DE2102799A1 - Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von L-Threonin und L-Lysin auf mikrobiologischem Wege - Google Patents

Description

"Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von L-Threonin und L-Lysin auf mikrobiologischem Wege"

Priorität: 22. Januar 1970, Japan, Nr. 5 390/70

Es ist bekannt, dass die Aminosäuren L-Lysin und L-Threonin in Getreideproteinen in unzureichender Menge vorhanden sind und dass der Nutzeffekt dieser Getreideproteine durch eine Anreicherung mit diesen beiden Aminosäuren beträchtlich erhöht wird. Weiterhin ist bekannt, dass L-Lysin und L-Threonin zur Erhöhung des Nährwerts von Nahrungsmitteln oder als Zusatz zu Futtermitteln erhebliche Bedeutung haben.

In der USA.-Patentschrift 2 979 439 ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin auf mikrobiologischem Wege beschrieben worden, das zum ersten Mal die Herstellung von L-Lysin ir^ wirtschaftlich durchführbarer Weise gestattet. Jedoch wird nach diesem Verfahren kein L-Threonin gebildet, da hierbei der verwendete

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Mikroorganismus zur Biosynthese von Threonin ungeeignet ist.

Andererseits sind mehrere Verfahren zur Herstellung von L-Threonin auf mikrobiologischem Wege bekannt. Hierbei wird jedoch ein Mikroorganismus verwendet, der zur Biosynthese von L-Lysin ungeeii-yio-t fet und daher kein L-Lysin bildet. Ausserdem ist bei diesen Verfahren die Ausbeute an L-Threonin im Kulturmedium sehr niedrig; vgl. z.B. USA.-Patentschriften 2 937 121 und 2 937 122. Bei einem anderen bekannten Verfahren wird als Ausgangsmaterial das sehr teure L-Homoserin verwendet. Daher i-t dieses Verfahren aus wirtschaftlichen Gründen zur Herstellung von Threonin nicht befriedigend. Darüber hinaus ist die Bildung von L-Lysin in diesem Kulturmedium nicht beobachtet worden; vgl. USA.-Patentschrift 3 099 604, japanische Patentanmeldung 2 896/6I und Sugawara, Nozaki und Nishimura in "Amino Acid and Nucleic Acid" JO (1964), Seite 68. Sogar beim Verfahren zur Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen (vgl. Takayama, Abe und Kinoshita in "Amino Acid and Nucleic Acid" JL£ (1969), Seite 121) und auch beim Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus, der gegen oi-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure resistent ist (vgl. "Agricultural and Biological Chemistry" 33 (I969), Seite 1152), wurde keine Bildung von L-Lysin beobachtet.

Es ist ferner bekannt, dass man bei Verwendung des Mikroorganismus Ustilago maydis ein Gemisch von L-Lysin und L-Threonin erhalten kann, doch betragen die maximalen Ausbeuten an L-Lysin nur 0,8 mg/ml und an L-Threonin nur 0,3 mg/ml; vgl. L.E.Ericson und W.G. Kurz in "Biotechnol. Bioeng." j* (I962), Seiten 23 und JJ.

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Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur gleichzeitigen Herateilung der beiden Aminosäuren L-Threonin und L-Lysin auf mikrobiologischem Wege zu schaffen, das die Nachteile und Schwächen der bekannten Verfahren vermeidet, das wirksam und verhältnismässig einfach in technischem Masstab und mit niedrigen Kosten durchgeführt werden kann und insbesondere eine hohe Ausbeute an den beiden Aminosäuren ergibt. Die Erfindung löst diese Aufgabe.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von L-Tbreonin und L-Lysin auf mikrobiologischem Wege, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man entweder

a) eine Mutante eines Stamms, der gegen Threonin oder Threonin-Analoge sowie gegen Lysin oder Lysin-Analoge resistent ist,oder

b) zwei verschiedene Stämme, von denen der eine gegen Threonin oder Threonin-Analoge und der andere gegen Lysin oder Lysin-Analoge resistent ist,

wobei diese Stämme zu den Glutaminsäure erzeugenden, eoryneförmigen Bakterien ge'hören, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium züchtet, das L-Threonin und das L-Lysin in dem erhaltenen Kulturmedium anreichert und gegebenenfalls das L-Threonin und das L-Lysin in an sich bekannter V/eise daraus gewinnt.

