DE2005848A1

DE2005848A1 - Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure und Isozitronensäure

Info

Publication number: DE2005848A1
Application number: DE19702005848
Authority: DE
Inventors: Katsunobu; Kimura Kazuo; Nakanishi Toru; Yamamoto Masaki; Machida Tanaka (Japan). P B21b 45-02
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-02-14
Filing date: 1970-02-09
Publication date: 1970-08-20
Also published as: FR2035420A5; NL7002105A; CA938906A; GB1278013A

Description

3. Feb.1970

Seh/Gl K 940

Kyowa Hakko Kogyo Uo., Ltd», Tokyo / Japan

Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure und

Isozitronensäure

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure und Isozitronensäure. Insbesondere befasst sioh die Erfindung mit einem Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure und Isozitronensäure durch Gärung. In ganz besonderer Weise hat die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure und Isozitronensäure durch Gärung unter
Verwendung von Mikroorganiemenstäinmen von Candida zeylanoides zum Inhalt.

Zitronensäure und Ieoaitronensäure sind bekannte Handeleprodukte. Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung dieeer

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Verbindungen bekannt. Gegenstand der !Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Verfahrene zur Herstellung von Zitronensäure und Isozitronensäure, durch welches die den bisher bekannten Methoden anhaftenden Nachteile beseitigt werden. Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure und Isozitronensaure durch Gärung zur Verfügung gestellt, das in wirksamer und einfacher Weise durchgeführt werden kann. SrfindungsgenBss werden Zitronensäure und Isozltronensäure durch Gärung nach einem Verfahren erzeugt, das sich in industriellem Mafistabe mit geringen Kosten durchführen lässt» wobei eine hohe Produktausbeute erzielt wird.

Sie Erfindung beruht auf der Brkenntnis, dass erhebliche Mengen an Zitronensäure und Isozitronensäure in der Kulturbrühe angereichert werden* wenn Candida zeylanoides unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Hährmedium gezüohtet wird. Der bevorzugte Stem ist dabei Candida zeylanoldes ATCC 15585.

Der Candida zeylanoides-Stanm, der vorzugsweise erfindungsgeaäss eingesetzt wird» ist ein neuer Stamm, der kürzlich aus natürlichem Boden isoliert worden ist. Er besitzt ein stark auegeprägtes Vermögen, Kohlenwasserstoffe zu assimilieren. Bs wurde gefunden, dass merkliche Mengen an Zitronensäure und Isozitronensäure unter geeigneten ZÜohtungsbedingungen gezüchtet werden können, und mmx aus Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstoffquelle.

Die Herstellung von Zitronensäure und Iaoaitronensäure unter Verwendung von Hefen let bereits bekannt (vergleiche Abe et al in "The frooeedings of the General Meeting of the Agricultural Chemical Sooiety of Japan", Seite 91 (1968). Se wurde jedoch nooh niemals die Herstellung von Zitronensäure und Isozitronensäure durch Gärung unter Verwendung von Candida zeylanoides

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- 3 in einem geeigneten Sährmedium 'beschrieben.

Diese erfindungsgemäss eingesetzten Mikroorganismen besitzen die nachstehend angegebenen beiden Eigenschaften, und zwar 1. eine wenig ausgeprägte neigung, Zitronensäure und Isοzitronensäure zu zersetzen,und 2« in ausgeprägtem KaBe das Vermögen, Kohlenwasserstoffe zu assimilieren. Daher sind diese Stämme Hefen, welche in stark ausgeprägtem Ausmaße Zitronensäure und Isozitronensäure zu erzeugen vermögen, und zwar insbesondere dann, wenn Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoff quelle in λ dem Medium verwendet werden. Dabei erhält man hohe Ausbeuten. Die Ausbeuten sind erheblich grosser als dies bei den bekannten Verfahren der Pail ist, und zwar wahrscheinlich infolge der zwei vorstehend erwähnten Eigenschaften.

Die mikrobiologischen Eigenschaften von Candida zeylanoides AXCC 15385 werden in der britischen Patentschrift 1 063 250 beschrieben.

Entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Hährmedium sind zur Durchführung des erfindungsgemässen Gärungsverfahrens geeignet, vorausgesetzt, dass die jeweiligen Medien die für das Wachstum des eingesetzten Mikroorganismenstammes < erforderlichen Nährmittel enthält. Derartige Mährmittel sind bekannt. Ss handelt sich beispielsweise um eine Kohlenstoffquelle, eine S tickt? tofu quelle, anorganische Verbindungen oder dergleichen, wobei diese Nährmittel von den eingesetzten Mikroorganismen in entsprechenden Mengen verbraucht werden.

