DE1442266A1

DE1442266A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsaeure

Info

Publication number: DE1442266A1
Application number: DE19651442266
Authority: DE
Inventors: Mamoru Kohata; Kiyoshi Udagawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1964-12-18
Filing date: 1965-12-17
Publication date: 1968-12-05
Also published as: US3411990A; JPS5136355B1; FR1461030A; GB1110698A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstelliing Ton L-Ulutamlneäure, und swar duroh Fer»»ntation* Die Erfindung betrifft epeiiell ein Verfahren sur Herstellung Ton !»-Glutaminsäure durch Fermentation alt Hilfe τοη Mikroorganisaen aus Kohlenhydraten oder organischen Säuren in Gegenwart τοη Kohlenwasserstoffen·

Aue der japanisohen Patentsohrift 263 709 ist bekannt» dsJ bei der fexmentatiren Herstellung τοη L-GHutejiineäure au· Kohlenhydraten oder organischen Säuren bemerkenswert grele Mengen an L-aiutaeineäure angesamelt werden, wen* Ia Qegenwart tob Bietin und biotinaktiren Substaniea in eu¥- optlealer Menge. d«h« also in geringerer Menge, als sie für ein aasiaales Waohstus der !-Glutamin·äure produsierendtn Mikroorganiesen erforderlich ist, gearbeitet wird» Liegt der Gehalt an Biotin und blotlnaktlTen Subetan«en höher als er

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für das maximale Wachstum der Mikroorganismen erforderlich ist» wird die Bildung von L-Glutaminsäure gehemmt» Ia letzteren Falle werden nur gering· Mengen !-Glutaminsäure angesammelte

Weiterhin bestehen insofern Probleme, als bei der industriellen Herstellung von !-Glutaminsäure durch Fermentation unter Verwendung verhältnismäßig billiger Auegangsmaterialien, wie as©B* von Kohlenhydratmaterialien wie SiiSkartoffelm&laeeen» Rübenmelassen» Rohzucker, Stärk®«· veriuekerungsflüssigkeit und dgl»_t odsr von unreinen organischen Säuren,, wie s*B* Essigsäure» Citronensäure, Hilehsäur·, Ketosäuren und dgl·, als Quelle für Kohlensteif di» Fermentation duroh äi· in diaewn Materialien enthalt cm tn Verunreinigung·!* et&i-x $*tiimm% wird* Es gibt mehrer· &rtin&« dafür» weshalb bei der ¥erw*ndusg derartiger AuKgangsmaterialien die fermentative Bildung von L~£lutaminsäure gehemmt wird* Einer der bedeutsamsten dieser Gründe i»t 4er EiBfIuS von Biotin lind biotinaktiven Subetanatn auf das Ttnatntatloneverf&hren, v«na fies· Subetanaten in t«e Kulturaefiium in höheren Konaentrationea vorliaad«a eind, als sit für *ae Maxiss*!« Waoheiiu» d&r L-Olutasinsäurs fcild*nd*n Mikroorganieietn *rfor4»rltch ist.

Zur Üb»rwiaiuog fl»r im veret*hen4tn beeohriebsnan -aiutaalüiäure-EilAur^ ein* veraohieden« Terfahren vzTf*ohl*£*R word·«. E* ist u.a.

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vorgesohlagen worden, in Gegenwart τοη Antibiotics (vgl_e japanische Patentschrift Nr. 1695/1962), von wachstumshemmenden Substanzen (vgl· japanische Patentschrift Nr· 5450/1964) und von oberflächenaktiven Mitteln (japanische Patentschriften Nr · 8798/1965 und Nr₀ 14559/1965) zu suchten·

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Grlutaminsäure zu entwickeln, mit dessen Hilfe die bei den bekannten Verfahren auftretende Hemmung der Fermentation überwunden werden kann·

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation, das in wirksamer und einfacher Weise durchgeführt werden kann«

Ziel der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von L-G-lutaminsäure durch Fermentation, das das Produkt in guter Ausbeute liefert«

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaainsäure durch Fermentation, das in vorteilhafter Weise Im industriellen Maßstab durchgeführt werden kan& und dabei hohe Produktausbeuten liefert«

Diese und weitere Ziele und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor·