Die erfindungsgemäss verwendbaren Stämme der Glutaminsäure erzeugenden, coryneförmigen Bakterien bilden eine taxcnomisch eng verwandte Gruppe von Bakterien und können den Gattungen Micrococcus, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter oder Microbacterium zugeordnet werden; vgl. Abe et al. in "J.General and

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Applied Microbiology" Γ5 (1967), Seiten 279 bis 501. Diese Stämme bilden Mutanten, die gegen Threonin oder Threonin-Änaloge, wie <X Amino-ß-hydroxyvaleriansäure, ß-Hydroxyleucin oder Norleucin, und/ oder gegen Lysin oder Lysin-Analoge, wie S-(ß-Aminoäthyl)-cystein, 5-Hydroxylysin, 2,6-Diaminoheptansäure, N-£-Formyllysin, trans-2,6-Diamino-4-hexensäure, 2,6-Diaminohexinsäure, 2-Amino-3-(ßaminoäthoxy)-propionsäure, 2-Amino-3-(3'-aminocyclohexyl ^propionsäure, 4-Azalysin oder 2-Amino-2-(3^f-aminomethylcyclohexyl)-essigsäure, resistent sind. Das Vorliegen der beiden vorgenannten Eigenschaften in Kombination ist wesentlich für die g"¹ eichzeitige Bildung von L-Lysin und L-Threonin mittels einer einzigen Züchtung. Weiterhin sind eine Methioninabhängigkeit oder eine -Resistenz gegen Methionin oder Methionin-Analoge, wie Äthionin, $,-Methylmethionin, Norleucin, N-Acetyl-1-norleucin, G-Trifluormethylhomocystein, 2-Amino-5-heptensaure, 2-Amino-4-hexensäure, Methoxinin, Methioninsulfoximin oder Selenomethionin, bevorzugte Eigenschaften.

Die Erzeugung von L-Lysin und L-Threonin nach dem Verfahren der Erfindung kann aber auch durch Verwendung einer gemischten Kultur von zwei verschiedenen Stämmen erreicht werden, von denen der eine gegen Threonin oder Threonin-Analoge und der andere gegen Lysin oder Lysin-Analoge resistent ist. In diesem Zusammenhang muss darauf hingewiesen werden, dass sogar bei Verwendung einer gemischten Kultur von bisher bekannten, nährstoffbedürftigen, L-Lysin bzw. L-Threonin erzeugenden Stämmen diese beiden Aminosäuren, d.h. L-Lysih und L-Threonin, entweder nicht oder in vernachlässigbaren Mengen gebildet werden.

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Erfindungsgenäss "bevorzugte Species unter den !-Glutaminsäure

sind
erzeugenden Mikroorganismen/Brevibacterium flavum, Brevibacterium glutamigenum, Brevibacterium divaricatum, Brevibaeterium lactofermentum, Brevibacterium thiogenitalis, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium sp., Corynebaeterium callunae, Corynebacteriuni acetoaeidophilum, Corynebaeterium melassecola, Corynebaeterium herculis, Corynebaeterium sp., Micrococcus sp., Microbacterium ammoniaphilum, Microbacterium flavum var. glutamicum, Arthrobacter globiformis, Arthrobacter citreus oder /rthrobacter sp.

Beim Verfahren der Erfindung sind beliebige synthetische oder natürliche Nährmedien zur Züchtung der Stämme geeignet, sofern sie die für das V/achstum der verwendeten Stämme erforderlichen Nährstoffe enthalten. Solche Nährstoffe sind bekannt. Sie enthaiten in geeignete! Mengen Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und Spuren von essentiellen Nährstoffen, die ™ von den verwendeten Mikroorganismen verwertet werden.

