DE1442193A1 - Verfahren zur Herstellung von Aminosaeure - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Aminosaeure

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DE1442193A1
DE1442193A1 DE19631442193 DE1442193A DE1442193A1 DE 1442193 A1 DE1442193 A1 DE 1442193A1 DE 19631442193 DE19631442193 DE 19631442193 DE 1442193 A DE1442193 A DE 1442193A DE 1442193 A1 DE1442193 A1 DE 1442193A1
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brevibacterium
medium
hydrocarbons
kerosene
acid
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DE19631442193
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Hiroshi Iizuka
Ryosuke Ishii
Noboru Katsuya
Kazuo Komagata
Shinichiro Otsuka
Isamu Shilio
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Description

ANNASTRASSE 19
FERNSPRECHER: (0611) 555061
TELEGRAMMEt LOMOSAPATENT
LANDESZENTRALBANK 4/951
DRESDNER BANK FFM., Nr. 524742
POSTSCHECK-KONTO FFM. 1667
Y/E FRANKFURT (MAIN), 12. Juli 1963
Ajinomoto Kabushiki Kaislia,
No. 7» Ί-chome, Takara-cho,
Chuo-ku, Tokio, Japan·
Verfahren zur Herstellung von aminosäure.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäure aus Kohölenwasserstoff durch Kultivierung bestimmter Mikroorganismen. Ziel der Erfindung ist,- die Aminosäuren unter Verwendung eines billigen kohlenstofflieferanten zu produzieren.
Gewöhnlich werden bei der fermentativen Aininosäüreproduktion als Kohlenstofflieferanten Kohlenhydrate, insbesondere Glucose, Melassen und Stärkehydrolysate verwendet, wobei die iroduktionskosten für die Aminosäure von dem Ertrag und den Kosten deser landwirtschaftlichen -Produkte abhängen» Mit dem Verfahren gemäss Erfindung ist es gelungen, die Aminosäure durch Fermentation von Kohlenwasserstoffen herzustellen. Hierbei werden die Kohlenwasserstoffe durch bestimmte Mikroorganismen metabolisiert und die Aminosäure bzw. die Aminosäuren aunserhalb der fallen in dem Kulturmedium angeraichert. Die Kohlenwasserstoffe, die in der v'/elt weit verbreitet und in grosser kenge vorhanden sind, sind leicht und billig erhältlich·
BAD ORIGINAL
809809/0721
Das Verfahren gemäss Erfindung zeichnet sich somit!durch· ' ~ ".! ". .. grosse Wirtschaftlichkeit aus« Bislang ist nichts darüber bekannt geworden, dass es möglich ist, Aminosäuren aus .Kohlenwasserstoffen als Hauptlieferanten for kohlenstoff auf chemischem Wege oder auf fermentativem wege mit Hilfe von IiX"kro— ... Organismen herzustellen·
Es gibt einige Berichte, wonach Petroleumchemikalien» wie Essigsäure, Fumarsäure, als kohlenstofflieferanten bei der fermenta— tiven 1-roduktion von ^».!»iinosäuren verwendet worden sind. "Jedoch auch diese sind ziemlich kostspielig. Im Gegensatz dazu weist das Verfahren der Erfindung den Vorteil auf, dass es wesentlich wirtschaftlicher "als die .vorbekannten Verfahren ist. Es wurde, gefunden, dass Kohlenwasserstoffe, wie k-^than, Benzin, Kerosin, metabolisiert werden und mit Hilfe vieler-"'kikroor^'inismen' ausserhalb der Zellen in Kulturmedien Aminosäuren bilden können."In der Lite-
dar
ratur ist bislang nichts/über' bekannt geworden, dass es i,iikro— Organismen gibt, die befähigt sind, Kohlenwasserstoffe zu'assimilieren,und Aminosäuren zu bilden»
Die gemäss Erfindung benutzten Mikroorganismen, die Kohlenwasserstoff zu assimilieren und Aminosäuren in dem Kulturmedium.zu bilden vermögen, sind in verschiedenartigen L.ikrοoi'gänismen, wie Pilzen (fungi), Actinomyceten,, Hefen, Bakterien usw. , weit verbreitet. Die g-mäss. Erfindung' verwendeten LikrοOrganismen haben die ..Fähigkeit..·», in. den folgenden. Le dien a), b), c) und d) zu wachsen·. Sie vmrdän'aus vielen otämmkulturen■(stock cultures) und neu aus der Hatür (natural sources) isolierten Mikroorganismen ausgewählt.
ORIGINAL ■ 809809/0721
Isolatjonsmedium a) Kerosin
,12H2O
Io g
.2 g ■ 1 g ,1,5 g
,^7H2O or5 g
HaCl . _,,, ■■·; : ■ .;.;:' 2 g
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
b) Rohpetroleum
KH2PO4 MgSO4.7H2O MnCl2 CaCl2 FeSO4.7H2O MoSO4 CaCO;, (getrennt entkeimt)
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf -,v
f} gelöstes Methan (und/oder Propan) HH4Cl KH2PO4 „ MgSO
4.
