DE1912797C3

DE1912797C3 - Verfahren zur Herstellung von L Glutaminsäure

Info

Publication number: DE1912797C3
Application number: DE1912797A
Authority: DE
Inventors: Kazuo Kimura; Katsunobu Tanaka; Masaki Yamamoto
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-03-09
Filing date: 1969-03-07
Publication date: 1973-10-11
Also published as: FR2003585A1; GB1208874A; US3711373A; NL6903525A; NO126923B; DK119873B; CH496094A; DE1912797A1; DE1912797B2; SE357386B

Description

»5

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von i.-Glutaminsäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Nährmedien, die gasförmige Kohlenwasserstoffe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen »5 oder flüssige Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle enthalten, bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten.

Es sind bereits Verfahren zur Herstellung von !.-Glutaminsäure durch Züchten von Mikroorganismen in gasförmige oder flüssige Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedien bei geeigneten Temperaturen und pH-Werten bekannt (USA.-Patentschriften 3 222 258 und 3 201 323, britische Patentschriften 1 103 754, 1 102 906, 1 095 724 und 1 085 923 und französische Patentschrift 1461030).

Die in den Beispielen der USA.-Patentschriften 3 222 258 und 3 201 323 angegebenen Glutaminsäuremengen in den Fermentationsmedien sind jedoch gering.

Nach dem Beispiel 4 der britischen Patentschrift 1 102 906, dem Beispiel dieser Patentschrift mit der größten Ausbeute, werden mit Arthrobacter paraffineus ATCC 19 065 aus etwa 66 g flüssigen Kohlenwasserstoffen (C₁₁- bis Cjg-n-Paraffinen) in 72 Stunden etwa 35 g/l Glutaminsäure gebildet, was einer auf die eingesetzte flüssige Kohlenwasserstoffquelle als Hauptkohlenstoffquelle bezogenen Ausbeute von etwa 52,5% entspricht, doch bildet der Arthrobacter paraffineus ATCC 19 065 dieser Patentschrift in Propan und η-Butan als Hauptkohlenstoffquellen enthaltenden Nährmedien, wie gefunden worden ist, keine Glutaminsäure.

Ferner beträgt die auf die eingesetzte Hauptkohlenstoffquelle belogene Ausbeute an Glutaminsäure in dem Beispiel 1 der britischen Patentschrift 1 095 724 mit Anthrobacter simplex ATCC 15 799 nur etwa 40% (etwa 20 g Glutaminsäure aus 50 g flüssigem Kohlenwasserstoff), in dem Beispiel 3 der französischen Patentschrift 1461030 mit Micrococcus glutamicus ATCC 13 761 nur erwa 35% (etwa 42 g Glutaminsäure aus insgesamt 120 g Hauptkohlenstoffquelle, bestehend aus etwa 100 g Glukose bzw. Melasse und 20 g flüssigem Kohlenwasserstoff), in dem Beispiel 1 der britischen Patentschrift 1103 754 mit Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15 592 nur etwa 31% (etwa 15,5 g Glutaminsäure aus 50 g flüssigem Kohlenwasserstoff) und in dem Beispiel 2 der britischen Patentschrift 1 085 923 mit Micrococcus paraffir.olyticus ATCC 15 589 nur etwa 27,5% (22 g Glutaminsäure aus 80 g flüssigem Kohlenwasserstoff). Die herangezogenen Beispiele in den genannten Patentschriften haben jeweils die höchsten Ausbeuten.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur .Herstellung von L-Glutaminsäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in Nährmedien, die gasförmige Kohlenwasserstoffe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder flüssige Kohlenwasserstoffe als Hiiuptkohlenstoffquelle enthalten, bei hierfür üblichen Temperaturen und pH-Werten zur Verfügung zu stellen, das zu guten Ausbeuten führt, und zwar sowohl bei Verwendung der gasförmigen Kohlenwasserstoffe als auch der flüssigen Kohlenwasserstoffe.

Diese Aulgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß man bei dem Verfahren zur Herstellung von !-Glutaminsäure der eingangs erwähnten Art Corynebacterium alkanum ATCC 21 194, Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21 195 oder Brevibacterium t'Utanicum ATCC 21 196 einsetzt.

Durch die bei dem Verfahren der Erfindung eingesetzten Stimme wird eine erhebliche Menge !.-Glutaminsäure aus gasförmigen Kohlenwasserstoffen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder flüssigen Kohlenwasserstoffen gebildet.

