DE1916813B2 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Nicotinsäuremononucleotid - Google Patents
Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von NicotinsäuremononucleotidInfo
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Description
zu entnehmen.
Keines der bi-.her bekannten Verfahren ist zur Übertragung
auf eine industrielle Produktion von Nicotin-
Die Eriindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung sauremononucieotid geeignet.
\on Nicotinsäuremononueleotid durch Züchten eines 3 = Aufgabe der Erfindung war es. ein verbessertes Yer-Mikb!Organismus
und anschließende Gewinnung des fahren zur biotechnischen Herstellung son Nicotin-Nicotinsäuremononiicleotids,
welches dadurch ge- säuremononucleotid zu entsvickeln. welches den biskenn/eichnet
ist. daß man Brevibacterium ammo- herigen Verfahren überlegen ist. Dieses Verfahren sollte
r lgenes ATCC 6872. Corynebacterium ?ri. ATCC ai.f wirksame und verhältnismäßig einfache Weise.
_iü84, Arthrobacter sp. ATCC 21085 oder Micro- 40 auch vorteilhaft in industriellem MaP-tab bei niedcoccus
sodonensis ATCC 15932 unier aeroben Bedin- rigen Kosten unter Erzielung hoher l'uidukiausheuu-n
gungeii 111 einem wäßrigen. Nicotinsäure oder Nicotin- durchführbar sein.
amid enthaltenden Nährmedium züchtet und daß man Frfindungsgemäß wurde gefunden, daß sich wescnt-
das Nic^tinsäuremononucleotkl aus ύτ erhaltenen liehe Mengen an Nicotinsäuremononucleotid in vier
Fermeiuationsllüssigkcit gewinnt. 45 Fermentationsfliissigkcn ansammeln, wenn man die
Nicoünsäuremononucieoiid besii/t die folgende eingangs angegebene Fermentation in einem wäßrigen
Strukturformel: Nährmedium durchführt. Ein solcher Yorschl.i ist
aus der Technik bisher nicht bekannt gewesen.
Die Isolierung und Herstellung son Nicotinsäiire-
- ( OOH 50 mononucieotid mittels der'Msher bekannten Verfahren
ist in industriellem MaIVi.ib schssierig dtirchzuführen.
J\ beispielsweise auf Grund der hohen Kostet1 der Aus
gang-materialien und der er/ielbaren niedrigen Aus-
^ I j bcu.en.
s5 Das erfindungsgcmäße Verfahren ist dagegen aultei
11/· PH ordentlich praktisch, da Nicotinsäuu u;· .niucleoiiv:
, ohne beson/.ereii \ufwand bei niedrigen Kosten unter
} r/ici'Mig holier Ausbeuten erhalten v.ird. Außcnlem
"f n" is; von Vorteil, dab d.is angc-trcbte Produkt nicht aus
f··.· den /eilen, sondern ;;us der I erme :iationsflü': gkeit
I IC O' gcssvrincn ssini.
EntssLilcr ein synthetisches . '.er ein natürliche··
CH., -C) I' Oll N;ihrnu\iium ist ; ir die Züch: :ig ^er erlind ungsgeir:!!!.1·
\erwendeien vier Stämme geeignet, solange es die fur
Qlj fij clas Wachst um des vchm ndcteii Stammes notwendigen
Nährstoffe enthält Solche Nährstoffe sind in <\o
Tech':!!, bekannt: /11 ihnen gehören eine kiMilenstofl-
Diese Verbindung ist son biochemie hem Interesse queilc. eine S'ivK^t■ -Pf^. eile, anorganische Nerbindun-
gen u. dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus
JD geeigneten Mengen ausgenutzt werden. So seien als Beispiele für die Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate,
wie Glucose, Fruktose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen, Mannose, Glycerin usw.,
©der jede andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie I. B. organische Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure
Brenztraubensäure usw., genannt. Diese Substanzen können entweder einzeln oder als Gemisch von zweien
oder mehreren angewendet werden.
Als Stickstoffquelle können verschiedene Artec von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen
verwendet werden, wie z. B. Harnstoff, Ammoniaklösung oder Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid,
Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Aiamoniumacetat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat
usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Pepton, Fischmehl, Boillon, Caseinhydrolysate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt,
entfetteter Sojabohnenkuchen, Schmetterlingspuppen oder verschiedene Verdauungsprodukte davon usw.
Auch diese Verbindungen können entweder einzeln oder aus Gemisch von zweien oder mehreren verwendet
werden.
Anorganische Verbindungen, die zu dem Nährmedium hinzugegeben werden können, sind z. B.
Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphospha'. Eisensulfat,
Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat usw.