1Q g 2,5 S 1 g
1,5 S ^,5 S o,2 g ■ ßpuren bpjütren Spuren
5 g 1 1
1 S o,5 -g o,2 B Spuren 1 1. ,
(pH 7,2)
(pH
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf
Diesei Medium wird mit einer Gasmischung von Methan (und/oder 'Propan) und Luft (1:1) in Berührung gebracht.
eine, das Wachstum begünstigende Bubstanz
eines der oben angegebenen Lledien
kleine .,-,Menge-.
(wie Hefeextrakt, Maisquellwasöer, Fleischextrakt, Pepton, Proteinhydrolysate und/oder Pas-J/eii qzw. Extrakte, die aus zerkleinerten tierischen oder pflanzlichen Geweben erhalten worden" sind).
BAD ORIGINAL
80 9 80 970721
Zur Isolierung der Mikroorganismen aus der Natur und Bestimmung des Wachstumsvermögens der Stammkultur wird die Agärplatte£-> verwendet, die das obengenannte Medium<£aucn>enthält· Die neu .aus der Hatür isolierten Mikroorganismen werden in der Weise gereinigt, dass man die Agarplattenkultur unter Verwendung der obengenannten Medien wiederholt·
Es hat sich auch als vorteilhaft erwiesen, die Methode der Anreicherung skul tür anzuwenden." In diesem Fall wird eine Probe irgendeinem der obengenannten Medien zugefügt und nach der Kultivierung von einigen Tagen das Medium dieser Anreicherungskultur für die weiter oben angegebene Plattenreinigung benutzt·
Verfahren
Bei dem/gemäss Erfindung werden natürliche Aminosäuren gebildet* Einige Beispiele für die durch den Metabolismus der Mikroorganismen gemäss Erfindung gebildeten Aminosäuren sind Alanin, Asparaginsäure, Lysin, Arginin, Tyrosin, Leucin, Histidin, Cystin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Glycin, Threonin, Tryptophan, Prolin und/oder Serin. Mit den gemäss Erfindung benutzten Mikroorganismen können eine oder mehrere Aminosäuren angereichert werden·
Das gemäss Erfindung verwendete Kulturmedium enthält Kohlenwasserstoffe, Stickstofflieferanten, anorganische Substanzen und eine geringe Menge Substanzen, die das Wachstum begünstigen.
Kohlenwasserstoffe, die gemäss Erfindung verwendet werden, sind Petroleum, seine Eaffinierungsprodukte (refinery), wie Kerosin, <
Naphtha, Leichtöl, Schweröl, Ligroin, Propan, Butan, Propylen und Aethan; und seine dabei erhaltenen Rückstände·
η η r\ nr\r\lr\nf\*
Natürliches oder raffiniertes Gas, wie !..ethan, kann auch verwendet werden. Während alle diese Kohlenwasserstoffe in wasser kaum gelöst werden, kann eine grosse Menge von ihnen durch die genües Erfindung verwendeten Mikroorganismen leicht metabolisiert und in Aminosäuren übergeführt werden. Die Kultivierung muss in der weise durchgeführt werden, dass die Kohlenwasserstoffe mit den Mikroorganismen hi leichtw Berührung gebracht werden. Als zweckmässige kassnahmen haben sich hierfür- , Pulverisieren-fester Kohlenwasserstoffe, heftiges Rühren des Kulturmediums, Einleiten gasförmiger Kohlenwasserstoffe in das ' Kulturmedium sowie Zusatz geeigneter Emulgatoren oder Lösungsmittel erwiesen.
Al-si Stickstofflieferanten werden gemäss Erfindung Ammoniumsalze , wie Aiümoniumchlorid, Amiaoniunisulfat und Ammoniumpiuosphat 5 Hitrate.,i wie. Kaliumm* trat -t gasförmiges oder wässriges Ammoniak und/ader. Harnstoff verwendet. Der otickstofflieferant wird vorzugsweise in.einer Konzentration von o,2 bis 2 0Jo angewandt* Um die Aminosäuren in grosser Menge zu bilden, hat es sich als zweckmässig erwiesen, in dem Verfahren gemäss Erfindung die dem Kulturmedium zuzusetzende Menge organischer stickstoffverbindungen zu begrenzen, da sie, im Ueberschuss angewandt, den Metabolismus der Kohlenwasserstoffe hemmen·
Dem Medium können auch die für das Wqctetum und die Aminosäurebildung benötigten anorganischen Substanzen zugefügt werden. Ferner hat sich der Zusatz einer kleinen Menge wachstumsfördernder Substanzen, wie Hefeextrakt, Maisquellwasser, Fleischextrakt,
BAD ORIGtNAL
en ο«ηQ/η 7 ? 1 ν
Pepton, Proteinhydrolysate und/oder Pasten b.;w. Extrakte, die aus zerkleinerten tierischen oder pflanzlichen Geweben erhalten wurden, als zweckmässig erwiesen.