In Vergleichsversuchen wurden die bei dem Verfahren der Erfindung eingesetzten Stämme mit den Stämmen Micrococcus glutamicus ATCC 13 761 (französische Patentschrift 1461030) und Arthrobacter paraffineus ATCC 19 065 (britische Patentschrift 1 102 906) verglichen. Es wurden folgende hrgebnisse erhalten:

Glutaminsäureausbeute (g/l)

	Verfahren nach dem nachfolgenden	Züchtungsverfahren	Verfahren nach dem Beispiel 4 der britischen Patent
	Beispiel 2	Verfahren nach dem nachfolgenden	schrift 1 102 906
		Beispiel 1
	Propan	KohlenstofThauptquelle	n-Paraffine (C₁, bis C₁₈)
	0	n-Butan	0
Micrococcus glutamicus ATCC 13 761	0	0	35
Arlhrobacter paraffineus ATCC" 19 065	14	0	34
Corynebacterium alkanum ATCC 21 194	15	18	35
Brevibacterium butanicum ATCC 21 196	10	16	36
Hrevi bacterium paraffinolyticum ATCC 21 195	10

912

Der vorstehenden Tabelle ist zu entnehmen, daß lurch die bei dem Verfahren der Erfindung einge-

tzten Stämme eine erhebliche Menge L-Glutamin- % ure aus Propan und Butan und auch aus n-Paraffinen C his C₁₈) gebildet wird. In dem letzteren Fall wird !-Glutaminsäure in einer Menge gebildet, die weit-

ehend der entspricht, die nach der britischen Patentrhrift 1 102 906 erzeugt wird. Doch bildet der Arthrobacter paraffines ATCC 19 065 dieses Stands der Technik in Propan und η-Butan als Hauptkohlen_stoffquellen enthaltenden Nährmedien im Gegensatz zu den bei dem Verfahren der Erfindung eingesetzten Stämmen keine Glutaminsäure.

Die bei dem Verfahren der Erfindung verwendeten neuen Mikroorganismen-Stämme sind natürliche '.solate aus dem Boden und besitzen die folgenden bakteriologischen Merkmale:

C'orynebacterium alkanum ATCC 21 194

ao A) Mi.rphologische Eigenschaften:

Form des Bakteriums: Gewöhnlich werden kurze Stäbchen, häufig unvollkommene Spaltzellen, verästelte Zellen und Zellen vom Knicktyp festgestellt. Größe: 0,5 · 2,5 bis 5,0 Mikron. Beweglichkeit: Unbeweglich.
Sporen: Nicht ausgebildet.
Geissein: Nicht ausgebildet.
Gram-Färbung: Positiv. Säurefestigkeit: Nicht säurefest.

B) Züchtungseigenschaften:

(1) Agar-Kolonien, mittleres Wachstum, kreisrund, glatt, vollständig, konvex, gelblichgrau, glitzernd und opak.

(2) Schrägagar, mittleres Wachstum, fadenförmig, glitzernd, gelblich-grau, geruchlos, butyrös; das Züchtungsmedium wird nicht verändert. *°

(3) Nährbrühe, das Oberflächenwachstum ist schwach, mäßig trübe.

(4) Gelatine-Stichkultur, kein Wachstum oder nur dürftig an der Oberfläche; keine Gelatine-Verflüssigung.

C) Physiologische Eigenschaften:

(1) Optimaltemperatur: 25 bis 3O⁰C (das Wachstum bei 35⁰C ist gering).

(2) Optimal-pH: 5,0 bis 9,0 (kein Wachstum bei pH 4,0).

(3) Sauerstoff-Bedürfnis: Aerob.

(4) Lakmus-Milch: Nicht verändert oder alkalisch.

(5) Schwefelwasserstoff: Wird erzeugt.

(6) Indol: Nicht erzeugt.

(7) Stärke: Wird nicht abgebaut.

(8) Nitrite werden aus Nitraten erzeugt.

(9) Katalase: Positiv.

(10) Ammonium-Produktion: Negativ.

(11) Voges-Proskauer-Test: Negativ.

(12) Nutzbarmachung von Zuckern: Säure wird aus Glucose, Fructose, Mannose, Saccharose, Lactose, Mannit und Sorbit erzeugt.