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß die obengenannten

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Hachteile überwunden werden können und die Produktionsausbeute an L-Grlutaminsäure gesteigert /werden kann, wenn man dem Kulturmedium Kohlenwasserstoffe zusetzt_o So ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Yerfahrens nicht nur möglich, verhältnismäßig billige Ausgangsmaterialien zu verwenden, sondern man erhält gleichzeitig eine hohe Ausbeute an Produkte Bas erfindungsgemäße Verfahren ist daher als industrielles Herstellungsverfahren vorteilhafte

Die Aminosäurefermentation unter Verwendung von Mikroorganismen, die Kohlenwasserstoffe assimilieren, ist bekannt, vgl« Agricultural and Biological Chemistry, Band 27f Hr_β 5, 390-395 (1963)· Bei den erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen handelt es sich jedoch um Kohlenwasserstoffe nicht assimilierende, L-Grlutaminsäure bildende Mikroorganismen·

Zu den Kohlenwasserstoffen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, gehören geradkettige und verzweigte Paraffine (Alkane), Cyeloparaffine, geradkettige und verzweigtkettige Olefine, Cycloolefine, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Xylol usw«, sowie Gemische dieser Kohlenwasserstoffe, und Kohlenwasserstoffgemische wie Kerosin, Leichtöle, Paraffinöle usw_#» Die zu verwendende Menge an Kohlenwasserstoff variiert je nach dam verwendeten speziellen Kohlenwasserstoff, doch wurde gefunden, daß 0,05 - 5 Gew·-^ Kohlenwasserstoff in dem Kulturmedium zu Beginn der Fermentation verwendet wer-

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den können« Auf der anderen Seite wurde gefunden, daß !Teilmengen oder die ganze Menge des Kohlenwasserstoffs bzw« der Kohlenwasserstoffe während der Fermentation entweder auf einmal oder in Zeitabständen zugegeben werden können«

Die Zusammensetzung des Kulturmediums sowie die Züchtungebedingungen entsprechen den üblichen Bedingungen bekannter Fermentations verfahr en«, So können entweder künstlich zusammengestellte Kulturmedien als auch Kulturmedien auf der Grundlage natürlicher organischer Substanzen verwendet werden, solange sie nur die zum Wachstum der verwendeten Mikroorganismen wesentlichen Nährstoffe enthalten« Derartige Nährstoffe sind in der Fermentationstechnik wohlbekannt« Zu ihnen gehören Substanzen wie Quellen für Kohlenstoff, Quellen für Stickstoff, Mineralsalze, Vitamine und dgl«, die von den L-Glutaminsäure bildenden Mikroorganismen verwertet werden« So können als Quelle für Kohlenstoff z«B« erwähnt werden Kohlenhydrate wie Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysatlösungen, Melassen usw«, und organische Säuren wie Essigsäure, Ketosäuren, usw«, und dgl«« Als Quelle für Stickstoff können die verschiedenartigsten anorganischen oder organischen Salze bzw« Verbindungen, wie z«B* Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Harnstoff usw«, oder andere stickstoffhaltige Verbindungen, wie z«B« Pepton, N-Z-Amin (Warenzeichen für eine leihe von Caseinhydrolysaten), Fleischextrakt, Maiequellflüssigkeit, Caseinhydrolysat,

Fisehmehl usw*, verwendet werden«, Weiterhin können als Vitaminquelle Biotin, HeJTeextrakt usw_e verwendet werden» Zu Mineralsalzen, die den Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Kaliumdihyörogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Magnesiumsulfat , Eis en (II)-sulfat, Mangansulfat uaw««

Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung des Verfahrens und sind in keiner Weise als _s begrenzend anzusehen« Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht«

Nach der Beendigung der Fermentation kann die L-Glutaminsäure aus dem Fementationsfiltrat nach bekannten Verfahren, wie z«B« durch Behandlung mit Ionenaustauschharzen, Einengen oder dgl« , isoliert werden«

Beispiel 1

Is wird ein Impfmedium hergestellt, das aus 2 $> Glucose, 1 i» Pepton, 0,5 $ Fleischextrakt und 0,25 ^ Natriumchlorid besteht« Der pH-Wert des Isipfmediums beträgt 6,8 - 7,0·

