durchführt. ;

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, I dass man als Kohlenwasserstoff ein n-Paraffin mit 12 bis 15 \ Kohlenstoffatomen verwendet.

ΟΟ9«85/13·0

BAO

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man den Fettsäureester aus dem Ölschicht-Anteil der ernal« tenen Kulturflüssigkeit gewinnt.

OOSeaB/1310

BAD ORiQJNAt.