D ie Kultivierung wird bei einer Temperatur im Bereich von 2o-4o°C, bei; einem pH-Wert im Bereich zwischen 4 und 9 innerhalb von 1-5 Tagen unter aeroben Bedingungen unter Schütteln
das Medium oder -"-uhren durchgeführt. Es ist notwendig/zu schütteln .oder zu rühren, um die besten aeroben Bedingungen aufrecht zu erhalten und die mirkobielle Nutzung der Kohlenwasserstoffe zu erleichtern» Während der Kultivierung sinkt der pH-üert .des Kulturmediums ab, was auf die metabolische Bildung von Aminosäuren aus Kohlenwasserstoffen und anderer »organischer Säuren zurückzuführen ist· Yverden Ammoniumsalze als Stickstoff lief eranten verwendet, so ist das Absinken des pH-wertes auf.den Verbrauch der Ammoniumionen zurückzuführen. Zur Aufrechterhaitsng des geeigneten pH-Wertes können Salze mit Pufferwirkung, beispielsweise Ihosphatsalze» zugefügt werden. Zu demselben Zweck - zur pH-Einstellung - können auch Alkali oder alkalische Lösungen, wie Ammoniakgas, Ammoniakwasser oder ITatriumhydroxyd, verwendet werden· Der Zusatz von Ammoniakgas, Ammoniakwasser oder Harnstoff ist sehr vorteilhaft; wegen seiner Ergänzung als StickstofflieferantaDie in dem Kulturmedium angereicherten. Aminosäuren werden entweder unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes oder durch Kristallisation aus dem zuvor konzentrierten Kulturmedium gewonnen. Die nicht umge se taten Kohlenwasserstoffe können in dem Verfahren gemäss Erfindung sear;; leicht aus dem Medium wiedergewonnen und für weitere |*ermentatip-. nen verwendet werden· ■ --. ... ,-■;. >-; · =
BAD ORIGINAL
809809/0721
Die bakteriologischen Eigenschaften der gemäss Erfindung zu verwendenden Stämme, die neu aus der Natur isoliert und- in den Beispielen verwendet wurden, sind weiter unten angegeben. Alle Untersuchungen wurden nach den in "Manual of Microbiological Method" (Soc. of American Bacteriologists (1957) McGraw Hill Book Comp. Inc.) angegebenen Methoden durchgeführt·
Qorynebacterium oleophilus Iizuka und Komagata
Stäbchen, 0,8 χ 3»ο μ. Vereinzelt werden coccoide Formen und Verzweigungen beobachtet. Keine Sporenbildung· Unbeweglich· Nicht säurefest. Gram-pοsitiv.
Nähragarkolonien: Zirkular, glatt oder mit Falten, konvex gewölbt,
ganz, hellrosa Farbe, undurchsichtig» butterähnlich.
MhragarscbÄgflache: massiges Wachstum, fadenförmig, glänzend oder
matt, glatt oder faltig, hellrosa Farbe·
Nährbrühe: zartes Häutchen·
Nährgelatinestich: keine Verflüssigung.
Milch: ' unverändert
BOP-Milch (brom-cresol-purple-milk): alkalisch, nicht peptonisiert Kartoffel: massiges Wachstum
Nitrate werden nicht zu Nitriten reduziert.
(Variation: Einige ütämme reduzieren Nitrat zu Nitrit) Nitratatmung t negativ
Keine Indolbildung.
Keine Acetylmethylcarbinolbildung.
Keine Schwefelwasserstoffbildung·
Keine Stärkehydrolyse·
α η η α η η i η η
v/eder uaure nocli Gas v,rerden von Glycerin, Xylose, Glufeose, Saccharose, Lactose und ütärke gebildet« Aothanol, Glycerin, Glucose, Gluconat, 2-Ketosluconat, 5-1-etogluconat, Citrat, ,ouccinat und p-Hydroxybsnzoat werden nicht ί-.ls einziger IohleiictoiTliefer^nt benutzt.
x-crosin, n-Decan, n-Undecrxn, n-Dodecan, n-Tetradecan sowie n-Cetan werden als einziger I-ohlonstofflieferant benutzte Optiraale Temperatur; 25^1 Jo0C
Bei 370C spärlichefc oder gar kein wachstum·
katalase: ... i>ositiv
i'undort: Boden
Oorynebacteriuifl hydrocarboclastus Iizuka und Komagata
Stäbchen, 0,8 χ 5,o μ. Vereinzelt werden coccoide Formen und Verzweigungen beobachtet. Leine Sporenbildung. Unbeweglich· Hicht säurefest. Gram-negativ.
