DE1912799C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Threonin und L-Valin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechni- oder Achromobacter gehört, wobei in einem Zucker-

schen Herstellung von L-Threonin und L-Valin durch materialien und Homoserin enthaltenden Medium ge-

Züchten von Mikroorganismen unter Verwendung züchtet wird,

eines Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle Ein Verfahren, mit welchem größere Mengen an

enthaltenden Nährmediums and unter Einhaltung von 5 L-Threonin und L-Valin gleichzeitig aus Kohlen-

pH-Werten von 5 bis 9 und Temperaturen von 20 bis Wasserstoffen gewonnen werden können, ist bisher

40⁰C. noch nicht beschrieben worden,

L-Threonin und L-Valin sind wichtige Aminosäuren, Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zu-

z. B. auf dem Ernährungssektor. gründe, ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung

Es sind bereits fermentative Herstellungsverfahren io von L-Threonin und L-Valin zu entwict In, das die

bekanntgeworden, bei denen erhebliche Mengen der Nachteile und Mangel bisher bekannter Verfahren

betreffenden Substanzen angereichert werden, indem ausschaltet So sollten beispielsweise Ausbeuten an

man Mutanten mit verschiedenen Eigenschaften hin- L-Threonin von etwa 10 mg/ml und an i.-Valin von

sichtlich ihrer Närhstoffanforderungen anwendete und etwa 12 mg/ml erreichbar sein. Ein derartiges bio-

den Stoffwechselablauf dieser Mikroorganismen ent- 15 technisches Verfahren sollte weiter die gleichzeitige

sprechend abstellte. Neuerdings sind Kohlenwasser- Herstellung von L-Threonin und L-Valin duvoh Fer-

Stoff-Fermentationsverfahren entwickelt worden, bei mentation ermöglichen und in wirksamer und ver- Vt'elchen sich bestimmte Produkte durch Züchtung von hältnismäßig einfacher Weise durchgeführt werden Mikroorganismen ergaben und Kerosin als Kohlen- können. Schließlich wurde von einem Verfahren zur

stoffquelle verwendet worden ist Die Herstellung von ao Herstellung von L-Threonin und L-Valin auch erwartet.

Aminosäuren durch Fermentation aus Kohlenwasser- daß es sich in vorteilhafter Weise in industriellem

stoffen ist ebenfalls untersucht worden. Maßstab bei niedrigen Kosten und dennoch unter Er-

In der britischen Patentschrift 863 763 wird uie zielung der hohen Produktausbeuten durchführen läßt. Herstellung von Threonin durch Züchten von Eschcri- Die Aufgabe wird erfindungsgemäd gelöst mittels

chia coli in einem Sorbitol oder Mannitol enthaltenden as eines Verfahrens zur biotechnischen Herstellung von

Medium behandelt, jedoch werden, wie aus den Bei- L-Threonin und L-Valin durch Züchten von Mikro-

spielen entnommen werden kann, nur Ausbeuten von Organismen unter Verwendung eines Kohlenwasser-

1,2 bis 3.0 g/l ( 1,2 bis 3,0 mg/ml) erzielt. Die briti- stoff als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nähr-

sehe Patentschrift 889 215 schlägt die Herstellung von mediums und unter Einnaltung von pH-Werten von

Valin durch Züchten eines Mikroorganismus der 30 5 bis 9 und Temperaturen von 20 bis 40⁰C, welches Gattung Paracolobactnim oder Aerobacter in einem dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikro- Zuckermaterialien enthaltenden Medium vor, aber Organismen Arthrobacter paraffineus ATCC 21 220,

auch hier sind nach den Beispielen nur Ausbeuten von Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21 221