Die vier einsetzbaren Mikroorganismenstämme sind hinsichtlich Biotin auxotroph, d. h., dem Nährmedium
muß Biotin zugegeben werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Nicotinsäure oder Nicotinamid zu Beginn oder während der
Fermentation zu dem Nährmedium hinzugegeben, und zwar entweder auf einmal oder in mehreren
Gaben. Die Nicotinsäure oder das Nicotinamid können in Form ihrer nichttoxischen Salze, z. B. der Natriumsalze,
K.ali"msalze. Sulfate, Hydrochloride, Ascorbate
usw., ?u dem Nährmediur" hiri-gefügt werden. Es ist
darauf hinzuweisen, daß solche äquivalenten Zusatzstoffe in den Geltungsbereich der Erfindung fallen.
Die zu \erwendende Menge des Zusatzstoffes kann entsprechend dem speziellen verwendeten Mikroorganismus
und den angewendeten Züchtungsbedingungen variiert werden. Im allgemeinen wird eine
Menge von 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1 mg/ml bis 20mg/ml, an zugesetzter Nicotinsäure
oder Nicotinamid angewendet.
Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen, wie 7 B. aerobem Schütteln der Kultur oder durch Rühren
und Belüften einer Submerskultur. bei einer Temperatur von beispielsweise 20 bis 40 C und einem
pH-Wert von beispielsweise etwa 4,0 bis 9,5 durchgeführt. Nach etwa 2 bis 8 Tagen der Züchtung unter
diesen Bedingungen sind wesentliche Mengen an
Hicotinsäüremononucleotid :;■; dem erhaltenen Kultur-
C:dium produziert und in der Fcrmentationsflüssigit angereichert worden.
Nach Abschluß der Züchtung wird das NicotinliurernonoiHicleotid
aus der Fermentaiionsflüssigkeit jUlf übliche Weise gewonnen, z. B. durch Behandlung
feit einem lonenaustruischerharz. Extraktion mit Löiungsmitteln,
Ausfällung. Adsorption, Chromatographie, Konzentrierung od. dgl.
Falls nicht aniLrs angegeben, beziehen sich alle
Prozentangaben in den Beispielen und der gesamten Beschreibung auf das Gewicht pro Liter Wasser.
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wild als Eiiisaatmikroorganismus verwendet. Dieser Stamm
wird in einem Einsaatmedium, das 2% Glucose, 1% Pepton, 1 % Hefeextrakt, 0,3 % NaCl und 30 μ£ξ/ίΰεΓ
ίο Biotin enthält, bei 300C 24 Stunden lang gezüchtet.
Die erhaltene Einsaatkultur wird in einem Inoculations-Verhältnis von 10 Volumprozent in ein Fermentationsmedium
der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:
100 g Glucose
6 g Harnstoff
10 g KH9PO4
10 g K2HPO4
10 g MgSO4-7 HnO
0,1g CaCl2-2H2O
0,1g CaCl2-2H2O
30 μg Biotin
10 g Hefeextrakt
Bei der Herstellung des Fermentationsmediums werden die obigen Komponenten in 1 Liter Wasser
gelöst, und der pH-Wert der Lösung wird mit NaOH auf 8,0 eingestellt. Dann wird das Fermentationsmedium
in einzelne Kolben eingegossen und bei einem Druck von 1 kg/cm2 10 Minuten lang in einem Autoklav
sterilisiert.
Nach dem Einimpfen werden jeweils 20-ml-Anteile
des Gemisches aus Einsaat- und Fermentationsmedium in 250-ml-Erlenmeyerkolben eingegossen. Die Züchtung
wird dann unter aerobem Schütteln bei 30cC
durchgeführt.
Nach 72 Stunden der Züchtung wird Nicotinsäureamid in einer solchen Menge zu der Fermentationsflüssigkeit hinzugefügt, daß sich darin eine K.onzen-
tration von 2 mg/ml ergibt. Die Züchtung wird dann weitere 24 Stunden lang fortgesetzt. Als Ergebnis sind
2,3 mg/ml Nicotinsäuremononucleotid in der Fermentationsflüssigkeit angereichert worden.
Das Nicotinsäuremononucleotid wird an einem stark basischen Polystjrol-Anionenaustaiischerharz auf der Bu-,is Styrol-Divinylbenzol-Copolymer adsorbiert und dann mit einer wäßrigen Ammoniumformiatlösung eluiert.
Das Nicotinsäuremononucleotid wird an einem stark basischen Polystjrol-Anionenaustaiischerharz auf der Bu-,is Styrol-Divinylbenzol-Copolymer adsorbiert und dann mit einer wäßrigen Ammoniumformiatlösung eluiert.
