DE1912799A1

DE1912799A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Threonin und L-Valin

Info

Publication number: DE1912799A1
Application number: DE19691912799
Authority: DE
Inventors: Shigeo Abe; Kenichiro Takayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-03-09
Filing date: 1969-03-07
Publication date: 1970-09-24
Also published as: JPS5146836B1; GB1190546A; FR2003584A1

Description

Kyowa Hakko Kogyo Go., Ltd., Tokyo, Japan.

Verfahren sur Herstellung von L-Threonin und L-Valin

Zusammenfassung der Erfindung:

Verfahren zur gleichseitigen Herstellung von L-Threonin und L-Valin durch Fermentation, wobei ein Kohlenwasserstoff assimilierender Mikroorganismus, der für sein Wachstum Isoleucin, ok-Ketobuttersäure oder ^-Aminobuttersäure benötigt, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen ITährmedium, das Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle enthält, gezüchtet und L-Threonin und L-Valin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit angereichert werden« Speziell für diesen Zweck geeignete Stämme sind Arthrobacter paraffineus ATOO 21220, Oorynebacterium hydrocarboclastus ATOO 21221 und Brevibacterium ketoglutamicum ATCO 21222. Besonders günstige Ausbeuten werden erhalten, wenn man n-Paraffine mit 13 - 18 Kohlenstoffatomen als Kohlenwasserstoffe im Medium verwendet. Durch den Zusatz von L-Homoserin oder von organischen Säuren des Triearbonsäurecyclus zum Medium wird die Ausbeute weiter erhöht.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin und L-Valin. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von L-Threonin und L-Valin durch Fermentation, speziell unter Verwendung von Kohlenwasser-

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stoffe verwertenden Mikroorganismen. L-Threonin und L-Valin sind, z.B. auf dem Ernährungssektor, wichtige Aminosäuren. Es sind bereits fermentative Herstellungsverfahren bekannt, bei denen erhebliche Mengen der betreffenden Substanzen angereichert werden, indem man Mutanten mit verschiedenen Nährstoffbedürfnis-Eigenschaften anwendet und den Stoffwechselablauf dieser Mikroorganismen entsprechend abstellt. Kürzlich sind Kohlenwasserstoff-Fermentationsverfahren entwickelt worden, bei denen sich bestimmte Arten von Produkten durch Züchtung von Mikroorganismen ergaben und Kerosin als Kohlenstoffquelle verwendet worden ist. Die Produktion von Aminosäuren durch Fermentation aus Kohlenwasser-™ stoffen ist ebenfalls bereits untersucht worden. Ein Verfahren jedoch, bei dem erhebliche Mengen an L-Threonin und L-Valin gleichzeitig aus Kohlenwasserstoffen gewonnen werden können₉ ist noch nicht beschrieben worden.

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin und L-Valin, das die Nachteile und Mangel der bisherigen Verfahren ausschaltet.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von L-Threonin und L-Valin durch Fermentation, das in wirksamer und verhältnismäßig einfacher Weise ψ ausgeführt werden kann.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin und L-Valin durch Fermentation, das vorteilhafterweise in industriellem Maßstabe bei niedrigen Kosten und unter Erzielung hoher Produktausbeuten durchgeführt werden kann. J

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist das wie beschrieben hergestellte L-Threonin und L-Valin.

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Diese und weitere Ziele gehen für den Pachmann aus der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen hervor.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass erhebliche Mengen an L-Threonin und L-Valin gleichzeitig aus Kohlenwasserstoffen durch Fermentation unter Verwendung bestimmter nährstoffbedürftiger Mutanten von Kohlenwasserstoffe verwertenden Mikroorganismen hergestellt werden können. Die Verwendung von Isoleucin, 06-Ketobuttersäure oder öO-Aminobuttersäure bedürftigen Mutanten Arthrobacter paraffineus, Corynebacterium hydrocarboclastus und Brevibacterium ketoglutamicum ergibt spezielle Vorteile im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Zu den besonders bevorzugten Stämmen von Mikroorganismen, die bei dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, gehören Arthrobacter paraffineus ΚΪ43Ο3-Η821 ATCC 21220 (bedürftig für Isoleucin, tfUKetobuttersäure odero^-Aminobuttersäure), erhalten durch UV-Bestrahlung von Arthrobacter paraffineus KY4308 ATCC 15591; Corynebacterium hydrocarboclastus KY4-309-H1213 ATCC 21221 (bedürftig für Isoleucin,c6-Ketobuttersäure oder ö6-Aminobuttersäure) erhalten durch Kobalt-60-Bestrahlung von Corynebacterium hydrocarboclastus KY4309 ATCC 15592} und Brevibacterium ketoglutamicum KY4-3O5-H1223 ATCC 21222 (bedürftig für Isoleucin,c(^«etobuttersäure oder et^Aminobuttersäure), erhalten durch UV-Bestrahlung von Brevibacterium ketoglutamicum KY4305 ATCC 15588.