Mhragarkolonieni zirkulär, glatt oder mit feinen Palten,
konvex gewölbt, ganz, hellrosa Farbe, undurchsichtig, butterähnlich.
Hahragarschrägflache: massiges Wachstum, fadenförmig, glänzend oefer
matt, glatt oder faltig, hellrosa Farbe.
IYährbriihe: zartes Häutchen
Nährgelatinestich: keine Verflüssigung
Milch: unverändert
BCP-Milch: alkalisch, nicht peptonisiert
Kartoffelϊ massiges Wachstum
Kitrate werden nicht zu Nitriten reduziert·
OHiGIHAL 809809/0721 ·
Nitratatmung: negativ
Keine Indolbildung.
Keine Acetylmethylcarbimolbildung.
Schwefelwasserstoff wird gebildet.
(Variation: Einige Stämme bilden keinen Schwefelwasserstoff. ) Ke i ne 3t ärkehydrοIyse.
(Variation: Einige Stämme hydrolysieren Stärke.) Säure, jedoch kein Gas wird von Glucose, kann von Glycerin gebildet werden.
Aerob wird Säure von Glucose nach der iviathode von Hugh und Leifson gebildet·
Keine Säure und Gas von XyIοse, Saccharose, Lactose und Stärke. Glucose, Gluconat, Citrat, Succinat, p-Hydroxybenzoat und Irotocatechuat werden als einziger Kohlenstofflieferant benutzt. Die Verwendung von Benzoat ändert sich mit den Stämmen· Saljrcylat, m-Hydroxybenzoat, Gentisat und Anthranilat werden nicht als einziger Kohlenstofflieferant benutzt.
Kerosin, n-Decan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Ietradecan sowie n-Cetan werden als einziger Kohlenstofflieferant benutzt. Optimale Temperatur: 25 - 3o°C
Bei j>7°C spärliches oder gar kein Wachstum. Katalase: positiv
Fundort: Boden·
BAD ORIGINAL
809809/072 1
-1ο-
Corynebacterium oleophilus und Corynebacterium hydrocarboclastus wurden mit neuen Species durch Iizuka und Komagata identifiziert und-darüber berichtet auf dem 188. Meeting of Kanto Branch of Agricultural Chemical Society of Japan.
Brevibacterium acetylicum M-1o1
Die klassifizierenden Eigenschaften dieses Stammes sind identisch mit denen von Brevibacterium acetylium, das in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 7· Ausgabe, beschrieben ist·
Es wurden folgende Eigenschaften neu beobachtet:
Keine Acetylmethylcarbinolbildung.
Schwefelwasserstoff wird gebildet.
Keine Säure und Gas werden von Glycerin, Xylose, Glucose, Lactose, Saccharose und Stärke gebildet. Jedoch Säure, aber kein Gas wird aerob von Glucose nach der Methode von Hugh und Leifson gebildet.
Glucose, Gluconat, Citrat, ßuccinat, p-Hydroxybenzoat und Frotpcatechuat werden als einzige Kohlenstofflieferanten benutzt, jedoch Benzoat, Salicylat, m-£ydroxybenzoat, Gentisat und Anthranilat tverden nicht benutzt·
Kerosin wird als einziger Kohlenstofflieferant verwendet.
Katalase: positiv
Fundort: Seewasser
Brevibacterium fulvum A-34-
Die klassifizierenden Eigenschaften dieses Stammes sind identisch mit denen von Brevibacterium fulvum, das in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 7· Ausgabe, beschrieben ist· Es wurden folgende Eigenschaften neu beobachtet:
BAD 80980 9/0 72 1
Uilch? scl^ärzlich briun
BCP-Milch: Alkalisch, nicJat peptonisiert
Keine Indolbildung
Keine Acetjylmetiiylcarbinolbildung.
Keine Schwefelwasserstoffbildung.
Stärke wird hydrolysiert«
Aerob wird Säure aus Glucose nach der Methode von Hugh und Leifson gebildet.
Keine Säure und Gas von Glycerin, Xylose, Glucose, Saccharose, Lactose und Stärke.
Citet und Succinat v/erden als einzige Kohlenstofflieferanten,jedoch Glucose, Gluconat, Benzoat, oalicylat, m-llyäroxybenzoat, p-Hydroxybenzoat, Protocatechuat, Gentisat und Anthranilat werden nicht verwendet.
Kerosin wird als einiger Kohlenstofflieferant benutzt. Katalase: positiv
Fundort: Boden etc.