B e i s ρ i e 1 2
Die Züchtung wird in derselben Meise wie im Beispiel 1 durchgeführt mit der Abwandlung, daß als Zusatzstoff
zu dem Medium Nicotinsäure an Stelle von Nicotinamid verwendet wird: die in der erhaltenen
Fermentationsflüssigkeit produzierte Menge an Nicotinsäuremononucleotid beträgt 2,3 mg/ml.
B e i s ρ i e ! 3
Die Züchtung wird ii derselben Weise wie im Beispiel
ι durchgeführt mit der Abwandlung, daß Corynebacteriurr sp. ATCC 2 ί 084 an Stelle von
Brevibacteriuni ammoniagenes ATCC 6872 als Einsaatmikroorganismus
verwendet wird. Die in der Fermenlationsflüssigkeit produzierte Menge an Nicotinsäuremononucleotid
beträgt 1,7 mg/ml.
Die Züchtung wird in derselben Weise im Beispiel 1 durchgeführt mit der Abwandlung, daß Arthrobacter
sp. ATCC 21085 an Stelle von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 als Einsaatmiki oorganismus verwendet
wird. Die in der Fermentationsflüssigkeit produzierte Menge an Nicotinsäuremononucleotid beträgt
1,3 mg/ml.
Micrococcus sodonensis ATCC 15932 wird als Einsaatmikroorganismus
verwendet. Die Züchtung wird in derselben Weise und unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt. Als Ergebnis sind in
der Fermentationsflüssigkeit 0,4 mg/ml Nicotinsäuremoncnucleotid produziert und angereichert worden.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von Nicotinsäure- fahren zu seiner Herstellung.
mononucieotid durch Züchten eines Mikroorganis- 5 Verfahren zur Herstellung von Nicotinsäuremor.0-mus
und anschließende Gewinnung des Nicotin- nucleotid Is1MN sind bereits bekannt. In Journal of
säuremononucleotids, dadurch gekenn- Biological Chemistry, 236, S. 525 (1961), wird ein Verzeichnet,
daß man Brevibacterium ammo- fahren zur Herstellung von NMN durch Umsetzung
niagenes ATCC 6872, Corynebacterium sp. ATCC von Nicotinsäure mit 5-Phosphoribosyl-l-pyrophos-21084,
Arthrobacter sp. ATCC 21085 oder Micro- io phat (PRPP) in Gegenwart eines aus Rinderleber ercoccus
Fodonensis ATCC15932 unter aeroben haltenen Enzyms (Nicotinsäuremononucleotid-pyro-Bedingungen
in einem wäßrigen. Nicotinsäure oder phosphorylase) vorgeschlagen. Dieses Verfahien ist
Nicotinamid enthaltenden Nährmedium züchtet unter industriellen Gesichtspunkten unwirtschaftlich,
und daß man das Nicotinsäuremononucleotid aus da es das bedeutend teurere PRPP als Ausgangsmateder
erhaltenen Fermentationsflüssigkeit gewinnt. 15 rial verwendet; die Ausbeute ist sehr gering und be-
2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekenn- trägt nur 112πιμΜο1 NMN bei 0.21 μΜοΙ Nicoiinzeichnet,
daß man die Nicotinsäure oder das säure und 0,657 μΜοΙ PRPP.
Nicotinamid zu Beginn der Züchtung zu dem Me- Ein Verfahren zur Isolierung des NMN aus Hefen
dium hinzufügt. ist aus Archives of Biochemistry and Biophysics. 52.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 20 S. 83 (1959), bekannt. Aus den dortigen Mitteilungen
zeichnet, daß man die Nicotinsäure oder das Nico- ist zu entnehmen, daß etwa 100 aMol NMN in 500 g
linamid nach Beginn der 7üchtung zu dem Medium Hefe enthalten sind, was bei Zugrundelegung einer
hinzufügt. lOOprozenligen Ausbeute etwa 31,9 mg entsprich!.
4. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekenn- Erfindungsgemäß wurde jedoch eine bedeutend höhere
zeichnet, daß man pro ml des Nährmediums die *s Ausbeute (0,4 bis 2,3 mg/ml Züchtungsmedium) er-Nicotinsäure
in ^ner Menge '.„,η etwa 1 mg bis halten.
20 mg ocW das Nicotinamid in einer Menge ve·-. In Nature. 180. S. 1203 (1957), wird über die Eigen-
etwa I mg bis 2l) ■ g zu dem Medium hinzugibt. schäften eines neuen Pyridin-nuoleotids berichtet.
welches aus Penicillium chrysogenum isoliert wirJ^.:
30 Angaben zur Ausbeule sind dieser Literaüirstellc niJit
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