Es kann erfindungsgemäß entweder ein für die Züchtung der verwendeten Stämme geeignetes synthetisches oder natürliches Nährmedium verwendet werden, solange es die für das Wachstum der verwendeten Stämme wesentlichen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt und enthalten Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen usw., die von den Mikroorganismen in angemessenen Mengen nutzbar gemacht werden können.

x^rfindungsgemäß wird als Hauptkohlenstoff quelle ein Kohlen-

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wasserstoff verwendet. Zu solchen Kohlenwasserstoffen gehören gerad- und verzweigtkettige Paraffine (Alkane) mit 10-20 Kohlenstoffatomen, wie n-Decan, n-Dodecan, n-Hexadecan, n-Eicosan usw. sowie Gemische davon und Kohlenwasserstoffgemische, wie Kerosin, Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle usw. Die Ausbeute an L-Threonin und L-Valin ist besonders hoch bei Verwendung von C„, - Csia -n-Paraffinen.

Geringe Mengen anderer Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, Mannose, Glactose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen usw., oder irgendeine andere geeignete ^ Kohlenstoffquelle, wie organische Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure usw., können in dem Züchtungsmedium zusammen mit dem Kohlenwasserstoff benutzt werden. Die Kohlenstoffquelle kann eine einzelne Substanz oder ein Gemisch von zweien oder mehreren sein. -

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen bzw. Verbindungen verwendet werden, wie wässriges Ammoniak oder Ammoniumsalze, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Kaseinhydrolysate, Casamino-" säure, Fischpressäfte, Reiskleieextrakt usw. Auch diese Stoffe können entweder einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren zur Anwendung gelangen.

Zu den anorganischen Verbindungen, die dem Züchtungsmedium zugegeben werden können, gehören Magnesiumsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Ferrosulfat, Manganchlorid, Mangansulfat, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat usw.

Die erfindungsgemäss anzuwendenden Stämme erfordern Thiamin

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und Isoleucin,«,(,-Ketobuttersäure oderoC-Aminobuttersäure für ihr Wachstum« Es sollten daher angemessene Mengen dieser

' Substanzen zum Medium zugesetzt werden. Geeignete Mengen sind 1-5 mg/1 Thiamin und gewöhnlich 5-50 mg/1 Isoleucin, o£-Ketobuttersäure odero6-Aminobuttersäure. Der Zusatz einer überschüssigen Nährstoffmenge, wie von Isoleucin usw., hemmt die Produktion von Threonin und Valin. Da solche Substanzen, wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser und dgl., diese Nährstoffe an sich enthalten, kann man diese Substanzen als Gesamtquelle .oder als Teil der Quelle der vorstehend genannten erforderlichen Nährstoffe verwenden.

Die Fermentation oder Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen ausgeführt, wie aerobem Schütteln der Kultur oder unter Rühren und Belüften einer Submerskultur, und zwar bei einer Temperatur von beispielsweise etwa 20 - 40 C und einem pH-Wert von beispielsweise etwa 5-9· Es ist erwünscht, den pH-Wert während der Züchtung etwa beim Neutralpunkt (7£>) zu halten. Jeder Abfall des pH-Wertes während der Züchtung kann durch Zusatz geeigneter Stoffe, wie Galciumcarbonat, Ammoniakwasser, Ammoniumcarbonat, Natriumhydroxyd usw. zum Medium ausgeglichen werden. Nach etwa 2-5 Züchtungstagen unter diesen Bedingungen haben sich erhebliche Mengen an L-Threonin und L-Valin in der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit angereichert.

Nach Beendigung der Züchtung werden die Mikroorganismenzellen entfernt und dann werden L-Threonin und L-Valin aus der Züchtungsflüssigkeit mit Hilfe üblicher Arbeitsweisen gewonnen, z.B. durch Ionenaustauscherbehandlung, Lösungsmittelextraktion, Ausfällen, Adsorption, Ghromäcographie oder dgl. Die Ionenaustauscherbehandlung wird bevorzugt, und eine solche Arbeitsweise wird in Beispiel 1 beschrieben.

Als Ergebnis der Züchtung ist ferner die Ansammlung von

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^-Ketoglutarsäure, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Leucin, Serin, Alanin usw. in der Kulturflüssigkeit festzustellen. Diese Substanzen beeinträchtigen jedoch nicht wesentlich die Ausbeute an den erfindungsgemäss erwünschten Produkten.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern aber nicht beschränken. Falls nicht anders vermerkt, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser.