Achromobacter pestifer S-175
Die klassifizierenden Eigenschaften dieses Stammes sind identiskh.
mit Achromobaeter pestifer, das in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology*1, ?· Ausgabe, beschrieben ist· Es wurden folgende Eigenschaften neu beobachtet:
BCP-Milch: alkalisch
Hiträte werden nicht zu Mitriten reduziert· Hitratatfflungt negativ
Schwefelwasserstoff wird gebildet·
BAD ORIGINAL
809 8 0 9/07 2 1
Aerob werden Säure und Gas nicht aus Glucose nach der Methode von Hugh und Leifson gebildet«
Glucose, Gluconat, Citrat, Succinat, Benzoat, Salicylat, m-Hydroxybenzoat, p-Hydroxybenzoat, Protoeatechuat, Gentisat und Anthranilat werden nicht als einziger Kohlenstofflieferant benutzt·
Kerosin wird als einziger Kohlenstoff}.ieferant benutzt·
Katalase: positiv
Fundort: Boden
Brevibacterium cerinus gov.sp» K-129
Stäbchen, o,6**o,8 x 1,0*1,5 T-t· Keine Sporenbildung, Unbeweglich» Nicht säurefest. Gram-positiv·
Näkragarkolonien: Zirkular, glatt, gewölbt, ganz, schwach
gelbliqh-braun, undurchsichtig, butterähnlicb. Nähr ge la tine s ti ch: keine Verflüssigung MiLch: unverändert
BCP-Mlch: alkalisch
Nitrate werden zu Hitriten reduziert·
Nitratatmung: negativ
Keine Indolbildung.
Acetylmethylcarbinol wird gebildet·
Schwefelwasserstoff wird gebildet·
Stärke wird hydrolysiert.
Keine Säure und Gas von Glycerin, Xylose, Glucose, Saccharose, Lactose und Stärke.
Säure, Jedoch kein Gas wird aus Glucose wowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen nach der Methode von Hugh und
809809/0721 . ^r
LeIfson gebildet·
Citrat, Succinat und m-Hydroxybenzoat werden als einziger Kohlenstofflieferant, jedoch Glucose, Gluconat, Benzoat, SaIicylat, p-Hydroxybenzoat, Protocatechuat und Anthranilat werden nicht benutzt.
Kerosin wird als einziger Kohlenstofflieferant benutzt.
Katalase: positiv
Fundort: Boden etc.
Die beschriebenen Stämme wurden mit neuen Species bestimmt.
Die identischen Species wurden nicht in "Bergey's Lanual of Determinative Bacteriology", 7· Ausgabe, gefunden·
Brevibacterium albus nov.spec. S-27o
Stäbchen, ο,4 χ o,8"*/1t2 μ. Keine Sporenbildung. Unbeweglich. Nicht säurefest. Gram-positiv.
Nähragarkolonien: zirkulär, glatt, konvex, ganz, undurchsichtig, matt gelblich-braun, butterähnlich« liährgelatinestich:§ Verflüssigung Milch: unverändert
BCP-fci1ch: alkali sch
Nitrate werden zu Nitriten reduziert. Nitratatmung:£ negativ Keine Indolbildung. Keine Acetylmethylcarbinolbildung. Schwefelwasserstoff wird gebildet· Keine Stärkehydrolyse· Keine Säure oder Gas aus Glycerin, Xylose, Glucose, Saccharose, Lactose und Stärke»
BAD ORIGiNAL 809809/0721
Aerob wird ßäure aus Glucose"nach dem Methode von Hugh und Leifson gebildete
Gluconat, Citrat, m-Hydroxybenzoat, p-4Iydroxybenzoat und Gentisat werden als einziger Kohlenstofflieferant benutzt, jedoch Glucose, Succinat, Benzoat, clallc^lät, Protocatechuat werden nicht verwendeto
Kerosin wird als einziger Kohlenstofflieferant verwendet.