4,5 bis 7,8 mg, ml erreichbar. Ähnlich liegen die Er- oder Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21 222

gcbnisse bei der deutschen Auslegeschrift 1217 321, 35 einsetzt

wo der valinproduzierende Mikroorganismus in einem Der Mikroorganismus Arthrobacter paraffineus Zuckermaterialicn enthaltenden Medium gezüchtet ATCC 21 220 benötigt Isoleucin, «-Ketobuttersäure wird, jedoch nach den Beispielen lediglich eine Aus- oder a-Atninobuttersäure und wurde durch UV-Bebeute von 1,5 bis 7,8 mg/ml erzielt wird. Die franzö- strahlung von Arthrobacter paraffineus ATCC15 59 lersische Patentschrift 1486 045 schlägt ein Verfahren 40 halten; der Mikroorganismus Corynebacteriumhydrozur Herstellung von Threonin durch Züchten eines carboclastus ATCC 21 221 benötigt Isoleucin, «-Keto-Mikroorganismus in einem Asparaginsäure enthalten- buttersäure oder Λ-Aminobuttersäure und wurde den Medium vor; hier werden in den Beispielen nur durch Co 60-Bestrahlung von Corynebacterium hydro* Ausbeuten von 0,3 mg/ml erzielt. Die USA-Patent- carboclastus ATCC 15 592 erhalten; der Mikroschrift 3 222 258 betrifft ein Verfahren zur Herstellung 45 Organismus Brevibacterium ketoglutamicum ATCC von Aminosäuren mittels eines Kohlenwasserstoffe 21 222 benötigt Isoleucin, e-Ketobuttersäure oder assimilierenden Mikroorganismus, nach Ausweis des ft-Amirobuttersäure und wurde durch UV-Bestrahbetrcffcnden Beispiels beträgt die Ausbeute jedoch nur lung von Brevibicterium ketoglutamicum ATCC 1.4 mg/1 (l,4y/ml) für Threonin. Im Falle des Valins 15 588 erhalten.

werden Ausbeuten von 21,6 mg/1 (21,68 y/ml) erhalten. 50 Für die Züchtung der ernndungsgemäß verwendeten Die USA.-Patentschrift 3 028 310 betrifft ein Verfah- Stämme kann entweder ein synthetisches oder natürren zur Herstellung von 1 -Valin aus Zuckermateria- liches Nährmedium verwendet werden, solange es die lien, jedoch beträgt auch hier die Ausbeute nach den für das Wachstum der verwendeten Stämme wesent-Bcispielen nur 4,5 bis 7,8 mg/ml. Etwa ähnliche Er- liehen Nährstoffe enthält. Derartige Nährstoffe sind gtlHtisM tr reicht die USA.-Patentschrift 3 099 604, 55 bekannt und enthalten Substanzen, wie eine Kohlendie auf ein Verfahren tür Herstellung von L-Tbreorun stoffqueUe, afc» SUckstoOquelle, anorganische Ver· durch Zugabe von !.-Homoserin ro dem Medium in bindungen usw., die von den Mikroorganienien in angeeignetem Zettabstaad gerichtet iat und Ausbeuten gemessenen Mengen nuttbar gemacht werden können, von nur 0,2 bis S.3 mg/ml beschreibt; die USA -Patent- Ab HauptkoMemtofrqucNe wird ein Kohknwaseer· ichrift 2 973 103, welche auf ein Verfahren tür Her- Co stoff verwendet Zu solchen Kohlenwasserstoffen gesteflung von 1.·Valin durch Zuchten von Escherkhia hören «rad· und vertweigtkettige Paraffine (Alkane) coN in einem Zuckermeterialien und !»Threonin ent- mit 10 bis 20 Kohlenstoff atomen, wie n-Decan, he Medium gerichtet ist und Ausbeuten von n-Dodevan, n-Henadecan, n-Ewosan usw. sowie

μa*a ^B Bb^MB. ^B BBB^B)MBUbbI e^eVBBB^MsB^^B ^B^tfwVA^BLeMBBBBfHBB. bBbm^BmB! μΛΛ *^^λ B^T-JK^^Bi^^BjBbW^B. J^^Bke^u^^Bft .^^*«l mg e^aVBB^B^ft^^te^k^^^^^BHMMAj^^BYBBB^eVBt^^BrfVBA^B.

