DE1965972A1 - Verfahren zur Herstellung eines C20H41O2-Fettsaeuretrehaloseesters - Google Patents

Description

K 945

PATENTANWALT! Or-Ing. HANS RUSCHKB

npL-lnO. HEIMZ AQULAR

BERLIN η Aim·*» Vlfctart*!

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan

Verfahren zur Herstellung eines fettsäure-trehaloseesters

(Ausscheidung I - Stammänmeldüng P 19 05 472.9-41)

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Cp₀HhlOp-Fettsäure-trehaloseesters durch Fermentation. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man■-einen Kohlenwasserstoffe assimilierenden Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium, und speziell Corynebaoterlum hydrocarboelastus ATCC 15 592 unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium züchtet, das einen Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoff gemisch als Hauptkohlenstoffquelle enthält, und den Fettsäureester in der erhaltenen Kulturflüssigkeit anreiohert.

Es wurde gefunden, dass Mikroorganismen, die mit Hilfe der Verwertung bzw. Nutzbarmachung von Kohlenwasserstoffen wachsen können, im allgemeinen in ihren Zellen oder an der Oberfläche der Zellen oberflächenaktive Substanzen aufweisen. Ferner wurde durch Extraktion und Identifizierung dieser Substanzen festgestellt,

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dass es sich um die Fettsäureester von verschiedenen Zuckern handelt. Ester von Zuckern werden in grossen Umfange als ober-. flächenaktive Mittel und in verschiedenen Industriezweigen verwendet. Demzufolge besteht ein dringendes Bedürfnis nach einem Fermentationsverfahren zur Gewinnung der Fettsäureester von Zuckern auf wenig kostspielige Weise und innerhalb kurzer Zeit.

Mit der Erfindung wurde ein Verfahren zur Herstellung eines CgQH^Og-Fettsäure-trehaloseesters gefunden, das in wirksamer und verhältnismässig einfacher Weise und vorteilhaft in industriellem Maßstabe, bei niedrigen Kosten und mit hoher Produktausbeute durchgeführt werden kann.

Erfindungsgemäss zeigte sich, dass erhebliche Mengen an einem caOH^Og-Fettsäureester in der Fermentationsflüssigkeit produziert und angesammelt werden, wenn man bestimmte zur Verwertung von Kohlenwasserstoffen befähigte Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet. Dleae Mikroorganismen sollten imstande sein, Kohlenwasserstoffe zu assimilieren und nutzbar zu machen. Hierzu zählt ein Mikroorganismus der Gattung Corynebacterlum, nämlich Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15 592. /......■-

Unabhängig von Gattung und Familie existieren zahlreiche Mikroorganismen, die Fettsäureester von Zuckern unter Verwertung von Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstoff quelle produzieren und anreichern. So wird in der deutschen Patentanmeldung P 19 05 4?2. 9-41 ein Verfahren zur Herstellung von Arthronsäure-glukoseester und Arthronsäure-trehaloseester durch Züchten des Mikroorganismus Arthrobacter paraffineus ATCC 15 591, in der deutschen Patentanmeldung (heute eingereichte Ausscheidung II,, K 9^6) ein Verfahren zur Herstellung von Di-stearinsäure-trehaloeeester, Arthronsäure-glukoseester und Mono- und Tri-stearinsäure-eacoharoseester. durch Züchten des Mikroorganismus Arthrobacter roseoparaffineua ATCC 15 584, in der deutschen Patentanmeldung (heute eingereichte Ausscheidung III, K 947) ein Verfahren zur Herstellung von Di· arthronsäure-trehaloseester durch Züchten des Mikroorganismus

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Microooccus epidermidls ATGC 155 und in der deutschen Patentanmeldung (heute eingereichte Ausscheidung IV, K 9^8) ein Verfahren zur Hersteilung des Trehaloseesters der einbasischen Fettsäure C-xoHgiiOp durch Züchten der Mikroorganismen Mycobacterium sp-. ATCG 12 297 und Mierococcus paraffino'lytlcug ATCC 15 5ß2 vorgeschlagen.