(13) Assimilatorische Eigenschaft für Kohlen-Wasserstoffe: assimiliert Propan, n-Butan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan und n-Heptadecan.

Brevibacterium butanicum ATCC 21 196 (A) Morphologische Eigenschaften:

Form des Bakteriums: Gewöhnlich werden kurze, stabförmige Zellen, häufig unvollständige Spalizellen und solche vom Knicktyp festgestellt, jedoch keine verästelten Zellen.
Größe: 0,5 · 3,0 bis 6,0 Mikron. Beweglichkeit: Unbeweglich.
Sporen: Nicht ausgebildet.
Geissein: Nicht ausgebildet.
Gram-Färbung: Positiv.
Säurefestigkeit: Nicht säurefest.

(B) Züchtungseigenschaften:

(1) Agarkolonien, reiches Wachstum, kreisförmig, glatt, vollständig, buckelartig, blaßbraun, stumpf und opak.

(2) Schräg-Agar, reiches Wachstum, igelförmig, stumpf, blaßbraun, geruchlos, butyrös, das Züchtungsmediuin wird nicht verändert.

(3) Nährbrühe, das Wachstum an der Oberfläche ist membranartig, fast klar, keine Ablagerung.

(4) Gelatine-Stichkultur, das Wachstum des oberen Teiles ist besser als das des unteren, und es wird keine Verflüssigung beobachtet.

(C) Physiologische Eigenschaften:

(1) Optimal-Temperatur: 25 bis 30° C (das Wachstum bei 37° C ist dürftig).

(2) Optimal-pH: 6,0 bis 9,0.

(3) Sauerstoff-Bedürfnis: Aerob.

- (4) Lakmus-Milch: Nicht verändert oder alka-

üsch.
, (5) Schwefelwasserstoff: Wird produziert.

(6) liidol: Nicht produziert.

(7) Stärke: Wird nicht abgebaut.

(8) Nitrite werden aus Nitraten erzeugt.

(9) Katalase: Positiv.

(10) Ammoniumproduktion: Negativ.

(11) Voges-Proskauer-Test: Negativ.

(12) Nutzbarmachung von Zuckern: Säure wird produziert aus Glucose, Fructose, Arabinose, Mannose, Saccharose, Xylose, Mannit und Sorbit.

(13) Assimilatorische Eigenschaft für Kohlenwasserstoffe: assimiliert Propan, n-Butan, n-Decan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan und n-Heptadecan.

Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21 195

(A) Morphologische Eigenschaften:

Form des Bakteriums: Stäbchen, häufig werden Spaltzellen vom Knicktyp festgestellt, jedoch keine verästelten Zellen beobachtet. Größe: 0,5-2,5 bis 5,0 Mikron. Beweglichkeit: Unbeweglich. Sporen: Nicht ausgebildet.
Geissein: Nicht ausgebildet. Gram-Färbung: Positiv.
Säurefestigkeit: Nicht säurefest.

«DAear-Koionien, reich«, WaC_Stlm ta*, gun*;

flüssige Kohlenwasserstoffe zu assimilieren Dieser «tomm Ut also offensichtlich eine neue Art und wurde

(2)Schräg-Agar_; reiches Wachstum, fadenför- 5Tr PorlnitaSSÜm alkanum benannt.

^m> f *y\?^MiChT"' ^ßenf'"π ^bUty" D So^ynoS" eIo dnung von Brevibactenum

ro^das Zuchtungsmedium w.rd nicht ver- ^ J*^™™, _{21196 wurd}e nach der gleichen

■ ■ Methode bestimmt wie oben beschrieben. Es gehört

(3) Nährbrühe, das Wachstum auf der Oberfläche ^f ρ°^ Χ Brevibacteriaceen der stabf örmigen ist schwach und mäßig trübe. _zdlen ^ _wei, _{es nicht} säurebeständig ist, keine

(4) Gelatine-Stichkultur, kein Wachstum oder Trichome bildet, wegen der grampositiven Eigenschaft, nur schwaches an der Oberfläche; nicht ver- _lfi ^₀, ^jcht-Ausb'ildung von Endosporen und der Tatflüssigt. _{sache> daß} nichtverzweigte Zellen gebildet werden.

Ferner gehört es zur Gattung Brevibactenum wegen der

/r>\ hl · ι · u τ- ι. t* r,\rhtvi>r7uie\eten Stäbchen, die keine Fäden bilden.