Beispiel Λ

Arthrobacter paraffineus KY4-3O3-H821 (ATCC 21220) wurde als Mikroorganismus verwendet. Es wurde unter aerobem Schütteln in einem Bouillon-Medium 24 Stunden lang bei 3O⁰C gezüchtet. Die erhaltene Einsaatkultur wurde im Verhältnis von 5 Vol.-% in 20 ml eines zuvor sterilisierten Züchtungsmediums eingeimpft, das in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben mit Prallplatte enthalten war. Die Zusammensetzung des Züchtungsmediums war folgende:

10% n-Paraffin-Gemisch
2,0%

0,1%

0,1% Na₃HPO₄.
0,01% MgSO₄'
0,002% FeSO₄
0,002% MnSO₄'
1 mg/1 Thiamin
10 mg/1 L-Isoleucin

2% CaCO, (zugesetzt nach getrennter

Trockensterilisierung)

Der pH-Wert des Züchtungsmediums betrug 7»0.

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Die Züchtung wird dann ausgeführt unter aerobem Schütteln bei 28°C. Nach 4-tägigem Züchten betrugen die in der Züchtungsflüasigkeit angereicherten Mengen an L-Threonin und L-Valin 7»5 mg/ml bzw. 12,6 mg/ml, wie mittels eines bioanalytischen Verfahrens bestimmt wurde.

Nach Beendigung der Züchtung wurde die Züchtungsflüssigkeit filtriert, um die Mikroorganismenzellen zu entfernen. Ein Liter des so erhaltenen Filtrates (7»5 g/l an L-Threonin und 12,6 g/l an L-Valin) wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und durch das Ionenaustauscherharz Diaion SK-I (Η-Form) laufen gelassen. Die Harzsäule wurde mit Wasser ausgewaschen und dann mit In Ammoniakwasser eluiert. Diejenigen Fraktionen, die eine positive Ninhydrin-Reaktion zeigten, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck unterhalb 50°C konzentriert, um das Ammoniak zu entfernen. Es wurde Kupfercarbonat zu der konzentrierten Lösung hinzugesetzt, und die erhaltene Aminosäuren-Kupfersalz-Lösung, die gekocht und aufgelöst wurde, wurde durch das Ionenaustauscherharz Diaion SA-21A (OH-Form) geschickt. Der Abfluss bestand aus dem Kupfersalz von L-Valin. Die adsorbierte Substanz wurde mit Wasser gewaschen und mit 0,5 η Salzsäure eluiert, um die Ninhydrinpositiven Fraktionen, d.h. die Lösung des Kupfersalzes von L-Threonin, zu erhalten. Die Kupfersalz-Lösungen der beiden Aminosäuren wurden entkupfert und die Lösungen mit Kohle entfärbt. Die erhaltene Lösung wurde jeweils unter vermindertem Druck konzentriert, und es wurde Äthanol hinzugefügt. Als Ergebnis wurden 5»0 g roher Kristalle von L-Threonin und 7»1 g roher Kristalle von L-Valin erhalten.

Beispiel 2

Arthrobacter paraffineus KY4-303-H821 (ATCC 21220), Corynebacterium hydrocarboclastus KY4309-H1213 (ATCC 21221) und Brexibacteriue ketoglutamicum KYA3O5-H1223 (ATCC 21222) wurden al « Mikroorganismen verwendet. Die Züchtung wurde wie in

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Beispiel 1 beschrieben ausgeführt, mit der Abwandlung, das 10 % verschiedener Kohlenwasserstoffe (in Tabelle 1 gezeigt) als Kohlenstoffquelle eingesetzt wurden. Die Mengen an L-Threonin und L-Valin, die sich nach 4 Züchtungstagen in der Kulturflüssigkeit angereichert hatten, sind aus Tabelle 1 ersichtlich.

Tabelle 1

^v verwendete \. Stämme	Arthrobac te r paraffineus	,0	2,1	Corynebacterium hydrοcarb od astus	3	3	,0	Brevibacterium ketoglutamicum	2,8
\	KY43O3-H821 ATCC 21220	,8	6,5	KY4309-H121 ATCC 21221	Thr. VaI. (mg/ml)	6	,2	KY4305-H1223 ATCC 21222	.6,2
Kohlenstoffquelle \	Thr. VaI. (mg/ml)	,2	10,2	1,8	9	,5	Thr. VaI. (mg/ml)	7,6
n-Undecan	1	,0	12,6	4,5	10	,6	1,5	9,8
n-Dodecan	4	,2	12,8	6,8	10	,0	3,5	8,5
n-Tridecan	6	,0	11,8	7,5	10	,2	5,6	8,8
n-Tetradecan	8	,5	12,3	7,2	11	,0	7,2	9,6
n-Pentadecan	7	,0	12,5	7,0	'9	,8	. 6,8	8,8
n-Hexadecan	8	,8	12,6	7,5	10	,5	7,0	10,2
n-Heptadecan	7	,5	3,8	7,0	4		7,0	4,0
n-Octadecan	7	,2	2,0	7,2	1	,5	6,5	2,0
n-Paraffin-Gemisch (C₁₁-C₁₈)	7	2,6	7,0
Kerosin	2	1,0	2,4
Leichtöl	1	1,2

