DE2245545C3 - Verfahren zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in Proteinmaterialien unter Verwendung eines neuen Hefestammes - Google Patents

Description

bis 993, überein mit dem Unterschied, daß bei Züch- HjSO₄ , 0,172 g

tung auf Glukose/Hefeextrakt/Peptonagar oder bei Thiaminhydrochlorid 220 mg

Dalmau-Platfenkulturen auf Maismehlagar (Lodder, Leitungswasser zur Auffüllung auf 11

Z Auflage 1970, S. 992) die Kolonien cremefarben

und glatt sind und eine matte Oberfläche ohne Faltung 5 Nach einer Anfahrzeit von etwa 16 Stunden, wäh-

haben und kein Pseudomycelium gebildet wird. rend der die Kultur eine Konzentration von 16 g/l

Dies steht im Gegensatz zu der Bildung von Pseudo- erreichte, wurde mit dem kontinuierlichen Betrieb bei

mycelium bei typischen Stämmen von Candida lipo- riner Verdünnungsrate von 0,16 V/V/StdL, einer Tem-

lytica, z. B. beim Stamm C.B.S. 2078 und beim peratur von 32°C und einem pH-Wert von 5,5 begon-Stamm C.M.I. 93 743. io nen. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von Ammoniak

Die physiologischen Eigenschaften sind mit denen das gleichzeitig als Stickstoffquelle dient, nach Bedarf

von C. lipolytica. Stamm C.B.S. Nr. 2078 und Stamm aufrechterhalten. Der Kohlenstoffwasser wurde in

C.M.I. 93743, die bereits erwähnt wurden, identisch. einer Menge von 10 1/Std. und das wäßrige Nährme-

^eBeob^^^^ f^S^^Ä2

Glukose/Hefeextrakt/Pepton/Wasser _{def Dmck im Fennenter wurde}'_{bei X}SÖ kg/cm* ab-

Bei Züchtung für 3 Tage bei 25 ⁰C in Glukose/Hefe- solut gehalten.

extrakt/Pepton/Wasser sind die Zellen kurz oval bis Der Ausbeutefaktor betrug 0,88 (Ausbeutefaktor =

länglich oval, und ihre Größe beträgt 3- bis 6mal 5 bis Gewicht des Hefeprodukts/Gewicht des von der er-11 μ. Selten werden einige langgestreckte Zellen beob- ao zeugten Hefe verbrauchten Kohlenwasserstoffs). Das

achtet, die eine Länge bis etwa 20 μ haben. Eine Pelli- Kulturmedium enthielt pro Liter 23,6 g Zellen (Trok-

cula wirf nicht gebildet. kengewicht).

,ν _n-,. . j „ ... _t Der Versuch wurde 1000 Stunden fortgesetzt. Wäh-

b) Bildung von Ascosporen oder Balhstosporen _rend ^_x ^ _{wur(Jen 2ur Untersuchu}*_{g der Ku}ltur

Ascosporen oder Ballistosporen werfen nicht ge- 25 auf Veränderungen des Stammes Proben des Kulturbildet, wenn der Stamm auf den Standard-Sporula- mediums in Abständen von 24 Stunden entnommen, tionsmedien gezüchtet wird. Die Proben wurden auf Sabourand-Dexlfoseagar und

λ A«-„ii· „ „ _Λ χι·» * A-j ♦ Malzextraktdgar aufgebracht. Die Platten wurden

c) Assimiherung von Nitrat und Zersetzung von 3 _Tage ^ *_Qo_{c beb} ^B _{rütet Die gebild(5ten Kolonien}

30 waren cremefarben und glatt und hatten eine matte

Der Stamm assimiliert Kaliumnitrat nicht. Harnstoff Oberfläche und keine Faltung.

wird zersetzt. Während der gesamten Dauer der Fermentation

wurden keine Anzeichen einer Änderung der Kultur

d) Verwertung von Zuckern _{bei der} pi_attierung festgestellt. Bei der Untersuchung

Der Stamm fermentiert Zucker nicht, aber die fol- 35 unter dem Mikroskop wurde kein Pseudomycelium genden Verbindungen werfen assimiliert: Glukose, beobachtet.