(C) Physiologische Eigenschaften: nicntverzweigieii auim-uci, . _v .

⁶ Dieser Stamm wird als sehr naher Verwandter von

(1) Optimal-Temperatur: 25 bis 3O⁰C (das ao Brevibacterium maris, Brevibacteriurn fuscum und Wachstum bei 35°C ist äußerst gering). Brevibacterium ammoniagenes innerhalb dieser (,at-

(2) Optimal-pH: 5,0 bis 9,0 (Wachstum ist be tung angesehen. Dennoch ist dieser Stamm vv,<- _!n pH 4,0 nicht bemerkbar). Tabelle 2 gezeigt wird (a) «»*"*c.von Baj-

„. £ . β η j- f · au bacterium mans hinsichtlich seiner Grolle, des ha-b-

(3) Sauerstoff-Bedürfnis: Aerob. _a5 "X _{Höhe der A}garkolonien, der Produkten

(4) Lakmus-Milch: Nicht verändert oder alka- _von Schwefelwasserstoff und der Wirkung auf Sucrose, lisch. ^ _verschieden von Brevibacterium fuscum hinsichl-

(5) Schwefelwasserstoff: Wird erzeugt. Hch Größe, Farbton, Höhe der Agarkolonien, des

(6) Indol: Wird nicht erzeugt. Wachstums in einer Gelatine-Stich- und in einer

(7) Stärke: Wird nicht abgebaut. 3<> Bouillonkultur und (c) verschieden von Brevibactenom ; ' _X1.₄ ._t , _XT.f _t . ammoniaeenes hinsichtlich seiner Große, der Hohe

(8) Nitrite werden aus Nitraten erzeugt. ST^rkolonien und des Farbtones seiner Kolonien. (9)Katalase: Positiv. Weiterhin ist dieser Stamm verschieden von zwei

(10) Ammonium-Produktion: Negativ. dieser Arten in bezug auf die Beschaffenheit im

(11) Voges-Proskauer-Test: Negativ. 35 Schrägagar und hinsichtlich der Fähigkeit, gasförmige

(12) Nutzbarmachung von Zuckern: Säure wird' und flüssige Kohlenwasserstoffe zu assimilieren. Daher erzeugt aus Glucose, Fructose, Saccharose, wird er als eine neue Art von Mikroorganismus be-Lactose, Mannit und Sorbit. trachtet und als Ürevibactemim butanicum bezeichnet.

(!^Assimilatorische Eigenschaft für Kohlen- ^ ^?^TiStS ^AE

^ orjenommen wie oben*s ^Es gehört

j η j ,TJ j TT zur Familie der Brevibacteriaceen wegen seiner stab-

decan^-Pentadecan.n-Hexadecanundn-Hep- f."^r ^rd"^m"L ,, ·, ' i^t,» cäurpivctanHio Ut

tadecan förmigen Zellen, weil es nicht säurebeständig ist,

keine Trichome bildet, eine grampositive Färbung 45 aufweist und keine Endosporen oder nichtverzweigte