BHeUBj ^K HBBbI ^B BBBBkA BBBB eBB/BBVBKJ^BBB ^BBj^^BBBBBBBBjSEJ^Bm WBj^HB/BS ΙΠ BBBaB/ B^ BBV^^^BSBBaiBBBVi B^BBbBBKBBB BBmVBB ^bV ΒΒΠVBTBvBB/BMBBBB7B^BjB.mBBBBjBBBjBBBBBjJBBBjf WWV Bk BFVWP ^ ^^^W·*" "* V WBJWB # VBVJVBVVVBVBBBVBjlBY W VV BV III WVB>V V^BJ BBBJBj WBjP BBBWBjVBBf BJJ VvBV VV ^FW VBJ VV VV eBBBBB/V BWBVBV BBBBMJVVBJBJIVVWPf

franfösischen Patentschrift 14M %A6 em Verfahren t§ wie Kevoate, LetchtöM, Schweröle« Parefltoöle usw.

tut HetsteNung von L-Threonrn durch ZSchten eine· Ph) Auebaute ta t-Threonm und t.«Valm let baedes

Miaroorgamsmus vorgescnMgen« wetcncr zu oer voiiig docb Bei verwenoung vim 1. |^~C||*n«nrvBMMBv

veren Mifcroorpisa Pseudomonas Oertnge Mengen anderer Kohlenetoftqueflen, wie

I 912799

Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, Mannose, Glactose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen usw., oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie organische Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure usw., können in dem Züchtungsmedium zusammen mit dem Kohlenwasserstoff benutzt werden. Die Kohlenstoffquelle kann eine einzelne Substanz oder ein Gemisch von zweien oder mehreren sein.

Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen bzw. Verbindungen verwendet werden, wie wäßriges Ammoniak oder Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Kaseinhydrolysate, Casaminosäure, Fischpreßsafte, Reiskle>eextrakt usw. Auch diese Stoffe können entweder einzeln oder in Kombination von zweien oder mehreren zur Anwendung gelangen.

Zu den anorganischen Verbindungen, die dem Züchtungsmedium zugegeben werden können, gehören Magnesiumsulfat, Dinatriumhy'drogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Ferrosulfat, Manganchlorid, Mangansulfat, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat usw.

Die erfindungsgemäß anzuwendenden Stämme erfordern Thiamin und Isoleucin, «-Ketobuttersäure oder Λ-Aminobuttersäure für ihr Wachstum. Es sollten daher angemessene Mengen dieser Substanzen zum Medium zugesetzt werden. Geeignrte Mengen sind 1 bis 5 mg/1 Thiamin und gewöhnlich 5 bis 50 mg/1 Isoleucin, «-Ketobuttersäure oder a-Aminobuttersäuie. Der Zusatz einer überschüssigen Nährstoffmenge, wie von Isoleucin usw., hemmt die Produktion von Threonin und Valin. Da solche Substanzen, wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser u. dgl., diese Nährstoffe an sich enthalten, kann man diese Substanzen als Gesamtquelle oder als Teil der Quellt der vorstehend genannten erforderlichen Nährstoffe verwenden.

Die Fermentation oder Züchtung der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wie aerobem Schütteln der Kultur oder unter Rühren und Belüften einer Submerskultur, und zwar bei einer Temperatur von beispielsweise etwa 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert von beispielsweise etwa S bis 9. Es ist erwünscht, den pH-Wert während der Züchtung etwa beim Neutralpunkt (7,0) zu halt' leder Abfall des pH-Wertes während der Züchtung -.un durch Zusatz geeigneter Stoffe, wie Calciumcarbonat, Ammoniakwasser, Ammoniumcarbonat, Natriumhydroxyd usw. zum Medium ausgeglichen werden. Nach etwa 2 bis S Züchtungatagen unter diesen Bedingungen haben sich erhebliche Mengen an i.-Threonin und !.-Valin in der erhaltenen ZBchtungsRüssigkeit angereichert.