Katalase: positiv
SHindort: Boden
Der oben beschriebene Stamm wurde mit einer neuen Species bestimmt. Die identische Species vmrde nicht in "Sergey's Manual of Determinative -Bacteriology", §?. Ausgabe, gefunden·
BAD ORIGiFsIAt
8 Q 9 8 O 9 / O 7 2 T
Beispiel 1
Es wurde ein Medium folgender Zusammensetzung hergestellt: Kerosin 2o g
NH4Cl O 2 S
Na2HIO4.12H2O O 1 S
KH2PO4 ,5 S
MgSO4.7H2O ,5 S
NaCl 2 S
destilliertes Wasser 1 1
Nach Einstellung des pH-Wertes des foediums auf 7,5 wurden in
,., c T-Tu -er eingeführt und. Ia1 ,Minuten verschiedene 5oo ccm-Kolben je 5o ecm des kediums/bei T15^> entkeimt. Sodann wurde das Medium eines der Kolben mit Corynebacterium oleophilus Kp6-1414 beimpft und die Kultivierung bei 3o°C unter Schütteln durchgeführt. Nach 4- Tagen wies das Kulturmedium einen L-GIutaminsäuregehalt von 85 mg/1 auf, wie eine Untersuchung ergab«
Beispiel 2
Es wurde ein Medium folgender Zusammensetzung hergestellt: Kerosin 2o g
NH4Cl 6 1o S
Na2HPO4.12H2O 3 ,7 S
KH2PO4 0 ,3 S
MgSO4.7H2O ,5 g
NaCl 2 S
Mn++ 2 mg
Fe++ 2 mg
destilliertes Wasser 1 1
Nach Einstellung des pH-Wertes von 7,2 wurden 5o ecm des Mediums
in einen 5oo ccm-Kolben eingefüllt, 1o Minuten bei 115°C - £ttl· eitkeimt, ««4 mit Corynebacterium oleophilus Kp6-1414 beimpft und die Kultivierung bei 3o°C unter Schütteln durchgeführt·
BAD ORIGINAL "
80 980 9/0721
Nach. 4- Ta^en wies das Kulturmedium einen L-Glutaminsäuregehalt von 161 mg/1 auf·
Beispiel 3
Es wurde ein Medium folgender Zusammensetzung hergestellt: Kerosin 2o g
HH4Cl 3 LTN g
Na2HPO4 1 Λ g
KH2PO4 O ,6 g
MgSO4.7H2O ,5 g
1NaCl 2 g
destillierte® Wasser 1 1
Nach Einstellung des pH-v/erte-s auf 7>2 wurden 5o ecm des Mediums in eine 5oo ccm-Scbüttelflasche eingefüllt-r^Hig im Autoklaven 1o Minuten bei 115°C entkeimt . Sodann v/urde dieses Medium mit den weiter unten angegebenen Mikroorganismen beimpft und die Kultivierung in der in Beispiel 1 angegebenen Weise durchgeführt« Mit den verschiedenen Mikroorganismen wurden folgende Glutamin—
säuremengen im Kulturmedium gebildet:
Tabelle 1 Mikr oorgani smen
gebildete !»-Glutaminsäure (mg/1)
Corynebacterium oleophilus Kp' Corynebacterium oleophilus Kl' Corynebacterium hydrocarboclastus Corynebacterium hydrocarboclastus Corynebacterium Hydrocarboclastus Corynebacterium hydrocarboclastus Corynebacterium hydrocarboclastus Brevibacterium acetylicum M-1o1 Brevibacterium flavmm A-34-Brevibacterium albus S-27o Brevibacterium cerinus K-129
-1399 27
-1452 1o
s-155 81
s-179 69
M-W 281
M-13^ 67
M-137 33
6
12
16
6
809809/0721
BAD OPJGINAL
Beispiel 4
Es wurde ein Medium folgender Zusammensetzung hergestellt:
Kerosin 2o S
NH4Cl 5 S
Na2HPO4.12H2O 3,4 S
KH2H)4 1,6 g
MgSO4,7H2O o,5 g
NaGl 2,o g
Hn++ 2 mg
Fe++ 2 mg
Thiamin-hydrochlorid I00 V-E
Biotin 3 Ug
destilliertes Wasser 1 1
Nach Einstellung des pH-Wertes auf 7»2 wurden 5o ecm des Mediums in eine 5oo ccm-üchattelflasche eingefüllt, im Autoklaven bei 115OC 1o Minuten entkeimt, mit Bßevibacterium flavum 2247 (ATCC No.14o67) beimpft und 9 Tage bei 3o°C unter ociiütteln kultiviert. Im Kulturmedium hatten sich, wie eine Untersuchung ergab, 56 mg/1 L-Glutaminsäure gebildet.
Beispiel 5
Die Kultivierung von Corynebacterium oleophilus Kp6-1414 wurde in der gleichen rfeise, wie in Beispiel 3 angegeben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das in dem kedium enthaltene 1IH4Cl durch NaNO, (I6g/1) ersetzt wurde. Mach einer Kultivierung von 4 Tagen hatte das Kulturmedium einen Glutaminsäuregehalt von 14 mg/1·
Beispiel 6
Die Kultivierung von Corynebacterium oleophilus Kp6-1414 wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt
BAD ORIGINAL 809809/0721
mic der Ausnahme, dass das in dem iiedium enthaltene NELCl durch MELITO-* (7,6 g/l) ersetzt wurde. Bach einer Kultivierung von 4 Tagen hatte das Kulturnedium einen Glutaminsäure gehalt von 36 mg/1«,