Pur die Züchtung des erfindungsgemässen Stammes Corynebacteislmn hydrooarboclastus ATCC 15 592 kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium verwendet werden, solange es die für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlichen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt und umfassen Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in angemessenen Mengen nutzbar gemacht werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Fermentation in einem wässrigen Nähi-rnediurn durchgeführt, das einen Kohlenwasserstoff oder ein Kchlenwasserstöffgemisch als Hauptkohlenstöffquelle enthält. Zu derartigen Kohlenwasserstoffen gehören geradkettige und verzweigtkettige Paraffine (Alkane) mit 6 - 25 Kohlenstoffatomen, wie z.B. η-Hexan, n-Octan, n-Decan, n-Dodecan, ix-Hexadecan, tt-Eicoßan, IBooctan usw., Cycloparaffine, wie CyxJlohexan und Cyclooctan, geradkettige und veraweigtkettige Olefine, wie Hexen-1, Octen-1, Octen -2 usw., Cycloolefine, wie Cyclohexen, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, die isomeren Xylole usw. sowie Gemische davon und ausserdem Kohlenwasserstoffe, die sich von Erdöl ableiten, ξ.B. Kerosin, Leichtöle, Schweröle,. Paraffinöle usw.. Zusammen mit dem Kohlenwasserstoff können in dem Fermertatlonsmedium geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen verv^endet werden, wie Kohlenhydrate, s.B, Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, Stärke, Stärke-.hydrolysate, Melassen usw., oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoff quelle, wie organische Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure usw.. Diese Substanzen können entweder einzeln oder im Gemisch von zweien oder mehreren verwendet werden. ■

Als Kprilenstoffquelle können verschiedehe Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen verwendet Werden, wie

Harnstoff, wässriges Ammoniak oder Ammoniumsalze, z»B. Ammoniumohlorid Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat,'Ammonium-

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phosphat usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, pepton, Fischmehl,, Bouillon, Caseinhydrolysate. Gasaminosäure, Fischpressäfte, HeIskleieextrakt usw. Auch diese Substanzen können entweder eineein oder in Kombination von zweien oder mehreren verwendet werden. ,

Anorganische Verbindungen, die dem Züchtungsmedium hinzugesetzt werden können, sind z.B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaiiumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Elsensulfat, Manganchlorid, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat usw..

Ausserdem kann es bei bestimmten Stämmen noch notwenig sein, zu dem Züchtungsmedium bestimmte essentielle Nährstoffe hinzuzufügen, wie Aminosäuren, z.B. Asparaginsäure, Threonin, Methionin usw. und/oder Vitamine, z,B. Biotin, Thiamin, Cobalamin und dgl.

Für die Durchführung der erfindungsgemässen Züchtung wird das Züchtungsmedium sterilisiert, und dann wird der zu verwendende Mikroorganismus in dieses eingeimpft. Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z.B. als aerobe Schüttelkultur oder unter Rühren und BeIften einer Submerskultur, und zwar bei . einer Temperatur von beispielsweise etwa" 25 bis 4o° C und bei einem pH-Wert von beispielsweise etwa 4 bis 9. Während der ZÜchtung wird der pH-Wert auf den angegebenen Bereich ( vorzugsweise pH 6 bis 8) eingestellt, und zwar durch Zusatz z.B. von Harnstoff lösung, wässrigem· Ammoniak oder einer Ammoniumcarbonatlösung zu dem Medium. Die Züchtung ist üblicherweise innerhalb von 2 bis 4 Tagen vollständig abgelaufen. In der Praxis ist ÄLe Zttchtung beendet, wenn die Messung der Qesamteabr einen Maximalwert ergibt.'

Das Fettsäureesterprodufct des Zuckers sammelt sich vornehmlich in der öligen Schicht der Züchtungsflüssigkeit an. Demzufolge wird nach vollständigem Ablauf der Züchtung der wässrige Anteil der unteren Schicht der Fermentationsflüsigkeit entfernt, indem man die Fermentationsflüssigkeit ruhig in einem kalten Raum stehen lässt oder indem man eine Trennung durch Zentrifugieren anwendet. Eine gemischte Chloroform-Mathanol-Lösung( 1:1 ) wird zu der

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oberen Schicht hinzugefügt, um die Gesamtmenge an Lipoideη darauf zu entfernen. Das Lösungemittel wird dann unter vermindertem Druck bei 40° C entfernt und der ölige Anteil der oberen Schicht wird durch Zentrifugen-Abtrennung gewonnen. Die so erhaltene ölschicht wird durch eine Sllicagelsäule hindurchgeleitet, und es wird eine Elution mit Hexan vorgenommen, und die vorhandenen n-Paraffine zu entfernen. Anschliessend werden polare Verbindungen durch Elution mit Chloroform entfernt. Der Fettsäureester des Zuckers wird erhalten nach Durchführung einer-Elution mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch, Auffangen der jeweiligen Fraktionen, Entfernen des Lösungsmittels, Hinzufügen von kaltem Aceton, Sammeln der erhaltenen Niederschläge und schliesslich Reinigen mit Hilfe von Aceton.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, sie jedoch nicht beschränken. Wenn nicht anders anheben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht je Liter Fermentationsflüssigkeit.