Die erfindungsgemäsae Gärung wird in einem wässrigen Nährmedium durchgeführt, das einen Kohlenwasserstoff oder eine Mischung aus Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstoff quelle enthält. Wahlweise kann ein Kohlehydrat als Hauptkohlenstoffquelle eingesetzt

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werden. Die Kohlenwasserstoffe können entweder flüssig, gasförmig oder fest sein. Beispiele für derartige Kohlenwasserstoffe sind geradkettige oder verzweigte Paraffine (Alkane) mit 5-20 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise n-Pentan, n-Ootan, n-Decan, n-Dodecan, n-Hexadecan, Isopentan, Isooctan oder dergleichen, geradkettige oder verzweigte Olefine, wie beispielsweise Penten-2, Hexen-1, Ooten-1, Octen-2 oder dergleichen, oder Mischungen davon sowie gemischte Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Kerosin, Leichtöle, Schweröle, ' Paraffinöle, Gasöle, verschiedene Erdölrohmaterialien oder dergleichen. Von den Kohlehydraten seien beispielsweise Zuoker und Zuckeralkohole erwähnt, z.B. Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Melaseen, Stärke, Stärkehydrolysate, Abfallmelassen oder dergleichen. Andere geeignete Kohlenetoffquellen, wie beispielsweise Alkohole oder organische Säuren, beispielsweise Glyzerin, Mannit, Sorbit, Essigsäure oder dergleichen, können in dem Gärungsmedium verwendet werden. Diese Substanzen werden entweder allein oder in Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet.

Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Arten von anorganisehen oder organischen Salzen oder Verbindungen in Frage, bei spielsweise Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat oder dergleichen. Ferner kann man auf natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, zurückgreifen, wie beispielsweise Maisflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Fleischbrühe, Kaseinhydrolysate, lösliche Fischbestandteile, Reiskleieextrakt oder dergleichen. Diese Substanzen können ebenfalls entweder allein oder in Kombinationen aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.

Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt wer-

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den können» sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere üSiseosalze, Manganchlorid, Calciumchlorid, Zinksulfat, Kupfersu'Ifat, Molybdate_f Borate oder dergleichen.

Darüber hinaus kann es nowendig oder zweckraässig sein, bestimmte wesentliche Nährmittel dem Kulturmedium zuzusetzen, und zwar je nach dem eingesetzten Mikroorganismus sowie je nach den angestrebten Ergebnissen. Erwähnt seien beispielsweise Aminosäuren, s.B, Histidin, ¹Ty roe in, Phenylalanin, Threonin, leucin, Cystin oder dergleichen, und/oder Vitamine, beispielsweise Pyridoxal, p-Aminobenzoesäure, Thiamin, Pantothensäure, Biotin, Nikotinsäure oder dergleichen.

Das Gären oder Züchten der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Sohütteln der Kultur unter Rühren und Belüften einer Submerskultur, und zwar bei einer Temperatur von beispielsweise ungefähr 20 - 40⁰G sowie bei einem pH von beispielsweise ungefähr 1,0 - 9,0. Die bevorzugten Bedingungen sind eine Temperatur von ungefähr 30⁰C und ein pH von ungefähr 6,0. Es kann notwendig oder zweckmässig sein, bestimmte pH-regulierende Mittel dem Medium während des Züohtene zuzusetzen, beispielsweise Oalciumcarbonat, Natriumhydroxyd, Calclumhydroxyd, Ammoniak oder dergleichen.

Etwa äquivalente Mengen an Zitronensäure und Isozitronensäure werden gewöhnlich gleichzeitig in der erhaltenen Gärungsflüssigkelt erzeugt. Jedooh kann das Produktionsverhältnis der Gärungsprodukte gegebenenfalls variiert werden, und zwar durch Zugabe von verschiedenen Arten von organischen

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und anorganischen Verbindungen oder Wirkstoffen zu dem Medium oder durch Verwendung versohiedener Mutanten dee bevorzugten Stammes.

Nachdem das Züchten beendet ist, können die Zitronensäure und die Isozitronensäure aus der flüssigkeit abgetrennt werden, und zwar mit üblichen Mitteln, beispielsweise durch Ionenaustausoherbehandlung, duroh Extraktion mit Lösungsmitteln, duroh Ausfällen, durch Adsorption, duroh Chromatographie oder dergleichen.

Sie folgenden Beispiele erläutern die Erfindimg, ohne sie zu beschränken. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter der Medien.