Es werden zwei Fermentationsmedien hergestellt· Has erste, das Fersaentationsmedium A, besteht aus 10 fi Glucose, 0,1 ?έ iiBBOXtiumsulfat, 0,05 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 i> Mkaliumhydrogenphosphat ₉ 0,03 $ Magnesiumsulfat, 0,001 i» Mangansulfat, 0,001 $> Eisen(ll)-sulfat, 0,5 $> Harnstoff (gesondert sterilisiert) und 20 ii g/Liter

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Biotln« Sas zweite, das Fermentationsmedium B, besteht aus 10 £ Melassen (Mengenangabe bezieht sich auf die reduzierenden Zucker), 0,1 i> Jamoniiassulfat, 0,05 $> Kaliimdihy&rogenphoaphat, 0,05 5* MkallUBhjdrogenphosphat, 0,01 i» Magnesiumsulfat und 0,5 5* Harnstoff (gesondert sterilisiert).

In den obengenannten Impfmedium wird eine Impfkultur -von Micro coccus glutemieus Ir* 560 (ASOG 13761) hergestellt· Me Impfkultur wird in einem Mengenverhältnis ▼on 0,5 ffew.«96 in 250-c<ra~Erleomeyer]colben eingeführt, die je 20 oca des Fermentationsmediuma A bzw* 20 ecm des !•ereentationsmediUMS B enthalten» Me Kolben enthalten weiterhin die in der folgenden fabeile I angegebenen Kohlenwasserstoffe in den angegebenen Mengen* Während der ansohlleSenden Fermentation wird der pH-Wert des FeieentatloiUBiediuBs durch Zugabe einer 20 #igen wäSrigen Haraeteffiesung bei 6-9 gehalten* Me Kultur wird bei einer Temperatur yon, 30⁰C mit 220 Tkidrehungen pro Minute geschüttelt* Me Analysenergebnisse nach Beendigung der Fermentation - nach 50-stündigem Züchten - sind in Tabelle I angegeben«

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Tabelle I

Kohlenwasserstoff	Zugegebene MengeiGeWe-^)	Gebildete Menge säure (mg/ecm)	an L-Glutamin-
	2	Permentations- medium A	Peimentations- medium B
n-Pentan	2	- 8,1	7,3
n-Octan	2	15,2	13,0
n-Beoan	2	16,5	15,7
n-Docecan	2	17,0	16,2
n-Kexadeoan	2	17,9	15,4
Isopentan	2	13,3	10,2
Isooctan	2	15,5	13,8
Penten-(2)	2	10,1	8,8 !
Gemisch aus 0oten-(1) und 0cten-(2)	2	9,3	11,3
Hexen-(i)	2	9,0	8>0 j
0eten~(1)	2	11,0	9,1 j
Octadecin-(1)	2	16,2	18_f0 I
Cyclohexaa	2	13,7	10,5
Cycloootan	2	H,3	12,5 j
Kerosin	3	11,1	9,0 j
Kerosin	-'	23,0	20,6 I
Keine Zugabe	0,6	2,3 ; I

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Beispiel 2

Me gleiche Züchtung wie in Beispiel 1 wird unter -Verwendung iron Micro co ecus glutamicus Steam Sr* 534 (ATCC 13032) durchgeführt. Der Kohlenwasserstoff wird nach 6-stiindiger Züchtung augegeben. Sie nach beendeter Fermentation - nach 48-stündigem Züehten ~ erhaltenen Ergebniese sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle!!

Kohlenwasserstoff	Gebildete Menge an !-Gluta minsäure (mg/cem)
¹ Zugegebene Meng· (Gew.-#)	Fermentations-; Fermentation»· medium A medium B
1 Kerosin 3 Keine Zugabe' - ■	8,7 10,5 1,0 ; 4,0

Beispiel 3

Es werden der gleiche Mikroorganismus, Microoocous glutamious Stamm Vr. 560 (ATGG 13761) und das gleiche Kulturmedium wie in Beispiel 1 verwendet. Je 100 Liter des Fexmentationsmediums A bsw. des Fermentationsmediums B werden in 200-Liter-Feimentatlon8gefäße gegeben, und es wird dann mit je 10 Litern der Impfkulturflüssigkeit angeimpft · Me Fermentation wird dann mit einer Beltif tungsgesohwindigkeit von 50 Litern Luft je Minute, einer Sohüttelgeschwindigkeit τοη 200 Uttdrehungen pro Minute und einer Temperatur τοη 30°C durohgefühBt. Der Kohlenwasserstoff

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wird nach 10-stündigem Züchten sugegeben« Sie Ergebnisse nach 50-etündigea Züchten, A»h_a bei Beendigung der Fermentation, sind in Tabelle III susammengestellt.

