DE1903336C

DE1903336C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Tryptophan

Info

Publication number: DE1903336C
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara; Hagino Hiroshi Hachioji; Nakayama (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Publication date: 1971-09-23

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vorfahren zur biotechnischen Herstellung von [,-Tryptophan durch uerobes Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlehydrate oder Kohlenwasserstoffe als Kohlonstollqucllo enthaltenden wilßrigen Nlihrmedium bei hierftir üblichen Temperatur- und pH-Werten.

Verfahren zur Herstellung von !--Tryptophan durch Giirung sind bereits bekannt. Beispielsweise wird in der USA.-Patentschrift 2 999 051, der japanisclicn Patentveröffentlichung 12384/60, der japanischen Patenlvcröffentlichung 4632/64, dor französischen Patentschrift 1 437 998 und der USA.-Patcntschrift 3 293 I4J die Zugabe von Indol oder Anthranilsäure zu dem Züchtungsmedium beschrieben. Jedoch sind die Indol- oder die Anthranilsliurevorlaul'cr, die bei derartigen Verfahren eingesetzt werden, teuer. Daher haftet diesen Verfahren der Nachteil an, daß die Kosten zur Erzeugung von Tryptophan zu hoch sind. Darüber hinaus können keine großen Mengen dieser Vorläufer verwendet werden, da sie das Wachstum der Mikroorganismen inhibieren.

Daher wurden Methoden zur Herstellung von !.-Tryptophan ohne Zugabe von Vorläufern zu dem Medium entwickelt. Von derartigen Methoden sei beispielsweise die Methode erwähnt, bei deren Durchführung Mutanten von Escherichia coli eingeset/t werden (vgl. »Journal of Fermentation Technology«. Vol. 43, Nr 5, S. 307 bis 310 |1%5|). Außerdem sei auf eine Methode hingewiesen, bei deren Durchführung ein Züchtungsmedium, das Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle enthält, verwendet wird. Die bei diesen Methoden erzielten Ausbeuten sind jedoch niedrig, und zwar insbesondere bei der Durchführung der letzteren Methode. Die Ausbeuten liegen bei ungefähr nur I mg/1.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von !.-Tryptophan /u schallen, durch welches die Nachteile der bisher bekannten Verfahren überwunden werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur biotechnischen Herstellung von !.-Tryptophan durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlehydrate oder Kohlenwasserstolle als Kohlenstoffquelle enthaltenden wäßrigen Nährmedium bei hierfür übliehen Temperatur und pH-Werten ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus C'orynebacterium glutamicum ATCC 21334 oder Arthrobacter paraffineus ATCC 21333 einsetzt.

Zum Züchten der erfindungsgemäßen eingesetzten Stämme kann man entweder ein synthetisches Nährmedium oder ein natürliches Nährmedium verwenden, vorausgesetzt, daß es die für das Wachstum des verwendeten Stammes wesentlichen Nährmittel enthält. Derartige Nährmittel sind bekannt. Es handelt sich beispielsweise um Substanzen, wie z. B. eine Kohlcnsloffquellc, eine StickstofTquclle, anorganische Verbindungen od. dgl., wobei diese Substanzen von, dem eingesetzten Mikroorganismus in den entsprechenden Mengen verbraucht werden. Ais Kohlenstoffquellc seien beispielsweise Kohlehydrate, wie /.. B. Glucose, Fructose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen, Mannose, Glycerin od. dgl., erwähnt. Diese Substanzen können entweder für sich allein oder in Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden.

Es können in dem Nährmedium auch Kohlenwasserstoffe, beispielsweise n-Paraffinc, Kerosin, Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle od, dgl,, als Kohlenstoflquelle verwendet werden. Diese Kohlenwasserstoffe können auch in Kombination mit einem Kohlehydrat oder einer Kohlehyclraimlschung als Kohlenstoffquelle verwendet werden.

Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff, flüssiger Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumucetat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat od, dgl. Ferner können natürliche Substanzen verwendet werden, die Stickstoff enthalten, wie beispielsweise Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Fleischbrühe, Kaseinhydroiysate, lösliche Fischbestandteile, Reiskleicextrakt, entfetteter Sojabohnenkuchen, Chrysalishydrolysat od. dgl. Auch diese Substanzen können entweder für sich allem oder in Kombinationen aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.

Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliunihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisen(II)-sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat, Mangansulfat, Calcium carbonat od. dgl.

Da die Mikroorganismen, welche in geeigneiu Weise erfindungsgemäß eingesetzt werden, natürlich besondere Nährmittel für ihr Wachstum erfordu , sollten die entsprechenden Mengen derartiger Nälumittel erforderlichenfalls dem Nährmediuni zugesetzt werden. Diese Nährmittel sind gewöhnlich in den stickstoffhaltigen organischen Substanzen, welche als Stickstoffquellcn bezeichnet wurden, enthalten, so iiaiS durch Veixwiuluüg eiitspicchender Mengen dieser Substanzen derartige Anforderungen erfüllt werden. Jedoch müssen die stickstoffhaltigen organischen Substanzen nicht in notwendiger Weise dem Medium zu dem Zweckt zugesetzt weiden, e ,i-it dem erforderlichen Nährmittel zu versorge). - ..:· andere Wachstumsfaktoren, wie beispielweise Aminosäuren, Vitamine, wie z.B. Thiamin, Cobal.jmin od. dgl., oder Biotin, können natürlich dem Medium zugesetzt werden.

Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln oder unter Belüften und Rühren, und zwar bei einer Temperatur von beispielsweise ungefähr 20 bis 40° C und bei einem pH von beispielsweise ungefähr 4,0 bis 9,5. Zur Erzielung von hohen Ausbeuten an !.-Tryptophan ist es zweckmäßig, den pH des Kulturmediums auf ungefähr 7,0 zu halten. Nach ungefähr 2- bis 5tägigem Züchten unter diesen Bedingungen werden merkliche Mengen an !.-Tryptophan erzeugt und in der erhaltenen Fermentationsfiüssigkeit angereichert. Nach Beendigung des Züchtens werden die Mikroorganismenzellen aus dem vergorenen Nährmcdium entfernt, worauf das L-Tryptophan aus der Flüssigkeit nach üblichen Methoden abgetrennt wird, beispielsweise durch Ionenaustauschharzbehandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorption, Chromatographie, Konzentrierung od. dgl. Eine besonders geeignete Methode ist die Behandlung mit einen ionenaustauscherharz, wie sie in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Sofern nicht anders angegeben, beziehen sieh die Prozontangaben auf das Gewicht pro Volumen,

stark saure Kationenaustauscherharz Diaion SK 104, Η-Typ, zur Adsorption des !.Tryptophan« geleitet. Nach dem Waschen der SUuIc mit Wasser wird der durch Eluierung mit 0,5 n-Ammoniukwasscr erluiltene Abfluß zur Trockne eingedampft, worauf das erhaltene rohe kristalline Tryptophanpulver in einer kleinen Menge einer heißen wlißrigen (50¹Vo) Äthanollösung gelöst wird. Die Lösung wird mit Aktivkohle ontfürbt und weiter abgekühlt. Auf diese Weise wer-

B ei spiel 1

Arthrobactcr paraffineus ATCC 21333, ein Histidin erfordernder Mutantenstamm, wird als Impfmikroorganismus verwendet. Dieser Stamm wird auf einen konischen 250-ml-Kolben aufgeimpft, der 30 ml eines Kulturmediums (pH 7,4) enthält. Dieses

Medium enthlilt 2°/o Sorbit, 1% Fleischextrakt, io den 1,5 g ΐ,-Tryptophan-Kristalle erhalten.
0,5°/» Hefeextrakt und 0,3 Vo Natriumchlprid. Das _n . . . „

Züchten wird unter aerobem Schütteln bei 30° C Beispiel ι

während einer Zeitspanne von 24 Stunden zur Ge- Der Histidin erfordernde Mutantenstamm Arthro-

winnung einer Impfkullur durchgeführt, bacter paraffineus ATCC 21333 wird als Impfmikro-

2 ml der erhaltenen Impfkultur werden auf einen 15 Organismus verwendet. Das Züchten wird in der konischen 250-ml-Kolben aufgeimpft, der 20 ml eines gleichen Weise sowie in dem gleichen Medium wie ' j_{m Be}j_Spj_ej j beschrieben durchgeführt, mit der

Ausnahme, daß das Produktionsmedium 10¹Vo Kerosin an Stelle von Sorbit als Kohlenstoffquelle enthält, ao Nach 4tägigem Züchten sind 400rag<l 1-Tryptophan in der erhaltenen Fermentationsflüssigkeit ange-

Produktionsmediums (pH 7,4) enthält. Dieses Medium besitzt folgende Zusammensetzung:

10%	Sorbit
2%	NH₁Cl
0,2 °/o	K₂HPO₁
0,2 »/0	Na₀HPO₁
0,1 »/0	MgSO₁ · 7H.0
10 mg/1	FeSO₁ · 7H_SÖ
10 mg/1	MnSO₁ · 4H,0
10 mg/1	ZnSO₄ · 7H_äb
5 mg/1	Thiaminhydrochlorid
0,3 »/ο	Hefeextrakt
1%	NZ-Amin

reichert.

Beispiel 3

as Corynebacterium glutamicum ATCC 21334, ein Histidin erfordernder Mutantenstamm, wird als Impfmikroorganismus verwendet. Das 2^r.üchten wird in der gleichen Weise sowie in dem gleichen Medium wie im Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Als Ergebnis erhält man L-Tryptophan in der Fermentationsflüssigkeit in einer Menge von 500 mg/l.

2°/o

CaCO,

Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur in dem Produktionsmedium bei 30° C während einer Zeitspanne von 4 Tagen durchgeführt. Nach dieser Zeitspanne beträgt die Menge des erzeugten L-Tryptophans in der Fermentationsflüssigkeit 500 mg/1.

Das vergorene Nährmedium wird zur Entfernung der Mikroorganismen/r ι;..;. > ,..: ;.,..*· κ 5 1 der erh; >!^;.v-i..·?■, ;;U ·('.■"!.!, »-iüssigkeit werden durch das

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von i.-Tryptophan durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlehydrate oder Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoifquelle enthaltenden wäßrigen Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Werti-ii, dadurch gekennzeichnet, daß mad als Mikroorganismus Coiynebacterium giutaiMcum AiCC ^ !314 oder Arthrobacter paratfineus ATCC 21~'^:^ einsetzt.