Beispiel 1

Candida zeylanoides AICC 15585 wird auf 20 ml eines Kulturmediums aufgeimpft, das 5 # α-Paraffine (eine Mischung aus ⁿ~^C12~* ~°13"' "⁰U"* "²^ -C-,c-Paraffinen), 0,5 36 Malsflüssigkeit, 0,5 $> Ammoniumnitrat, 0,05 % Kaliumphoephat, 0,025 £ Magnesiumsulfat, 10 mg/1 Eisen(III)-sulfat, 4 mg/1 Mangansulfat, 2 mg/1 Zinksulfat, 50 T/1 Kupfersulfat, 100 7/1-Ammoniummolybdat, 100 7/1 Borsäure und 3,0 j( Calciumoarbonat enthält. Der pH des Kulturmediums, das in einem 250 ml-Kolben mit konischer ?orm enthalten ist, beträgt 6.O.Bas Züchten erfolgt unter aeiv: -^ Schütteln bei 3C*C sowie 220 Upm während einer Zeitspanne von 2 Tagen.

Sas erhaltene Impfmedium wird ansohlieseend auf 20 ml eines uärungsmediums in einen 500 ml-Sakaguohi-Kolben auf geimpft. Sas Medium besitzt folgende Zusammensetzung:

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— 7 ~

10 # η-Paraffine (eine Mischung aus

-G₁--, -O₁^- und -C^-Paraffinen)

0,25 f> Mais flüssigkeit

0,3 1° Ammoniumnitrat

0,05 # Xaliumdihydrogenphosphat

0,025 $> Magnesiumsulfat

10 mg/1 JSisen(III)-sulfat

4 mg/1 Mangansulfat
2 mg/1 Zinksulfat

5 $> Calciumcarbonat.

Der pH dieses Mediums beträgt 6,0.

Das Gären wird unter aerobem Schütteln bei 30⁰O unter Hin- und Herbewegen mit einer Geschwindigkeit von 125 mal pro Minute während einer Zeitspanne von 4 Sagen durchgeführt. Dabei erhält man 30 mg/ml Zitronensäure und 28 mg/ml Isozitronensäure in der Gärungsflüssigkeit.

Der überstehenden lösung der Gärungsflüssigkeit wird Bariumhydroxyd zugesetzt. Das erhaltene Bariumsalz wird gesammelt, worauf Schwefelsäure zur Entfernung des Barium zugesetzt wird. Anschliessend wird die erhaltene überstehende Flüssigkeit getrocknet und mit Methanol umgesetzt, wobei ein Ä'theradditionsprodukt von Bortrifluorid als Katalysator verwendet wird. Dabei wird der Methylester gebildet. Die Ester von Zitronensäure und Isozitroneneäure werden durch. Destillation fraktioniert, worauf jeder Teil verseift und neutralisiert wird. Anschliessend wird Äthanol zugesetzt.

Oabei erhält man 250 mg Isozitronensäure und 260 mg Zitronensäure in kristalliner form.

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Beispiel 2

3 1 eines Kulturmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung (pH 6,0) werden in einem 5 1-Gärungsgefäss hergestellt und sterilisiert:

10 $6 η-Paraffine (eine Mischung aus ₁₂

-C₁J-, -O₁^- und -C₁c-Paraffinen) 0,23 % Maieflüssigkeit 0,3 # Ammoniumnitrat 0,05 $> Kaliumdihydrogenphosphat 0,025 $> Magnesiumsulfat 10 mg/ml Eisen(III)-sulfat

4 mg/1 Mangansulfat

2 mg/1 Zinksulfat

Candida zeylanoides AXCC 15585 wird in 2 !-Kolben unter aerobem Schütteln während einer Zeitspanne von 2 Tagen in 300 ml eines Impfkulturmediums gezüchtet, das die gleiche Zusammenseteung wie in Beispiel 1 besitzt. 2 Kolben mit der erhaltenen KuItürimpfbrühe werden auf das Gärungsmedium aufgeimpft, worauf die Gärung bei 30⁰C unter Bohren (800 Upm) durchgeführt wird. Es wird mit 1 1 pro 1 pro Minute belüftet. Das Züchten erfolgt während einer Zeitspanne von 4 Tagen. Der pH wird durch Zusatz von BH^OH während des Züohtens auf 6,0 eingestellt.

Bach Beendigung des Züchtens werden 35 mg/ml Isosltronensäure bzw. Zitronensäure in der KuItürflüssigkeit erhalten. Nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise erhält man 62 g Isoeltroneneäure und 60 g Zitronensäure in kristalliner Form.

