DE2245545A1

DE2245545A1 - Verfahren zur umwandlung von kohlenwasserstoffen in eiweisstoffe unter verwendung eines neuen hefestammes

Info

Publication number: DE2245545A1
Application number: DE2245545A
Authority: DE
Inventors: Gordon Homer Evans; Jean Lindsay Shennan
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1971-09-17
Filing date: 1972-09-16
Publication date: 1973-03-29
Also published as: NL7212529A; GB1401277A; SU493978A3; FR2153029A1; RO62308A; CS166819B2; JPS4836391A; AT315110B; BG25657A3; IT965374B; FR2153029B1; DE2245545B2; ZA726114B; ES407000A1; DE2245545C3; JPS5533307B2; US3846238A; BE788902A

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖNWALD^** O 0 HO DR.-ING. TH. MEYER DR. FU ES DI PL-CHEM. ALEK VON KRE15LER DJPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLDPSCH DIPL.-ING. SELTING

KÖLN l.DEICHMANNHAUS

Köln, den 11.9.1972 Kl/Ax

The British Petroleum Company Limited. Britannic House, Moor Lane, London, EC2Y OBU (England).

Υ5Γί5^Γ§2_ΗΓ Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in Eiweißstoffe unter Verwendung eines neuen Hefestammes

Die Erfindung betrifft Verbesserungen eines kontinuierlichen Verfahrens zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in Eiweißstoffe, insbesondere ein kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von einzelligem Protein durch Kultivieren eines neuen Hefestammes auf einem Kohlenwasserstoff als Kohlenstoffquelle.

In den letzten.Jahren wurde eine Anzahl von Verfahren zur Herstellung von einzelligem Protein durch Kultivieren von Hefen auf KohlenwasserstoffSubstraten in Gegenwart eines wässrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases vorgeschlagen. Die vorgeschlagenen Verfahren können chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Zahlreiche Hefestämme, die Kohlenwasserstoffe assimilieren, sind als geeignet für die Verwendung bei solchen Verfahren genannt worden.

Die Anmelderin macht einen neuen Hefestamm verfügbar, der für die Verwendung bei kontinuierlichen großtechnischen Verfahren der vorstehend genannten Art besonders gut geeignet ist. Der neue Stamm bleibt über lange Zeiten kontinuierlicher Züchtung stabil, und die erzeugte Hefe hat einen hohen Gehalt an Rohprotein.

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Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in Eiweißstoffe nach einem Verfahren, bei dem man eine Hefe, die geradkettige Kohlenwasserstoffe verbraucht, in Gegenwart eines geradkettigen Kohlenwasserstoff s mit wenigstens 10 C-Atomen im Molekül, eines wässrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases züchtet, und das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Hefe Candida lipolytica, Stamm CB*S, Nr. 63J1, verwendet.

Bevorzugt als Kohlenwasserstoffe werden η-Paraffine, die aus Erdölfraktionen im Leuchtpetroleum- oder Gasölelede* bereich gewonnen werden. Bei diesen Kohlenwasserstoffen handelt es sich um η-Paraffine, die im Gasölbereich sieden und 11 bis 23, hauptsächlich 14 bis 21 C-Atome im Molekül enthalten, und um η-Paraffine, die im Kerosinbereich sieden und 10 bis I3 C-Atome im Molekül enthalten. Besonders gut geeignet sind geradkettige Kohlenwasserstoffe, die aus Erdölfraktionen durch Behandlung mit Molekularsieben erhalten werden.

Ein Rohproteingehalt im Bereich von 63 bis 65 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht der ganzen Zellen, ist" durch Züchtung des neuen Stammes auf den bevorzugten n-Paraffinen im Kerosinsiedebereich erzielbar.