Beispiele von Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen oder Glycerin, oder geeignete organische Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure oder Brenztraubensäure. Diese Substanzen könenn entweder einzeln oder als Gemisch verwendet werden. Bei Verwendung von Kohlenwasserstoffe assimilierenden Mikroorganismen kann man als Hauptkohlenstoffquelle im Nährmedium auch einen

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Kohlenwasserstoff oder ein Gemisch von Kohlenwasserstoffen vorwenden. Beispiele von Kohl env/assers tof fen sind unverzweigte oder verzweigte Paraffine, wie n-Pentan, n-Octan, η-Dekan, n-Dodekan,

n-Hexadekan, Isopentan oder Isooctan, ferner Cycloparaffine, . wie Cyelohexan oder Gyclooctan, v/eiterhin unverzweigte oder verzweigte .Olefine, wie Penten-2, Hexen-1, Octen-1 oder Octen-2, Cycloolefine, wie Cyclohexen, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, o-Xylol oder p-Xylol, und deren _Ä Gemische, sowie Kohlenwasserstoffgemische, wie Kerosin, Leichtöle, Schweröle oder Par^.ffinöle, wie verschiedene Petroleumfraktionen, einschliesslich Rohpetroleum. Gegebenenfalls kann ein Kohlenhydrat oder eine andere geeignete Kohlenstoffquelle

einem
zusammen mit / Kohlenwasserstoff in dem Ilährmedium verwendet

werden.

Als Stickstoffquellen kommen die verschiedensten anorganischen oder organischen Verbindungen in Frage, wie Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat oder Ammoniumcarbonat, oder natürliche,. Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Casaminosäuren, lösliche Produkte aus Fischen, Reiskleieextrakt, NZ-Amin (enzymatisch aufgeschlossenes Casein), entfettete Sojabchrfenkuehen, Aufschliessungsprodukte, wie aufgeschlossenes Fischmehl oder aufgeschlossener entfetteter Sojabohnenkuchen, oder "Chrysalis"-Hydrolysate. Auch diese Produkte können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.

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Beispiele von verwendbaren anorganischen Verbindungen sind Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, primäres und sekundäres Kaliumphosphat, Eisen(II)-sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat, Mangansulfat oder Calciumcarbonat.

Wenn die Stämme Spuren von essentiellen Nährstoffen, wie Vitamine oder spezielle Aminosäuren, für ihr Wachstum benötigen, werden diese Substanzen selbstverständlich dem Nährmedium zugesetzt, wenn sie nicht bereits in den Bestandteilen des Nährmediums vorhanden sind. Beispiele derartiger Nährstoffe sind Aspa^erJnsäure, Methionin m und/oder Vitamine, wie Biotin, Thiamin oder Cobalamin.

Die Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z.B. durch Schütteln oder unter Rühren und Belüften im Submersverfahren. Man arbeitet bei Temperaturen von etwa 20 bis 40°C und einem p„-Wert von etwa 4 bis 9· Vorzugsweise hält man den p„-Wert während der Züchtung um den Neutral-

punkt, um eine hohe Ausbeute zu erhalten. Diese besonderen Temperatur- und p,-Bedingungen sind jedoch für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung nicht ausschlaggebend. Nach einer Züchtung von 1 bis 5 Tagen haben sich in dem erhaltenen Kulturmedium gleichzeitig grosse Mengen von L-Lysin und L-Threonin angereichert.

Nach Beendigung der Züchtung kann das erhaltene Kulturmedium konzentriert und getrocknet werden. Man erhält hierdurch ein an L-Lysin und L-Threonin angereichertes Futterzusatzmittel. Gegebenenfalls können die beiden Aminosäuren nach üblichen Ver-

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fahren aus dem Kultui'medjuin gemeinsam oder eD'naeln ρ;ο-..'(.'ηη.'-:η werden, ü.B. durch Adsorption an einem Ionrnau.steiusohor, Extraktion mi t Lösungntnitteln, Ausfällung, Absorption odf.-r Chromatographie.

Die Beispiele erläutern die Erfindung, Wenn nicht anders a.ngogeben, beziehen eich Prozentangaben auf das Gericht jo Volumen.