Beispiel 7
Es »/urde ein Lsdium benutzt, das Tvie in Beispiel 3 angegeben zusammengesetzt war und als Kohlenstofflieferanten flüssiges lax'affin (2o g/1) anstelle von Kerosin enthielt α
Getrennte. , .. , .,,..., . Ί mengen des Mediums wurden mx"c den ka-kroorgamsmen der Tabelle 2 beimpft und die χ-lultiviorung in derselben »'»'eise, wie in Beispiel 3 be schrie Der., durchgeführt · Die erhaltenen Analysenwerte des Kulturmediums sind in Tabelle 2 enthalten·
iabelle 2
Iiikr ο or gani sine n
gebildete L-Glutaminsäure (mg/1) -
Gorynebacterium oleophilus Kp6—14-14 Corynebacterium hydrocarboclastus S-155 Gorynebacterium hydrocarboclastus H-1o6 Corynebacterium hydrocarboclastus M-134 Brevibacterium flavum (ATGG Ho.16o6?)*
11,7 4,3 3,8 5,4 4,5
* pie Kultivierung dieses Stammes wurde mit einem Ledium durchgeführt, das zusätzlich IvIn 2 mg/1
Fe++ 2 mg/1
Thiamin-Hydrochlorid 1oo mg/1 und
Biotin 3 με/1
enthielt»
Beispiel 8
Es wurde ein Medium, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt, mit Mn++ (2 mg/1) versetzt, mit Gorynebacterium oleophilus Kp6-1414 beimpft und die Kultivierung wie in Beispiel" 3 durchgeführt· Die Analyse des Kulturmediums ergab einen Alaningehalt von 14 mg/1«
BAD ORIGiNAL
80980 9/0721
Beispiel 9
Die Analyse des Kulturmediums, das nach Beispiel 7 erhalten wurde, ergab einen L-Asparagingehalt von 3 mg/1*
Beispiel 1o
Die Analyse des Kulturmediums, das nach Beispiel 7 erhalten wurde, ergab einen L-Lysingehalt von 2 mg/1·
Beispiel 11
Die Analyse des Kulturmediums, das nach Beispiel 7 erhalten wurde, ergab einen L-Arginingehalt von 7 mg/1·
Beispiel 12
Corynebacterium hydrocarboclastus S-155 wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, kultiviert. Die Analyse des Kulturmediums dergab einen L-Tyrosingehalt von 7 mg/1·
Beispiel 13
Achromobacter pestifer S-175 wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, kultiviert. Die Analyse des Kulturmediums ergab einen L-Asparagingehalt von 3 mg/1·
Beispiel
Corynebacterium hydrocarboclastus S-155 wurde, wie in Beispiel 4-beschrieben, kultiviert. Die Analyse des Kulturmediums ergab einen L-glutaminsäuregehalt von 11 ο mg/1·
Beispiel 15
Es wurde, ein Medium folgender Zusammensetzung hergestellt:
BAD OFUG5NAL 80980 9/0721
-2o~ 2o g 1442193
Schweröl 5 g
HH4Ol 3,3 B
Na2HPO4.12H2O 1,7 s
EE2PO4 o,5 g
MgSO4-TH2O 1,5 g
NaOl o,2mg
Riboflavin 0,1mg
Thiaminchlorid 0,1mg
p-Aminobenzoesäure o,1mg
Pyridoxin-Hydrochlorxd o,o2 mg
Pyridoxal o,1 mg
Ca-pantothenat o,1 mg
Nicotinsäure o,1 V-S
Biotin 1 mg
Folsäure 1 1
destilliertes nasser
Nach Einstellung des pH-Wertes auf 7jO wurden 5o ecm des Kediums in'eine 5oo ccm-Schiittelflasche eingefällt, im Autoklaven bei 115°C 1o Minuten entkeimt, mit den Mikroorganismen der Tabelle beimpft und 7 Tage bei 3o°C unter dchütteln kultiviert. Die erhaltenen Änalysenwerte für Glutaminsäure sind in Tabelle 3 enthalten·
Tabelle 3
Mikroorganismen gebildete L-Glutaminsäure (mg/1)
Corynebacterium hydrocarboclastus i¥-1o4- 22,ο Pseudomonas ovalis 24—β 26,4
Escherichia coli WM3o9-1 2o,4
Brevibacterium flavurn 224-?* (ATOO No.14o67) 76,8 Brevibacterium lactoiermentum 2256* - 2o,4-
(ATOO No.13689)
* Diese Bakterien wurden in einem Medium kultiviert, das zusätzlich 2 mg Mn++,
2 mg Fe++,
I00 mg. Thiamin-hydrochlorid und 3 ]ig Biotin pro 1 enthielte
BAD ORIGINAL
809808/0721
Beispiel 16
Es wurde eih Medium benutzt, das, wie in Baispiel -j angegeben,
zusammengesetzt war und als Kohlenstoffliefaranten Leichtöl
(2o g/l) anstelle von Schweröl enthielt»
Das wiedium wurde mit den Likroorganismen der Tabelle 4- beimpft
und bei 3o°C unter Schütteln kultiviert» Die erhaltenen Analysenwerte für Aminosäure sind in Tabelle 4 enthalten.