Nach Beendigung der Züchtung werden die Mikro- ofganiMnefuetlen entfernt und dann werden l-Threonin und L-VaHn au· der Züchtungsflüssigkeit mit Hilfe üblicher Arbeitsweisen gewonnen, z. B. durch Ionenaustauscherbehandlung, lösungsmittelextraktion, Ausfallen, Adsorption, Chromatographie od. dgl. Die lonenauttauscherbehandlung wird bevorzugt, und eine solche Arbeitsweise wird im Beispiel 1 beschrieben.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Fette nicht anders vermerkt, beziehen sich οι · Proantangaben auf das Gewicht pro Volumen.

Beispiel 1

Arthrobacter paraffines ATCC 21 220 wurde als Mikroorganismus verwendet. Es wurde unter aerobem Schütteln in einem Bouillon-Medium 24 Stunden lang bei 30⁰C gezüchtet. Die erhaltene Einsuutkultur wurde im Verhältnis von 5 Volumprozent in 20 ml eines zuvor sterilisierten Produktionsmediums einimpft, das in einem 250-ml-Er!enmeyerkolben mit Prallplatte ίο· enthalten war. Die Zusammensetzung des Produktionsmediums war folgende: '

10°/₀ n-Paraffin-Gemisch (C_n-C₁₈)

2,0 ·/„ (NH₄)₂SO₄

0,1 «/„ KH₈PO₄
0,1 °/_e Na_nHPO₄ -12 H-O

0,01 °/₀ MgSO₁ -7 H,O

0,002 ⁰/₀ FeSO₄-7 H₂O

0.002⁰Z₀MnSO₄-4HjO

1 mg/1 Thiamin
^ao 10 mg/1 L-lsoleucin

2°/„ CaCOj (zugesetzt nach getrennter
Trockensterilisierung)

Der pH-Wert des Produktionsmediums betrug 7,0.

as Die Züchtung wild dann ausgeführt unter aerobem Schütteln bei 28° C. Nach 4tägigcm Züchten betrugen die in der Fermentationsflüssigkeit angereicherten Mengen an L-Thrconin und L-Valin 7,5 bzw. 12,6 mg/ ml, wie mittels eines bioanalytischen Verfahrens bestim-.t wurde.

Nach Beendigung der Züchtung wurde die Fermentationsflüssigkeit nitriert, um die Mikroorganismenzellen zu entfernen. 1 Liter des so erhaltenen Filtrates l/,5g/l an i.-Threonin und 12,6 g/l an L-Valin) wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und durch das Ionenaustauscherhar/ Diaion SK-I (H-Form) laufen gelassen. Die Harzsäule wurde mit Wasser ausgewaschen und dann mit In-Ammoniakwasser eluiert. Diejenigen Fraktionen, die eine positive Ninhydrin-Reaktion zeigten, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck unterhalb 50⁰C konzentriert, um das Ammoniak zu entfernen. Es wurde Kupfercarbonat zu der konzentrierten Lösung hinzugesetzt, und die erhaltene Aminosäuren-Kupfersalz-Lösung, die gekocht und aufgelöst wurde, wurde durch das Ionenaustauscher harz Diaion SA-21A (OH-Form) geschickt. Der Abfluß bestand aus dem Kupfersalz von ι -Valin. Die adsorbierte Substanz wurde mit Wasser gewaschen und mit O.5n-Salzsäure eluiert, um die ninhydrinpositiven Fraktionen, d. h. die Lösung des Kupfersalzes von L-Threonin, zu erhalten. Die Kupfersalzlösungen der beiden Aminosäuren wurden entkupfert und die Lösungen mit Kohle entfärbt. Die erhaltene Lösung wurde jeweils unter vermindertem

Druck konzentriert, und es wurde Äthanol hinzugefügt. Als Ergebnis wurden 5,0 g roher Kristalle von L-Threonin und 7,1 g roher Kristalle von L-Valin er· halten.