Beispiel 1

Als Anzuchtmikroorgani cirrus wird der sowohl L-Threonin als auch I,-Lysin erzeugende Stamm Coi^ynebacterium glutamicum ATCC 21488 verwendet, der durch mutagene Behandlung von Corynebacterj urn glutamicum ATCC I3032 (Synonym für Micrococcus glutamicus; vgl. auch USA.-Patentschrift 3 003 925) erhalten wurde. Dieser Stamm, der sowohl gegen dan Threonin-Analoge cf-Amino-ß-hydroxyvaleriansKure, als auch gegen das Lysin-Analoge S-(ß-Aminoäthyl)-cystein res.1 stcnt und methioninabhängig j st, wird 24 Stunden bei 30°C unter aeroben Bedingungen und Schütteln in einem Nährmedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet: 2 % Glucose, 1 % Pepton, 1 % Hefeextrakt und 0,3 % Natriumchlorid. Dann wird 1 ml der entstandenen Anzuchtkultur in einen 250 ml fassenden Erlenmeyerlcolben gegeben, der 10 ml eines Nährmediums der folgenden Zueammensetzung enthält:

10 fa Glucose

0,05 ? K₂HPO₄

0,05 Io ΚΗ₉Γ0_Λ

2 $ (HH₄J₂SO₄

0,025 ί> 1-IgSO₄.7H₂O

0,001 ^c/o PeSO,.7H₉O 109839/U9 9^{4 ά}

0,001 # M

2 Jg CaCO-,

400 ug/Liter Biotin

2 rng/Litor Thiarnin-hydrochloi'ld

0,5 % NZ-Aiiiin (enzym"t i sch au

Casein),

Der p„~Wert des Nährmediums beträgt 1,2.

Man züchtet 3 Tage bei JiO⁰C unter aeroben Bedingungen und Schütteln und erhält in dorn entstandenen Kulturmedium 5»5 mg/ml L-Lyi?in und 9*0 mg/ml L-Threonin. Nach dem Entfernen der Zellen der Mikroorganismen und von CaCO₇ werden L-Threonin und L-Lysin aus dem Kulturmedium durch Adsorption an einem Ionenaustauscher gewonnen. Die Ausbeute an L-Lysin und L-Threonin aus 1 Liter Kulturmedium'beträgt 4,4 g bzw. 6,3 g.

Beispiel 2

Als Anzuchtmikroorganismus wird der sowohl L-Lysin als auch L-Threonin erzeugende Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 21649 verwendet. Dieser Stamm ist sowohl gegen das Threonin-Analoge oi-Amino-ß-hydroxyvaleriansäure als auch gegen das Lysin-Analoge S-(ß-Aminoäthyl)-cystein resistent. Die Züchtung wird in der gleichen V/eise und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel h durchgeführt. Die Ausbeute an L-Lysin und L-Threonin beträgt 4,1 mg/ml bzv/. 7,8 mg/ml.

Beispiel 3

Als Anzuchtmikroorganismus wird der sowohl L-Lysin als auch L-Threonin erzeugende Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 21650

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verwendet. Diener Stamm irst sowohl g-sgen ';'::.- Thr<-or;b'j--A:r-ⁿ : ■ ■■; 0(-Amino-i3-hydroxyvaleriansaure als auch zerren daß Lyπ.i n-Ann : or·;·.: S~(ß--Aminoäthyl )-cysteiu reni^tont und rn-:i:hif.r,i:'i^:-:i." i.-] ,'■;. D.1 ■:. Züchtung wird in der gleichen VMj :;e und unter d';n r:'^! ·:·:!.c:hen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ausbeute an L-Lysin und !,-Threonin beträgt 4,6 nig/ml bzw. 6,9 ma/rnl.