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Beispiel 5

Das Züchten wird in der gleichen Weise sowie unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Glukose anstelle der n-Paraffiniuischung in dem Impf medium verwendet wird. Das gleiche Gärmsdium wie in Beispiel 1 wird dabei eingesetzt,

Nach 4-tägigem Züchten unter Schütteln der Kultur unter aeroben Bedingungen findet man 25 mg/ml Zitronensäure und 26 mg/ml Isozitronensäure in der erhaltenen Gärungsflüssiglceit. Unter Einhaltung der in Beispiel 1 beschriebener] Arbeitsweise werden 200 mg Zitronensäure-Kristalle und 205 mg Isozitronensäure-Kristalle erhalten.

Beispiel 4

Das Züchten wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Phenolrot (0,001 #) dem Gärungsmedium zugesetzt wird. Ausa er dem wird 1 ?Siges Ammonium ce tat anstelle der n-Paraffine in dem Gärungsmedium verwendet. Der pH wird während des Zttchtens auf 7,0 eingestellt, und zwar durch Zugabe von 50 tigern Ammoniumacetat.

Nach 4-tägigem Züchten werden 12 mg/ml Zitronensäure und 10 mg/ml Isozitronensäure in der erhaltenen Gärungsflüssigkeit festgestellt. Die Gesamtmenge an der Gärungeflüssigkeit zugeführter Essigsäure, einschliesslich der während des Züchtens zugeführten Menge, beträgt 5 $> (als Essigsäure).

Anschliessend an die in Beispiel 1 beschriebene Abtrennungsmethode erhält man 100 mg Zitronensäure und 110 mg Isozitronensäure in Polin von Kristallen.

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Beispiel 5

Das Züchten wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Koneentration der n-Paraffiximischung in dem Gärungsmedium 15 ^ he trägt. Nach 24-stündigem Gären werden 2 # Methanol dem Gärungsmedium zugesetst, worauf das ZUohten in der gleichen Weise fortgeführt wird.

Bach 4-tägigem Züchten erhält man 85 mg/ml Zitronensäure und 10 mg/ml Isozitronensäure in der Gärungsflttseigkeit. Unter Einhaltung der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise werden Zitronensäure-Kristalle (100 g) und Isossitronensäurö-Kristalle (12 g) erhalten.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure und Isozitronensäure, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus, der Zitronensäure und Isozitronensäure zu erzeugen vermag und zu Candida zeylanöides gehört, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Mhrmedium gezüchtet wird, Zitronensäure, Isozitronensäure oder eine Mischung davon in der erhaltenen Kulturbrühe angereichert wird und die Zitronensäure und die Isozitronensäure abgetrennt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus Candida zeylanöides ATGG 15585 besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus ein Mutantenstamm von Candida zeylanoides ATCG 15535 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das züchten bei einer (Temperatur von ungefähr 20 - 40°C und bei einem pH von ungefähr 1-9 durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Nährmittel wenigstens einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoff quelle enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Kohlenwasserstoff ein η-Paraffin ist, das 5 - 20 Kohlenstoff atome enthält.

7. Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure und Isozitroneneäure, dadurch gekennzeichnet, dass Candida zeylanoides

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AICC 15585 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von ungefähr 20 - 40*0 und bei einem pH von ungefähr 1 - 9 in einem wässrigen Bähmedium gesttohtet wird, Zitronensäure, Xsositronenefture oder eine Mischung davon in der erhaltenen Knlturflüsslgkeit angereichert wird und Zitronensäure und IsoBitronensäure abgetrennt werden.

Θ. Verfahren nach Anspruoh 7# dadurch gekennBeiohnet, dass ein Natantenatanm von Candida seylanoides als Mikroorganismus verwendet wird.

9· Verfahren naoh Anspruoh 7t dadurch gekennzeichnet» dass der pH des Mediums bei ungefähr 3,0 - 7,0 während des ZOohtens gehalten wird.

10. Verfahren naoh Anspruch 7, dadurch gekennBeiohnet, dass das verwendete Hährmedium wenigstens einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthält.

11. Verfahren naoh Anspruch 9» dadurch gekennseiofanet, dass der verwendete Kohlenwasserstoff eine Mieohung aus C₁₂ ~ ^οΐ5~^η" Paraffinen ist.

12. Verfahren naoh Anspruoh 7» dadurch, gekennBeiohnet, dass das verwendete Hährmedium einen Zucker als Hauptkohlenstoffquelle enthält.

13· Verfahren naoh Anspruoh 7, daduroh gekemmelohnet, dass das verwendete Bähmedium Essigsäure als Hauptkohlenstoffquelle enthält.

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