Thr«» L-Threonin

VaI.: L-Valin

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Beispiel 3

Es wurde, der gleiche Mikroorganismus (Arthrobacter paraffineus ATGO 21220 sowie das gleiche Züchtungsmedium und Züchtungsverfahren wie in Beispiel 1 angewendet. 4-8 Stunden nach Beginn der Züchtung wurden L-Homoserin oder organische Säuren, wie Essigsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure und dgl. (vgl. Tabelle 2), zu dem Züchtungsmedium in einer Menge von 5 mg/ml hinzugefügt, und die Züchtung wurde fortgesetzt. Die Mengen an beiden Aminosäuren, die sich in den KuItürflüssigkeiten nach 4-tägiger Züchtung angereichert hatten, gehen aus Tabelle 2 hervor:

Tabelle 2

hinzugefügte Verbindungen L-Threonin L-Valin

(mg/ml) (mg/ml)

L-Homoserin Natriumacetat Natriumeitrat Natriumsuccinat Natriumfumarat Natrium-L-malat

Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass der Zusatz von L-Homoserin oder einer der organischen Säuren des Triearbonsäureeyelus (bzw. des Natriumsalzes dieser Säuren) zu dem Medium in den meisten Fällen die Ausbeute an L-Threonin und L-Valin erhöht. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird also ein Zusatz von solchen Verbindungen wie L-Homoserin, Essigsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure oder Apfelsäure zum Medium vorgenommen, um die Ausbeute an den erwünschten Aminosäuren weiter heraufzusetzen.

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7,1	10,5
10,3	10,0
10,0	10,0
9,8	10,7
9,1	11,3
9,5	11,3
10,5	11,3

Es ist ersichtlich, dass die Erfindung auf verschiedene Weise variiert werden kann. Solche Variationen sind nicht als Abweichungen vom Erfindungsgedanken anzusehen, wie er für den Fachmann ersichtlich ist.

-Patentansprüche-

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Claims

-11-Patentanspriiche

1. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin und L-Valin, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Kohlenwasserstoff verwertenden
Mikroorganismus, der für sein Wachstum Isoleucin,
öl-Ketobuttersäure oder 06-Aminobuttersäure benötigt, unter
aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium züchtet, das einen Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffgemisch als
Hauptkohlenstoffquelle enthält, und dass man L-Threonin und
L-Valin in der erhaltenen Kulturflüssigkeit anreichert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei einer Temperatur "
pH-Wert von etwa 5-9 durchführt.

die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 20 - 40⁰C und einem

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Arthrobacter paraffineus ATCC 21220 verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC
21221 verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222
verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 10 - 20 Kohlenstoffatomen verwendet.

7· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenwasserstoff ein η-Paraffin mit 15 - 19 Kohlenstoffatomen verwendet.

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8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man etwa 5-50 mg/ 1 der für das Wachstum erforderlichen Substanz zu dem Medium hinzufügt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man etwa 1-5 mg/1 Thiamin zu dem Medium hinzufügt.

10 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man während, der Züchtung den pH-Wert auf etwa 7»0 hält.

Jk 11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zu dem Medium L-Homoserin, eine organische Säure des Triearbonsäureeyelus oder das Natriumsalz dieser Säuren hinzufügt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als organische Säure Essigsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure oder Apfelsäure verwendet.

13. Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von L-Threonin und L-Valin, dadurch gekennzeichnet, dass man Arthrobacter paraffineus ATCC 21220, Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21221 oder Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222

w unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 40⁰C und einem pH-Wert von etwa 6 - 9 in einem wässrigen Nährmedium, das einen Kohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoffgemisch als Hauptkohlenstoffquelle enthält, züchtet, in der erhaltenen KuItürflüssigkeit L-Threonin und L-Valin anreichert und daraus L-Threonin und L-Valin gewinnt.

14. Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenstoff ein η-Paraffin mit I3 - 18 Kohlenstoffatomen verwendet.

15· Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenwasserstoff Kerosin verwendet.

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16. Verfahren nach Anspruch 14-, dadurch gekennzeichnet, dass man zu dem Medium etwa 5-50 mg/1 Isoleucin, o(.-Ketobuttersäure oder oi.-Amino buttersäure hinzufügt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass man weiterhin zu dem Medium etwa 1-5 nig/1 Thiamin hinzufügt.

18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass man zu dem Medium L-Homoserin, eine organische oäur'e des
Tricarbonsaurecyclus oder das Natriumsalζ dieser Säuren hinzufügt.

19· Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man als organische Säure des Tricarbonsaurecyclus Essigsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure oder Apfelsäure
verwendet.

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