Äthanol, Glycerin, Erythrit und Bernsteinsäure. Der Rohproteingehalt wurde in regelmäßigen Ab-

Die folgenden Verbindungen werden nicht assimi- ständen nach der Methode ermittelt, die in »Fertiliser liert: Galactose, Sorbose, d-Ribose, L-Rhamnose, and Feeding Stuffs Regulation«, Statutory Instrument Saccharose, Maltose, Cellobiose, Trehalose, Laktose, 40 Nr. 218, 1968, beschrieben ist.
Mellibiose, Raffinose, Melezitose, Inulin, lösliche Die Hefe hatte einen Rohproteingehalt im Bereich

Stärke, d-Xylose, L-Arabinose, d-Arabinose, Ribit, von 63 bis 66 Gewichtsprozent, bezogen auf das Galactit, d-Mannit, d-Glucit, a-Methyl-d-glukosid, Trockengewicht der Hefe.
Salicin und Inosit. Gelatine wird verflüssigt und Lak- Vereleichs-Versuch

musmilch peptonisiert. 45

Das Wachstum auf vitaminfreien Medien ist Zum Vergleich wurde ein bekannter, Kohlenwasser-

schwach. Es wirf durch die Anwesenheit von Thiamin stoffe verwertender Stamm von Candida lipolytica, angeregt. nämlich der Stamm CMI. Nr. 93743, unter den

gleichen Bedingungen gezüchtet, die vorstehend für

Beispiel 1 5° ^den neuen Stamm C.B.S. Nr. 6331 beschrieben wurden.

. „„„„,., ,„„, _Λ Nach Ablauf der 16stündigen Anfahrperiode betrug

Candida lipolytica, Stamm C.B.S. Nr. 6331, wurde _die Zellkonzentration etwa 1,5 g/l. Auf Grund der kontinuierlich unter aseptischen Bedingungen in einem geringen Wachstumsgeschwindigkeit wurde die Anf ahrmit Rührer versehenen, belüfteten Druckgefäß mit _{zeit ver}i_ängert, bis eine Zellkonzentration von 16 g/l einem Arbeitsvolumen von 1800 1 gezüchtet. Als _{J5 erreicht war (nach e}twa 40 Stunden). Der kontinuier-Kohlenstoffquelle diente em Gemisch von im Kerosin- _Hche Betrieb wurde bei einer Verdünnungsrate von bereich siedenden n-Paraffinen mit 10 bis 13 C-Atomen _{0 15} y/V/Std. aufgenommen, wobei die Kultur wegim Molekül, die durch Behandlung einer Erdölfraktion gewaschen wurde. Es war nicht möglich, stetigen mit einem Molekularsieb erhalten worden waren. Das Betrieb zu erreichen, da die Wachstumsgeschwindigwäßrige Nährmedium hatte folgende Zusammen- _{6o keit zu n}j_ed_ri_{g wa}r.
Setzung: Stationärer Betrieb wurde bei einer niedrigeren Ver-

H₃PO₄ 1,594 g dünnungsrate von 0,07 V/V/Std. bei Anwendung eines

KCl 0,916 g Überdrucks von 1,5 kg/cm* absolut erreicht. Der Roh-

MgSO₄ · 7 H₁O 0,521 g proteingehalt des Hefeprodukts betrug etwa 54 Ge-

MnSO₄ · 4 HgO 0,035 g 65 wichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht der

FeSO₄ · 7 H,O 0,052 g Hefe. Die plattierten Kolonien waren cremefarben,

ZnSO₄ · 7 HjO 0,153 g faltig, rauhhaarig, matt und grob gefaltet. Die mikro-

CuSO₄ · 7 HjO 4,36 · 10"* g skopische Untersuchung ergab reichliche Bildung von

₅ (6

^{ebenfalls ge}- SÄ

^abE°tl^Ua Anden ^_Hder -pichen Impfung

Candida üpolytica, Stamm CBLS. 6331 wurde unter 5 ^^^^Γα^ο^^τ, Escherichia, den gleichen Bedingungen und bei der gleichen Ver- ^Sohartrum und Pseudomonas entWelt, dem dünnungsrate von 0,07 V/V/St<L yr,d bei dem gleichen £^a^^b?£™^ "p^ter zugesetzt. Bakterienüberdruck von 1,5 kg/cm* absolut wie beim Stamm ^ ^u™^edlu£ ™AbSn1en während der folgenden CMJ. 93743 von Candida lipolytica gezüchtet, dessen ^""^'^^ρ^ο^Γ des Kulturmediums vorge-Kultivierung vorstehend zum Vergleich anschließend >. 180 «undenan Probe.^ ^ ^ ,^ an Beispiel 1 (Versuch) beschrieben wurde. Der Aus- nommen,wurden *^el|^_{ri ilen} mischen 300000 beutefaktor betrug 0,73 und der Rohproteingehalt ^ ^"JJ^SJ^um variierte, etwa 59 Gewichtsprozent bezogen auf das Trocken- ^^f^_K5SSS«ta«r von 3301 bis 402 gewicht der Hefe. *^ach ^ _{die zdldichte der} Hefe (Candidabpo-Beispiel 3 ⁵ TyS Stamm CRS. 6331) 23,5 g/l und der Ausbeue-