Beispiel 2

Arthrobacter paraffine« ATCC 2t 220, Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21221 und Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21 222 wurden als Mikroorganismen verwendet. Die Züchtung •β wurde, wie im Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt, mit der Abwandlung, daO 10·/, verschiedener Kohlen* Wasserstoffe (in Tabelle 1 gezeigt) als Kohlenstoff· quelle eingesetzt wurden. Die Mengen an i.-Threonin

und i.-Vnlin, die sieh nach 4 Züchiungstagen in der rcrmcntiUionsllUssigkeU angereichert holten, sind aus Tabelle 1 ersichtlich.

Tabelle 1

Kohlensloflquclle

n-Undccan .,. n-Dodecan ... n-Tridccan ... n-Tctradecan n-Pcntadccan n-Hexadecan n-Heptadecan n-Octadecan .. n-Paraffin-

Geir.isch

(C₁₁ C₁₈)..

Kerosin

Leichtöl

Arlhroboclcr
paruffincus

ATCC 21220

Thr. I VaI. (mg/ml)

Verwendete Stamme

1,0 4,8 6,2 8,0 7,2 8,0 7,5 7,0

7,8 2,5 1,2

2,1 6,5 10,2 12,6 12,8 11,8 12,3 12,5

12,6 3,8 2,0

Corynebncierium

hydrocarhoclpstus AICC 21221

Thr. I VaI. (mg/ml)

1,8 4,5 6,8 7,5 7,2 7,0 7,5 7,0

7,2 2,6 1,0

3,0

6,2

9,5

10,6

10,0

10,2

11,0

9,8

10,5 4,0

1,5

Brevibacicrium

kelo-

gluiainicum

ATCC 21222

Thr. I VaI.

(mg/ml)

1,5 3,5 5,6 7,2 6,8 7,0 7,0 6,5

7,0 2,4 1,2

2,8 6,2 7,6 9,8 8,5 8,8 9,6 8,8

Thr.: L-Threonin.
VaI.: L-Valin.

Beispiel 3

Es wurde der gleiche Mikroorganismus (Arthrobacter paraffmeus ATCC 21 220) sowie das gleiche Produktionsmedium und Züchtungsverfahren wie im Beispiel 1 angewendet. 48 Stunden nach Beginn der Züchtung wurden !.-Homoserin oder organische Säulen, wie Essigsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure u. dgl.

(vgl. Tabelle 2), zu dem ZPchtMngsmedi'um in einer Menge von 5 mg/ml hinzugefügt, und die Ziichtung wurde fortsesetzt. Die Mengen »n beiden Aminosäuren, die sich in den Fermentationsflüssigkeiten nach 4tägiger Züchtung angereichert hatten, gehen aus Tabelle 2 hervor:

Tabelle 2

ju — Hinzugefügte Verbindungen	L-Threonin (mg/ml)	i-Valin (mg/ml)
O	7,1 10,3 10,0 9,8 9,1 9,5 10.5	10,5 10,0 10,0 10,7 11,3 11,3 11,3
15 L-Homoserin Natriumacetat Natriumeitrat Natriumsuccinat Natriumfumarat 20 Natrium-L-malat

Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß der Zusatz von

!.-Homoserin oder einer der organischen Säuren des

Tricarbonsäurecyclus (bzw. des Natriumsalzes dieser Säuren) zu dem Medium in den meisten Fällen die Ausbeute an L-Threonin und L-Valin erhöht

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung von

   L-Threonin und L-Valin durch Züchten von Mikroorganismen unter Verwendung eines Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Nährmediums und unter Einhaltung von pH-Werten von 5 bis 9 und Temperaturen von 20 bis 40'C, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Arthrobacter paraffineus ATCC 21220, Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21 221 oder Brevibactcrium ketoglutamicum ATCC 21 222 einsetzt.