Beispiel

Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15 592 wird in einem einen pH-Wert von 7,2 vor dem Sterilisieren aufweisenden Einsaatmedium, j das 1,0 % Fleischextrakt, 1,0 £ Pepton und 0,3 % Natriumchlorid j enthält, unter aerobem Schütteln 24 Stunden lang gezüchtet. Die ' erhaltene Einsaatkultur wird in einem Verhältnis von 10 Vol.-^ in 2,0 Liter eines Fermentationsmediums eingeimpft, das sich In einem 5-Liter-Jar^Fermentor befindet, und folgende Zusammensetzung aufweist.

0,2 %	0	K2HPO4	TH2O	1221
0,1 %		MgSO4 .	4HgO
0,002 #	MnSO4 .	TH2O
0,02 $	FeSOb .	TH2O
0,001 %	ZnSO4 .	2H2O
1 mg/1	CuCl4 .
1,0 #.	NH4NO3	Maisquellwasser
0,1 #		0 9 8 5 1 /
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Die Züchtung wird bei 50° C unter Rühren mit einer Rührgeschwindigkeit von 600 Upm und unter Belüftung mit sterilisierter Luft mit einer Durchsatzgteohwlndigkelt von 1 Liter je Liter pro Minute durchgeführt. Zu Beginn der Züchtung werden dem Züchtungsmedium 600 ml eines Gemisches von C₁₁-C₁^ n-Paraffinen als Kohlenstoffquelle hinzugefügt, und der $H-Wert des Mediums wird mit wässrigem Ammoniak auf .6,8 bis 7^5 eingestellt. Nach 72-stündiger Zächtungsdauer werden 2,3 Liter der erhaltenen KulturflUssigkeit mittels ~ einer Zentrifuge abgetrennt und der wasserlösliche Teil der unterer Schicht wird durch Absaugen entfernt. Es werden 0,65 Liter eines

* . Ölschicht-Anteils erhalten. 4,5 Liter eines Gemisches aus Äthanol und Äther (2 : 1) werden hinzugefügt und nach ausreichendem Mischen wird die Lösung filtriert. Es werden 5,1 Liter der orangegelben Extraktionslösung auf 40° C unter vermindertem Druck erhitzt, um das Lösungsmittel aus derselben zu entfernen, und, nachdem die restliche Lösung erhitzt worden ist, wird die durchsichtige Lösung der oberen Schicht durch Zentrifugen-Abtrennung gewonnen· Die obere Schicht wird abgenommen und η-Hexan zu derselben hinzugefügt. Dann wird die erhaltene Lösung auf 250 ml verdünnt und durch tine Silicagelsäule ( 5,2 cm χ 20 cm) hlndurohgeschlckt. Danach wird η-Hexan durch die Säul· laufen gelassen, um alle zurückgehaltenen n-Paraffine auszuwaschen. Sodann wird Chloroform durch die Säule geleitet, um nicht-polare Substanzen zu entfernen*

) Nach Sammlung der Fraktionen (600 Al), die mit dem Chloroform -Methanol-Gemisch (95:5) eluiert worden waren, Entfernen des Lösungsmittels bei 4o° O unter vermindertem Druck, Hinzufügen von warmem Aceton zwecks Auflösung des Gemisches und Stehenlassen des Gemisches unbewegt in einem kalten Raum wfd einNiederschlag mit gelatineartiger Konsistenz erhalten. Nach nochmaligem Umfallen werden 3,6 g des Trehalpseesfcers einer Fettsäure mit der experimentellen Formel Cg₀H^₁O₂ als Substanz abgetrennt. Ausserdem werden 0,2^g. eines Fettsäureesters der' Glukose abgetrennt. j

- Patentansprüche -

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Claims (6)

P a t e η t a η s ρ r ü- c he:

1. Verfahren zur Herstellung eines C₂₀Hh,Og-Pettsäure-trehaloseesters, dadurch gekennzeichnet, dass man den Kohlenwasserstoff · assimilierenden Mikroorganismus Corynebaoterium hydrocarboclastüs ATCC 15 592. unter aeroben Bedingungen in einem , wässrigen Nährmediura züchtet, das einen Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffgemisch als Hauptkohlenstoffquelle enthält, Und den Fettsäureester in der erhaltenen Kulturflüssigkeit anreichert.

2. Verfahren nach Anspruch 1., dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenwasserstoff ein η-Paraffin mit 6 -bis 25 Kohlenstoffatomen verwendet.

^. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenwasserstoff Kerosin verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1> dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 25° C bis 40° C und bei einem pH-Wert von 4 bis 9 durchführt.

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5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenwasserstoff ein n-Paraffin mit 11 bis Kohlenstoffatomen verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man den Fettsäureester aus dem Ölschicht-Anteil der erhaltenen Kulturflüssigkeit gewinnt.

Dr.Pa./lir.

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