Auf der Grundlage der oben angeführten Eigen- Zellen bildet. Es gehört zur Gattung Brevibacterium schäften wurde die täxonomische Einordnung von der nichtverzweigten Zellen wegen, die keine Fäden Corynebacterium alkanum ATCC 21 194 geprüft unter bilden. Es ist nahe verwandt dem Brevibacterium Berücksichtigung von »Bergeys Manual of Deter- maris, Brevibacterium fuscum und Brevibacterium minative Bacteriology«, 7. Ausgabe (1957). Dieser 50 ammoniagenes innerhalb der Stämme dieser Gattung. Mikroorganismus gehört zur Familie de* Coryne- Dennoch, wie in Tabelle 2 gezeigt wird, ist es verbacteriaceae seiner stabförmigen Zellen wegen, die schieden von Brevibacterium maris (a) hinsichtlich nicht säurefest sind und wegen der Nicht-Ausbildung seiner Größe, des Farbtones, des Wachstums in einer von Trichomen, wegen der Gram-positiven Eigen- Bouillon-Kultur, der Wirkung auf Sucose und der schaft, der Nichtausbildung von Endnsporen, der 55 Produktion von Schwefelwasserstoff, (b) verschieden Bildung von verzweigten Zellen und der Tatsache, von Brevibacterium fuscum hinsichtlich Größe und daß Zucker nicht aerob fermentiert werden. Ferner Wachstum in einer Gelatine-Stichkultur und vergehört dieser Stamm zur Gattung Corynebacterium schieden (c) von Brevibacterium ammoniagenes nach wegen der rundlichen und knickförmigen Spaltzellen Größe und Farbton. Weiterhin ist dieser Stamm ver- und der positiven Katalase-Eigenschaft, die für diese 60 schieden von zweien dieser Arten in bezug auf seine Familie charakteristisch ist. Der Stamm steht Coryne- Beschaffenheit im Schrägagar und hinsichtlich seiner bacterium agropyri und Corynebacterium rathayi Fähigkeit, gasförmige und flüssige Kohlenwasserunter den Arten innerhalb der Gattung Coryne- stoffe zu assimilieren. Daher wird dieser Stamm bacterium ganz nahe. Dennoch ist dieser Stamm, wie ebenfalls als eine neue Art betrachtet und Breviin Tabelle 1 gezeig! wird, von Corynebacterium 65 bacterium paraffinolyticum benannt. Schließlich wird agropyri verschieden, und zwar hinsichtlich seiner dieser Stamm für unterschiedlich von Brevibacterium Größe, der Gram-Färbungs-Eigenschaft und des butanicum gehalten, und zwar wegen Farbton, Glanz Wachstums in einer Bouillon-Schrägagarkultur. Er und Fähigkeit, Zucker zu verwerten.

Tabelle

	Corynebacterium agropyri	Corynebacterium rathayi	Corynebacterium alkanum ATCC 21 194
Größe	0,4 bis 0,6-0,6 bis 1,1	0,6 bis 0,75 · 0,75 bis 1,5	0,5 · 2,5 bis 5,0 Mikron
	Mikron	Mikron
Farbton in einer Bouillon-
Schrägagar-Kultur	• gelb	geiü	gelblich-grau
Gram-Färbung	variabel	positiv	positiv
Verwertung von Zuckern
Glucose	produziert Säure	produziert Säure	produziert Säure
Saccharose	—	produziert Säure	produziert Säure
Lactose	produziert Säure	produziert Säure	produziert Säure
Stä/ke-Abbaufähigkeit ...	schwach	—	keine
Gelaiine-Stich-Kultur	nicht verflüssigt	graduell verflüssigt	nicht verflüssigt
		nach 7 Wochen
Farbton und Wachstum in
einer Bouillon-Agar-
plattenkultur	gelb, schwach, sehr	gelb, langsames Wachs	gelblich-grau, mittleres
	viskoses Wachstum	tum	Wachstum, butyrös

Tabelle

	Brevibacterium	Brevibacterium	Brevibacterium	Brevibacterium paraffinolyticum	Brevibacterium butanicum
	maris	fuscum	ammoniagenes	ATCC 21 193	ATCC 21196
Größe	0,7 bis 0,8 ·	0,6-1,5 Mikron	0,8-1,4 bis 1,7	0,5 · 2,5 bis 5,0	0,5 · 2,5 bis 5,0
	1,0 bis 1,2 Mikron		Mikron	Mikron	Mikron
Bouillon-Agar-	orange-gelb;	bräunlich-gelb;	grau oder hell	hellrosa; konvex	hellbraun;
plattenkultur	konvex	leicht konvex	gelb; flach	bis kopfförmig	buckeiförmig
Gelatine-Stich	nicht verflüssigt	graduell ver	nicht verflüssigt	nicht verflüssigt	nicht verflüssigt
kultur		flüssigt
Nährbrühe	klar, mit orange	Trübung mit	mäßige Trübung	geringes Ober
	Häutchen und	Häutchen und	nahe der	flächenwachs
	Sediment	Sediment	Oberfläche	tum; mäßig
				wolkig
Verwertung von
Zuckern
Saccharose	keine	—	—	produziert Säure	produziert Säure
Lactose	keine	—	—	produziert Säure	produziert Säure
Schwefelwasser
stoff	nicht produziert	—	—	produziert	produziert

Die bei dem Verfahren der Erfindung eingesetzten neuen Stämme sind bei der American Type Culture Collection hinterlegt, und ihnen sind die folgenden Bezeichnungen gegeben worden:

Corynebacterium alkanum ATCC 21 194

Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21 195
Brevibacterium butanicum ATCC 21 196

Es kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Nährmedium verwendet werden, solange es die für das Wachstum des speziell verwendeten Stammes notwendigen Nährstoffe enthält und solange es wegen der Kohlenwasserstoff-Assitnilationseigenschaften der hier eingesetzten Stämme einen gasförmigen Kohlenwasserstoff mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder flüssige Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle enthält. Derartige Nährstoffe sind dem Fachmann bekannt, und sie umfassen Substanzen,

wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl., die von dem verwendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen nutzbar gemacht werden.