Tabelle III Kohlenwasserstoff Sebildete^Meng^ ^-Glutaminsäure

Zugegebene (

Fomentations- 1 Fermentations- ; medium A medium B j

ι Kerosin

» ^Keine Zugabe

42,0

33,5

Beispiel 4

Es wird ein Feraentatioßsaeditua hergestellt, das 3,85 ^ lEKonlumaeetat (3^ als Essigsäure), 0,1 # immoniiassulfat, 0,05 ^ EaliumdibydrogenphoEphat, 0,05 $> Sikaliumhydrogenphosphat, 0,03 $> Magnesiumsulfat, 0,001 $> Mangansulfat, 0,001 £ Eis en (II)-sulfat, 20 ixg/Liter Biotin und 2,5 ^ Kerosin enthält«

Es werden der gleich« Mikroorganismenstamm und das gleiche üiplkedium wie in Beispiel 1 yerwendet· Es wird eine Iispfkulturflüseigkeit hergestellt, die in einer Menge von 5 $> zum Beimpfen des oben beschriebenen Fermentations— mediums Terwendet wird« Die Fermentation wird dann unter den gleichen Züchtungsbedingiangen wie in Beispiel 1 durchgeführt« Ber pH-lfert wird während der Fermentation mit

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HiIfe einer mit Essigsäure angesäuerten Ammoaiumaoetatlusung, in der der Gesamtgehalt an Essigsäure bei 10 % gehalten wird» innerhall) eines Bereichs von 6-8 gehalten· Die Ergebnisse nach der Beendigung der Fermentation (nach 48 Stunden Züchten) sind in Tabelle 17 angegeben«

Tabelle IV

Kerosin j 2,5

20,1

Keine j , _{o q}

Zugabe I °»⁹

Beispiel 5

Es werden der gleiche Mikroorganismenstamm und das gleiche Züohtungsverfahren wie in Beispiel 1 angewendet« Haoh 8-sttindigem Züchten werden zwei verschiedene aromatische Kohlenwasserstoffe zugegeben« Die nach Beendigung der Fermentation - nach 48-stündigem Züchten - erhaltenen ,Ergebnisse werden in Tabelle 7 zusammengestellt·

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Tabelle V

Kohlenwasserstoff	Zugegebene Menge (Gew«-9&)	t Gebildete Menge L-Glutamin- : säure (mg/com)	fermentations- medium B '
	1 0,5	Fermentations medium A	9,6 : 10,5 0,8
Benzol o-Xylol Keine Zugabe	⁷'⁵. 12,3 0,3

Obgleich in den obigen Beispielen spezielle Kohlenwasserstoffe und spezielle Mikroorganismen verwendet worden sind, ist das erfindungsgemäße Verfahren auf sämtliche geeigneten. , !-Glutaminsäure bildenden Mikroorganismen anwendbar« Dementsprechend ist das erfindungsgemääe Verfahren ganz allgemein auf Verfahren zur fermentativen Herstellung von !-Glutaminsäure anwendbar«

Das erfindungsgemäße Verfahren kann, wie für den Fachmann auf der Hand liegt, in der verschiedenartigsten Weise variiert werden« Alle diese Abänderungen liegen innerhalb des Erfindungsbereichs·

- Patentanspruch· -

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Claims

Patentansprüche t

Verfahren zur Herstellung von !-Glutaminsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der zur Bildung von L-Glutaminsäure befähigt ist, in einem wäßrigen ITährmedium, das eine Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen und in Gegenwart mindestens eines Kohlenwasserstoffs züchtet«

2_P Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenwasserstoff Kerosin verwendet wird«

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff ein Paraffin verwendet,

4« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff ein Cycloparaffin verwendet«

5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff ein Olefin verwendet«

6« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff ein Cycloolefin verwendet.

7· Verfahren nach Anspruch T, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff Benzol verwendet«

8« Verfahren nach Anspruch 1j dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenwasserstoff o-Xylol verwendet«

9» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Micrococcus glutamicus verwendet wird«

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