B ο i s ρ i Gl H_

AIg Anzuchfcmikroorganinmen worden dor L-LyB.iη orzougomde Ctanui: Corynebaoteriutn glutamicum ATCC 2] 651, dor- gegen öar; Lysin-Analoge S-(ß-Aminoäthyl )-cystein resistant i5jt, und 6er L-Threonin erzeugende Stamm Brevibacterium flavum ATCC 21269, ü^r

das
gegen/Threonin-Analoge c<-Amino-ß-hydroxy valeriansäure resistoiit ist, verwendet. Die Züchtung wird¹ in der gleichen Weine und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, dass das Nährmedium gleichzeitig mit diesen beiden Stämmen beimpft wird. Die erhaltenen Ausbeuten on L-Threonin und L-Lysin betragen J5,6 mg/ml bzw-, 7*3 mg/ml.

Beispiel 5

Als Anzuchmikroorganismus wird der sowohl L-Threonin als auch L-Lysin erzeugende Stamm Corynebaeterium glutamieum ATCC 2]^88 verv/endet. Dieser Stamm wird 24 Stunden bei ^0°C unter aeroben Bedingungen und Schütteln in einem Nährmedium dor folgenden Zusammensetzung gezüchtet: h % Glucose, 2 % Pepton, 0,3 5 % KH₂PO^, 0,05 % K₂HPO^, 0,05 % MgSO^.7H₂O, 50 ug/Liter Biotin und 0,5 ^ Hefeextrakt. 1 ml der entstandenen Anzuchtkultur vdrd

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in einen 25O ml fassenden Erlenmeyerkolben gegeben, der 10 ml eines Nährmediunis der folgenden Zusammensetzung enthält:

10 % Rohrzuckersehwarzmelasse (berechnet als

GDueose) 2 % Sojabohnenkuchenhydrolysat

(erhalten durch Aufschliessen mit 6n HpSOj und Neutralisieren mit wässrigem Ammoniak; berechnet als Sojabohnenkuchen vor dem Aufschluss)

0,3 % Harnstoff 0,05 % HgSOJ₁. 0,07 % PO

CaCO-,.

Der pjT-Wert de's Nährmediums beträgt 1,2.

Man züchtet 3 Tage bei 30⁰C unter aeroben Bedingungen und Schütteln· Die Ausbeute an gebildetem und in dem entstandenen Kulturmedium angereicherten L-Lysin bzw. L-Threonin beträgt 10,3 mg/ml bzw. 15*2 mg/ml.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von L-Threonin und L-Lysin auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, dass man entweder

   a) eine Mutante eines Stamms, der gegen Threonin oder Threonin-Analoge sowie gegen Lysin oder Lysin-Analoge resistent ist,oder

   b) zwei verschiedene Stämme, von denen der eine gegen Threonin oder Threonin-Analoge und der andere gegen Lysin oder Lysin-Analoge resistent ist,

   wobei diese Stämme zu den Glutaminsäure erzeugenden, coryneförmigen Bakterien gehören, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium züchtet, das L-Threonin und das L-Lysin in dem erhaltenen Kulturmedium anreichert und gegebenenfalls das L-Threonin und das L-Lysin in an sich bekannter Weise daraus gewinnt.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei Temperaturen von etwa 20 bis 4o°C und einem p„-Wert von etwa 4 bis 9 durchführt.

   5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den p_H~Wert des Kulturmediums während der Züchtung auf etwa 7,0 hält.

   4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis j5> dadurch gekennzeichnet, dass man einen methioninabhängigen Stamm verwendet.

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   5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm verwendet, der gegen Methionin

   oder Methionin-Analoge resistent ist.

   6. Verfahren nach den Ansprächen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mutante eines Stammes von Corynebacteriun
   glutamicum vexn-zendet.

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Corynebacterium glutamicum ATCC 21488, Corynebacterium
   glutamicum ATCC 21649 oder Corynebacterium gPu^viicuni ATCC
   21650 verwendet,

   8. VerfahreiT. nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man einen L-Lysin erzeugenden Stamm von Coz"ynebacterium glutamicum und gleichzeitig einen L-Threonin erzeugenden Stamm von Brevibacterium flavum .... züchtet.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,, dass man als Mikroorganismen Corynebacterium glutamicum ATCC 21651 und
   Brevibacterium flavum ATCC 21209 verwendet.

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