Als gasförmige Kohlenwasserstoffe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen können bei dem Verfahren der Erfindung z. B. Äthan, n-Propan, Isopronan, n-Butan, see-Butan, Isobutan und ten-Butan verwendet werden. Geeignete flüssige aliphatische Kohlenwasserstoffe mit 5 bis 18 Kohlenstoffatomen sind z. B. n-Pentan, n-Octan, n-Decan, n-Dodecan, n-Hexadecan. Isopentan, Isooctan. Cycloparaffine. wie Cyclohexan und Cyclooctan, gerad- und verzweigtkettige Olefine, wie z. B. Penten-2, Hexen-1, Orten-1. Octcn-2. Cycloolefine, wie z. B. Cydohexen. Es ist ebenfalls möglich, als KohlenstoffqueUe flüssige aromatische Kohlenwasserstoffe zu verwenden, z. B. Benzol, die isomeren Xylole und Gemische davon, sowie Kohlen-

Wasserstoffgemische, wie ζ. Β. Kerosin, Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle. Selbstverständlich kann man in dem Nährmedium Gemische von zwei oder mehreren dieser Substanzen verwenden.

Geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen, wie Zucker oder Zuckeralkohole, ζ. Β. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen, oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie organische Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure, und Alkohole, wie z. B. Äthanol, n-Butanol, können in dem Nährmedium verwendet werden. Auch diese Substanzen können entweder allein oder im Gemisch von zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden.

Bei dem Verfahren der Erfindung können als Stickstoffquelle die anorganischen und organischen Stickstoffquellen benutzt werden, wie man sie üblicherweise bei Glutaminsäurefermentationen einsetzt. Hierzu gehören verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze bzw. Verbindungen, wie Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat, oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B. Maisqucllwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Kaseinhydrolysate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt. Auch diese Substanzen können wieder entweder einzeln oder in Kombination von zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden.

Zu anorganischen Verbindungen, die dem Nährmedium zugegeben werden können, gehören z. B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, 7inksulfat.

Die Fermentation oder Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen ausgeführt, z. B. als aerobe Schüttelkultur oder unter Rühren und Belüften einer Submerskultur bei einer üblichen Temperatur von beispielsweise etwa 20 bis 5O⁰C und einem üblichen pH-Wert von beispielsweise etwa 4.0 bis 9,0. Nach etwa 3 bis 7 Tagen der Züchtung unter diesen Bedingungen haben sich große Mengen an L-Glutaminsäure in der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit angereichert.

Wenn gasförmige Kohlenwasserstoffe angewendet werden, werden sie als gasförmige Gemische mit Luft oder Sauerstoff zugeführt, und eine Arbeitsweise unter Belüftung wird angewendet. Die Konzentration der verwendeten Gase braucht nicht auf irgendeinen bestimmten Wert beschränkt zu werden.

Bei dem Verfahren der Erfindung können die verschiedenen Arbeitsweisen benutzt werden, die man üblicherweise für Fermentationen unter Verwendung von zuckerhaltigen Materialien oder flüssigen Kohlenwasserstoffen anwendet. Die Züchtungsgeschwindigkeit kann beispielsweise außerordentlich beschleunigt werden durch Zusatz geringer Mengen von nicht verwertbaren Kohlenwasserstoffen zu dem Medium, wobei andere Substanzen ähnliche Effekte haben, oder durch Zusatz oberflächenaktiver Mittel, um die Auflösungsgeschwindigkeit der gasförmigen Kohlenwasserstoffe im Züchtungsmedium heraufzusetzen.