Candida lipolytica, Stamm C.B.S. 6331 wurde in ^^^^S^^^tT^

ein wäßriges Nähmedium und einen als Quelle von gehalt von 59 ^^,

verwertbarem Konlenstoff dienenden Kohlenwasser- ^Ί*£«%^%^^^ des Versuchs

stoff geimpft, die in einem mit Rührer versehenen, » Zwischen Jr«⁰· und 6«υ^ _νοπ ^

belüfteten Druckgefäß mit einem Arbeitsvolumen von wurde der ^Ww^des KuKurm _Kultunnedium

55 1 enthalten waren. Der Kohlenwasserstoff bestand ⁴'⁸.^erhoht.^B _r ^ak ₈ ^t^^ien _u^_d ^U^g> Betriebsstunde vorge-

aus einem Gemisch von im Gasölbereich siedenden zwischen der 800und im « ,(^Zellen/ml.

η-Paraffinen mit 11 bis 18, hauptsächlich 14 bis 17 "⁰™;7"f^f _d" 'Reichen Zeit vorhandenen

C-Atomen im Molekül. Dieses Gemisch war durch *₅ Die jZa hTder wah«ndto ^ _{der lekhen}

eine Molekularsiebbehandlung eines Gasöls aus Erdöl fellen von Cand ^ ''po'yu ^B _{Bakterienzellen}.

erhalten worden. Das wäßrige Nährmedium hatte die Größenordnung wie d,e Zahlen «^.^^ _betrug

folgende Zusammensetzung: _da7Gewi_Cnt der Trockenzellen der Hefe 21,3 g/l und

H₃PO₄ 1.455 g _{der Ausbeute}faktor 0,96. Der Rohproteingehalt der

K₂SO₄ 0,969 g _{Hefe betrug etwa 59} Gewichtsprozent, bezogen auf das

MgSO₄ · 7 H₂O 0,470 g Trockengewicht der ganzen Zellen.

ZnSO₄- 7 H_SO 0,138 g ^ir°_ach |_iner Betriebsdauer von 1218 Stunden wurde

FeSO₄ · 7 H₂O 0,047 g _{der H}._{Wert weiter auf 5},0 erhöht, worauf der Betneb

MnSO₄ · 4 H₂O 0,041 g _des ^_ermenters unstetig wurde und schwierig zu regu-

(NH₄)₂SO₄ 0,500 g ³⁵ _{lieren war} Gleichzeitig schwankte der Ausbeutefaktor

CuSO₄ · 5 H₂O 0,413 mg _{ffir die Hefe Zur gleiche}n Zeit stieg d!e Bakterienzahl,

Thiaminhydrochlorid 203 mg _{bis sie die Zahl der} Hefezellen überstieg.

Leitungswasser zur Auffüllung auf 1 1 Dieses Beispiel veranschaulicht die zufnedenstel-

Nach einer Periode des Chargenwachstums wurde ₊o lende kontinuierliche Durchführung «£^Γϊ£

kontinuierlicher Betrieb bei einer Verdünnungsrate tion zur Herste"^u»8 vonJHrfe atejwo

von 0,14 bis 0,15 V/V/Std. bei einer Temperatur von Verwendung des^ neuen S_t ^ ^ */

32⁰C und einem pH-Wert von 4,5, der durch ZusaU C.B.S. 6331 in uegenwan von _£ · _t

von Ammoniak, das als we," ,re Stickstoffquelle dient, Y^orhand;ⁿ _ß ^e"/™hers\dhfng von HSs BiomlS

nach Bedarf aufrechterhalten wurde, aufgenommen. 45 ^fCTn7^^df J'* ?"^™^^UJ^toüon unter nicht

Der Kohlenwasserstoff wurde in einer Menge von unbefriedigend ι st wenn d^ ™™ ₅

220,5 ml/Std. und das wäßrige Nährmedium in einer aseptischen Bedingung««Joe» pH werte

Menge von 7,42 1/Std. zugeführt. Das Kulturmedium oder hoher durchgeführt wird.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Umwandlung von KohlenwasserstoffenmProteinmaterialien.wobeimaneuie

Candida-Hefe, diegeradkatige Kohlenwasserstoffe Wertet, in Gegenwart ,ines g-adkettigen Kohlenwassersioffs mit wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül, ein«, wäßrigen Nahrmedmms und eines freien Sauerstoff enthaltenden Ga^ » züchtet, dadurchgefcennz eich η e t, daß man Candida Upolytica C.B.S. Nr. 6331 verwendet

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung unter nicht aseptischen Arbeitsbedingungen bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 4,8 durchgeführt wird.