Tabelle 4
Lkroorganismen gebildete Aminosäure nach
TOobacterium brevicale P-126 L-Glutaminsiure 15»9 mg/1 4 Tagen jTCobacterium brevicale P-127 " 6,9 mg/1 4 Tagen
3eudomonas otalis 24-ß Alanin 28,4 mg/1 7 Tagen
?evibacterium flavum 2247* " ' 44,ο mg/1 7 Tagen ITCC No. 14o67)
*Dieses Bakterium wurde in einem iledium kultiviert, das zusätzlich 2 mg Mn++
2 mg Fe++
1oo \ig Thiaminchlorid und
3 V-g Biotin pro 1 enthielt·
Beispiel 17
EiiHiMedium, das wie in Beispiel 15 beschrieben hergestellt war,
wurden noch. Mn++ 2 mg
Fe++ 2 mg
Thiamiaiiydrochlorid 1oo μg und
Biotin 3 μg pro 1
zugegeben· Das Medium wurde mit Brevibacterium flavum 2247
(ATCC Ho. 14o67) beimpft und 7 Tage bei 3o°C unter Schütteln
kultiviert· Die Analyse des Kulturmediums ergab einen L-Leucingehalt von 24,4 mg/1.
BAD ORIGINAL
8 09809/0721
Beispiel 18
Die Analyse des Kulturmediums, das nach Beispiel 17 erhalten wurde, ergab einen L-fiistidingehalt von 8,6 mg/1.
Beispiel 19
Die Analyse des Kulturmediums, das neich Beispiel 17 erhalten wurde, ergab einen L-Cystingehalt von 4,5 mg/1.
Beispiel 2o
3s wurde ein Medium "benutzt, das wie in Beispiel 14 angegeben zusammengesetzt war und als Kohlenstoff lief eranten Kerosin (2o g/l) anstelle von Schi'/eröl enthielt.
Daa Medium wurde, mit Mikroorganismen der Tabelle 5 beimpft und 4 Tage bei 3o°C kultiviert. Die Analyse des Kulturmediums ergab den in Tabelle 5 aufgef iihrten Gehalt an L-G-lutaminsäure·
Tabelle
Mikroorganismen
gebildete L-Glutaminsäure (mg/1)
Candida lipolytica Y-6-4-Candida lipolytica Y-6-9 Candida lipolytica Y-6-I0 Candida lipolytica Y-8-3 Candida lipolytica Υ-8-Λ Hansenüla anomala Y-32-5 Candida tropicalis YO-129
6,2
6,5
9,5
23,4-11,3
9,o
22,5
BAD
809809/072

Claims (3)

  1. /'1 )j Verfahren zur Bildung von Aminosäuren auf fermentativem Wege, dadurch gekennzeichnet, dass iwikroorga iisinen, die die Fälligkeit haben, in einem der folgenden medien zu wachsen: Medium a), das Kerosin 1o g,
    JNJl4Ol d,0 δ S 1,0 S S KH2PO4 1,5 S S MgUO4.7Ηο0 o,5 S S NaCl 2,0 g S destilliertes Wasser 1 1 g und gegebenenfalls wachstumsbegünstigende Substanzen opuren in sehr geringer k enge enthält, Spuren Medium b), das Rollteti1 oleum 1o NH4NO. 2,5 Na2HPO4.12H2O 1,o KH2PO4 1,5 MgSO4.7H2O 1,5 MnCl2 o,2 CaCl2 FeSO,.. 7H0O
    H- c.
    CaCO^ (getrennt :- entkeimt) 5 g
    destilliertes wasser 1 1
    und gegebenenfalls wachstumsbegönstigende Substanzen in sehr geringer Menge enthält, Medium c), das gelöstes Methan (und/oder Propan)
    ,01 1 s
    KH2PO4 o,5 g
    MgSO4 0,2 g
    FCl^ Spuren und
    destilliertes V/asser 1 1 enthält,
    das mit einer Gasmischung von Methan (und/oder Propan) und Luft (1:1_2 in Berührung gebracht worden ist,
    in Medien, die als Hauptsächlichen Lieferanten für Kohlenstoff Kohlenwasserstoffe und ausserdem Stickstofflieferanten, anorganische
    BAD ORIGINAL
    809809/0721.
    Substanzen und wachstumsbegünstigende Substanzen enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert werden, wobei die gebildete Aminosäure ausserhalb der Zellen angereichert und aus dem Kulturmedium .isoliert wird.
  2. 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenwasserstoffe Kerosin, Leichtöl, Schweröl, Naphtha, Ligroin, Propan, Butan, Propylen,' Aethan, Methan und/oder Naturgas verwendet werden·
  3. 3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismen Corynebacterium oleophilus, Corynebacterium hydrocarboclastus, Brevibacterium acetylicum, Brevibacterium fltivum, Brevibacterium albus, Brevibacterium cerinus, Achromobacter pestifer, Pseudomonas »ovalis, Escherichia coli, Brevibacterium lactofermentum, Mycobacterium brevicale, Candida lipolytica, Hansenula anomala, Candida tropicalis und Brevibacterium flavum verwendet werden·
    8098Ü9/0721
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