Die Züchtung ist beendet, wenn die L-Glutaminsäureproduktion einen Maximalwert zeigt Nach Abschluß der Züchtung kann man die L-Glutaminsäure durch übliche Maßnahmen gewinnen, z. B. durch Ionenaustauscherharzbehandiung, Lösungsmittelextraktion, Ausfällen, Adsorption, Chromatographie od. dgl. Eine bevorzugte Arbeitsweise besteht darin, die Züchtungsflüssigkeit durch ein Ionenaustauscherharz zu schicken, um die L-Glutaminsäure zu adsorbieren. Sie wird dann eluiert, konzentriert und abgekühlt. Die erhaltenen Kristalle werden gewonnen und erwünschtenfalls weiter umkristallisiert, um reine Kristalle zu erzielen.

ίο Ein Zusatz von Antibiotika oder oberflächenaktiven Mitteln (Dispergiermitteln) zum Medium beschleunigt die Züchtung und erhöht die Ausbeute an L-Glutaminsäure. Zu verwendbaren Antibiotika gehören Penicillin, Bacitracin, Cycloserin, Kanamycin, Strepto-

mycin, Spiramycin, Cefalotin, Cephaloridin und Novobiocin. Zu geeigneten oberflächenaktiven Mitteln gehören anionische, kationische und nichtionische Substanzen sowie höhere Fettsäuren und organische Ester. Es können auch Gemische von Antibiotika

so und Dispergiermitteln verwendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Wenn nicht anders angegeben ist, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel 1

Corynebactenum alkanum ATCC 21 194 wurde als Einsaat-Mikroorganismus verwendet. Es wurde unier aerobem Schütteln 24 Stunden lang bei einem pH-Wert von 7,2 in einem Einsaat-Medium, das 0,25°/,

Hefeextrakt, 0.5% Fleischextrakt, 0,5% Perlon, 0,25% Natriumchlorid und 2,0% Sorbit enthalt gezüchtet, um eine Einsaatkultur'herzustellen. Dif erhaltene Einsaatkuitur wurde in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in _·,7 1 eines zuvor sterilisierter

Zuchtungsmediums, das _In einem 5-1-Jar-Fermentei enthalten war und folgende Zusammensetzung aufwies, eingeimpft:

0,05% KH,PO₄,
0,05% Na₂HPO₄· 12H₂O,
0,01% MgSO₄- 7H,O,
0,001% MnSO₄-4 H"„O
0,001% FeSO₄- 7IUO.
0,001% ZnSO₄-7 H₂O,
0,001 % CaCl₂-2H₂O,
lOy/1 H₃BO₃,
lOy/I Na₂MoO₄-2H₂O,
50 y/I CuSO₄-SH₁O
lOy/1 CaCl₈-2H₂O,
50y/l NiCl₂-OH₄O,

0,05% Maisquellwasser
1,5% (NH₄J₂SO₄.

Der pH-Wert des Mediums betrug 7 2.

Die Züchtung wurde bei 30⁰C während 96 Stunde unter Ruhren mit einer Geschwindigkeit von 600 ϋρΛ und unter Belüftung mit einem gasförmigen Gemisc aus η-Butan und Luft (50 : 5OV0I./V0I.) bei ein« Geschwindigkeit von 1 l/min durchgeführt. Der pH Wert des Mediums wurde während der Züchtun durch Zusatz von wäßrigem Ammoniak zum MeJiui auf 7,2 gehalten. Nach Beendigung der Züchtun betrug die in der Kulturflüssigkeit produzierte un angereicherte Menge an L-Glutaminsäure ie mg/m

Die Mikroorganismenzellen wurden nach Bs

«5 endigung der Züchtung von der Züchtungsflüssigke

mit Hilfe einer Zentrifuge abgetrennt. Danach wird

der pH-Wert der Flüssigkeit auf 2,0 eingestellt. Di

Flüssigkeit wurde durch ein KatinnMu.iict_a,,crWh_fli

(Η-Typ) hindurchgeleitet und das Harz mit wäßrigem Ammoniak eluiert. Das erhaltene Eluat wurde eingeengt und abgekühlt. Als Ergebnis wurden 41 g kristalliner L-GIutaminsäure erhalten.

Beispiel 2

Die Züchtung wurde in der gleichen Weise wie nach Beispiel 1 unter Verwendung von Brevibacterium butanicum ATCC 21196 durchgeführt, jedoch mit der Abwandlung, daß als Hauptkohlenstoffquelle ein Gasgemisch aus Propan und Luft mit einem Mischungsverhältnis von 50 : 50 (Vol./Vol.) benutzt wurde. Nach 96 Züchtungsstunden betrug die in der sich ergebenden Züchtungsflüssigkeit angereicherte Menge an !.-Glutaminsäure 15 mg/ml.