Zellen, ist durch Züchtung des neuen Stammes

Liter und pro Liter neuen S hohen faktorist

Die Erfindung befrifft ein Verfahren zur Umwand-

lung von Kohlenwasserstoffen in Proteinmatenahen,

wobei man eine Candida-Hefe, die geradkettige Koh-

lenwasserstoffe verwertet, in Gegenwart eines; gerad- as

kettigen Kohlenwasserstoffs mit wenigstens iO Kohlen-

Stoffatomen im Molekül, eines wäßngen Nahrmediums

undeinesfreienSauerstoffsenthaltendenGaseszuchtet.

In den letzten Jahren wurde ein Anzahl von Ver-

fahren zur Herstellung von einzelligem Protein durch

Kultivieren von Candida-Hefen auf Kohlenwasser-

Stoffsubstraten in Gegenwart eines wäßngen Nähr-

mediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden

Gases vorgeschlagen. Die vorgeschlagenen Verfahren

können chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt

werden. Zahlreiche Hefestämme, die Kohlenwasser-

stoffe assimilieren, sind als geeignet für die Verwen-

dung bei solchen Verfahren genannt worden

Die Anmelderin macht einen neuen Cand-da-Hefestamm verfügbar, der für die Verwendung bei kon- tinuierlichen großtechnischen Verfahren der vorstehend genannten Art besonders gut geeignet ist Der neue Stamm bleibt über lange Zeiten kontinuierlicher Züchtung stabil, und die erzeugte Hefe hat einen hohen Gehalt an Rohprotein. .

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahret zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen m Proteinmaterialien, wobei man eine Candida-Hefe, die geradkettige Kohlenwasserstoffe verwertet in Gegenwart eines geradkettigen Kohlenwasserstoffs mit we- nigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül, eines wäßrigen Nahrmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases züchtet, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Candida hpolytica C.B.S. Nr. 6331 verwendet.

Bevorzugt als Kohlenwüisserstoffe werden n-Paraffine, die aus Erdölfraktionen im Leuchtpetroleumode; Gasölsiedebereich gewonnen werden. Bei diesen Kohlenwasserstoffen handelt es sich um n-Paraffme, die im Gasölbereich sieden und 11 bis 23, hauptsach-Hch 14 bis 21 C-Atome im Molekül enthalten und um η-Paraffine, die im Kerosinbereich sieden und 10 bi 13 C-Atome im Molekül! enthalten. Besonders gut geeignet sind geradkettige Kohlenwasserstoffe d^e aus Erdölfraktionen durch Behandlung mit Molekularsieben erhalten werden.

e ^ _{v<;rwendung des}

stamm hat einen _{L Der Ausbeute}. _Gewichts ^ _{erzeugten Hefe verbrauchten}

Stamm hat eine hohe Wachinsbesondere auf den bevorso daß mit verhältnis-

gearbeitet werden ^ _Wachstumgsge.

^S^Sungszeiten) weniger als 4 Stun-STiefeSbt einen Wert für D_max von mehr als 0 15 Std -¹ Er kann mit großtechnisch annehmbaren WachsämsgSchwindigkeiten und Ausbeuten unter nicht aseptischen Bedingungen in Gegenwart verunreinigender Bakterien kultiviert werden. B« Kultivie-

zugten mäßig Arbeitsbedingungen zeigt aJ«^ des Ausbeuteund nützlichen Einfluß des Verfahrens, da der ist, mit

Tempe aturen Werte ™ *

belüftete¹,_n druck kann

hohe

Bereiche von weis«

_w. werden.

'nach beliebigen bekannten werden. Bevorzugt werden ^i von 27 bis 33 ⁰C und pH-4,0 bis 5,5. Besonders geeignet einem mit Rührer versehenen, ι Bei Anwendung von ÜberBereich bis 5 kg/cm² absolut :s Merkmal des neuen Stammes, sgeschwindigkeiten über weite und pH-Werten, beispiels-3 bis 5,7 und in einem 3 5 ⁰C aufrechterhalten bei nicht aseptischem pH-Wertes und

von verunreini-

eine Verminderung

bewirken, die die Ernicht wesentlich beein-Stilen. Beispielsweise kann eine Verunreinigung durch Bakterien durch Arbeiten bei e.nem pH-Wert im Bereich von 4 bis 4,8 unterdruckt werden, wobei die Temperatur zweckmäßig im Bereich vo 'Der neu?Stamm ist ein Mutant der aus Hefewildstamm erzeugt worden ist, der von der Anmelderin isoliert und nach den taxonomischen Kriterien von Lodder als Candida Hpolytica identifiziert worden ist. Der neue Summ wurde beim Centraal-LTeau Voor Schimmelcultures, Baarn, Hol and, wo er die C.B.S.-Nummer 6331 erhielt hmterlegt

StoMieesmd die

Eigenschaften des neuen wie bei Candida Hpolytica und C.M.I. 93743. Diese Eigen-„..*.. mit der Standardbeschreibung von var Hpolytica durch J. Lodder in »rhe