Als Ergebnis eines im Beispiel 1 beschriebenen Gewinnungsverfahrens wurden etwa 33 g L-Glutaminsäure erhalten.

Beispiel 3

Als Einsaatstamm wurde Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 verwendet. Er wurde unter aerobem Schütteln bei einem pH-Wert von 7,2 während 24 Stunden in einem Einsaatmedium, das 0,25% Hefeextrakt, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Pepton, 0,25% Natriumchlorid und 2,0% Sorbit enthielt, gezüchtet, um eine Einsaatkultur zu erhalten. Die erhaltene Einsaatkultur wurde in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in 2,71 eines zuvor sterilisierten und in einem 5-1-Jar-Fermenter enthaltenen Züchtungsmedium der folgenden Zusammensetzung eingeimpft:

0,05%

0,01%

0,001%

lOy/1

50y/l

lOy/1

50y/l

0,3%

1,5%

KH₂PO₄,
NagHPO«

12H₂O,

MnSO₄-4H₂O,
FeSO₄-7H₂O,
ZnSO₄-7H₂O,
CaCl_s-2H,O,
H₃BO₃,

Na₄MoO₄-2H₂O,
CuSO₄-5H₂O,
CoCl₂-2H₂O,
NiCl₂-OH₂O,
Maisquellwasser,
(NH₄)^O₄.

Der pH-Wert des Mediums betrug 7,2.

Die Züchtung wurde in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie sie im Beispiel 1 beschrieben wurden. Nach 30 Züchtungsstunden wurden weiterhin 50 Einheiten/ml Penicillin-G-Kaliumsalz zu dem Medium hinzugefügt, und die Züchtung wurde fortgesetzt. Nach 96 Züchtungsstunden sind 10 mg/ml L-Glutaminsäure in der Züchtungsflüssigkeit produziert worden,
ίο Als die Züchtung in der gleichen Weise wie vorstehend beschrieben, nur ohne Penicillin-Zusatz, durchgeführt wurde, betrug die Menge der produzierten L-Glutaminsäure 0,3 mg/ml.

'5 Beispiel 4

Es wurden 2,71 eines Züchlungsmediums der folgenden Zusammensetzung in einem 5-1-Jar-Fermenter hergestellt und sterilisiert:
ao

0,05% KH₂PO₄,

0,05% Na₂HPO₄ · 12H₂O,

0,01% MgSO₄-7H₂O,

0,001% MnSO₄-4H₂O,
»5 0,001% FeSO₁-7HA

0,001% ZnSO₄-7H₂O,

0,001% CaCl₂-2H₂O,

lOy/1 H₃BO₃,

lOy/1- Na₂MoO₄-2H₂O,
50y/l CuSO₄-SH₂O,

lOy/1 CoCl₂-2H₂O,

50y/l NiCl₂-OH₂O,

0,05 % Maisquellwasser,

1,5% (NH₄)₂SO₄,

1 % n-Dodecan,

0,05% nichtionischer, organischer oberflächenaktiver Stoff.

Der pH-Wert des Mediums betrug 7,2.

Es wurde in der gleichen Weise wie gemäß Beispiel 1 eine Einsaatkultur von Corynebacterium alkanum ATCC 21 194 hergestellt. Die Einsaatkultur wurde in das oben beschriebene Zücht.ungsmedium in einem Verhältnis von 10 Volumprozent eingeimpft.

Die Züchtung wurde in der gleichen Weise wie in dem Beispiel 1 96 Stunden lang durchgeführt. Nach Beendigung der Züchtung hatten sich 21 mg/ml L-Glutaminsäure in der Kulturflüssigkeit angereichert.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von u-Glutaminsäure durch aerobes Züchten vor. Mikroorganismen in Nährmedien, die gasförmige Kohlenwasserstoffe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen oder flüssige Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle enthalten, bei hieifür üblichen Temperaturen und pH-Werten, dadurch gekennzeichnet, daß man Corynebacterium alkanum ATCC 21194, Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 oder Brevibacterium butanicum ATCC 21 196 einsetzt.