Produktionsgeschwindigkeiten von etwa 5 6 pro Liter und Stunde bei einem Minimum von etwa 2,5 g pro Liter und Stunde sind durch Verwendung des neuen Stammes erreichbar. Der Stamm hat einen hohen Ausbeutefaktor von etwa 1. Der Ausbeutefaktor ist das Verhältnis des Gewichts der erzeugten Hefe zum Gewicht des von der Hefe verbrauchten Kohlenwasserstoffs. Der Stamm hat eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit, insbesondere auf den bevorzugten Kohlenwasserstoffen, so daß mit verhältnismäßig hohen Verdünnungsraten gearbeitet werden kann. Beispielsweise betragen die Wachstumsgeschwindigkeiten (Teilungszeiten) weniger als 4 Stunden. Dies ergibt einen Wert für D_max#von mehr als

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0,15 Std. . Er kann mit großtechnisch annehmbaren Wachstumsgeschwindigkeiten und Ausbeuten unter nicht-aseptischen Bedingungen in Gegenwart verunreinigender Bakterien kultiviert werden. Bei Kultivierung in einem Druckgefäß unter erhöhtem Druck beispielsweise im Bereich von 1,5

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bis 5»0 kg/cm vorzugsweise unter aseptischen Arbeitsbedingungen zeigt der Stamm einen deutlichen Anstieg des Ausbeutefaktors. Dies hat einen großen und nützlichen Einfluß auf die Gesamtwirtschaftlichkeit des Verfahrens, da der Ausbeutefaktor ein Maß des Wirkungsgrades ist, mit dem die assimilierbaren Kohlenwasserstoffe in Zellen des Mikroorganismus umgewandelt werden.

Die Kultivierung kann nach beliebigen bekannten Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugt werden Temperaturen im Bereich von 27 bis 33°C und Pg-Werte im Bereich von 4,0 bis 5»5· Besonders geeignet ist die Kultivierung in einem mit !Rührer versehenen, belüfteten Druckgefäß. Bei Anwendung von Überdruck kann dieser im Bereich bis 5 kg/cm absolut liegen. Es ist ein weiteres Merkmal des neuen Stammes, daß hohe Wachstumsgeschwindigkeiten über weite Bereiche von Temperaturen und ρττ-Werten, beispielsweise in einem ρττ-Bereich von 3 bis 5»7 "und in einem Temperaturpereich von 20 bis 35 C aufrechterhalten werden können. Dies erleichtert bei nicht-aseptischem Betrieb die Wahl der Bedingungen des ρττ-Wertes und der Temperatur, die das Verschwinden von verunreinigenden Mikrobien oder zumindest eine Verminderung der Verunreinigung auf Werte bewirken, die die Erzeugung der Hefe als Biomasse nicht wesentlich beeinträchtigen. Beispielsweise kann eine Verunreinigung durch Bakterien durch Arbeiten bei einem P_H-Wert im Bereich von 4 bis 4,8 unterdrückt werden, wobei die Temperatur zweckmäßig im Bereich von etwa 27 bis 33°C liegt.

Der neue Stamm ist ein Mutant, der aus einem Hefewildstamm erzeugt worden ist, der von der Anmelderin isoliert

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und nach den taxonomischen Kriterien von Lodder als Candida lipolytica identifiziert worden ist. Der neue Stemm wurde beim Centraalbureau Voor Schimmelcultures, Baarn, Holland, wo er die C.B.S.-Nummer 6331 erhielt, hinterlegt.

Außer den bereits genannten Merkmalen hat der neue Stamm die folgenden Charakteristiken;

Die 'morphologischen Eigenschaften des neuen Stammes sind die gleichen wie bei Candida lipolytica C.B.S. Nr.2078 und CM. 1.93743· Diese Eigenschaften stimmen mit der Standardbeschreibung von C. lipolytica var lipolytica durch J. Lodder in "The Yeasts. A taxonomic study", 2. Auflage 1970, Seite 991 - 993, überein mit dem Unterschied, daß bei Züchtung auf Glukose/Hefeextrakt/Peptonagar oder bei Dalmau-Plattenkulturen auf Maismehlagar (Lodder, 2. Auflage 1970, Seite 992) die Kolonien cremefarben und glatt sind und eine matte Oberfläche ohne Faltung haben und kein Pseudomycelium gebildet wird.

Dies steht im Gegensatz zu der Bildung von Pseudomycelium bei typischen Stämmen von Candida lipolytica, z.B. beim 'Stamm C.B.S. 2078 und beim Stamm C.M.I. 93743.

Die physiologischen Eigenschaften sind mit denen von C.lipolytica, Stamm C.B.S. Nr. 2o78 und Stamm C.M.I. 93743» die bereits erwähnt wurden, identisch.

a) Morphologische Beobachtungen bei Kultivierung in Glukose/Hefeextrakt/Pepton/Wasser

Bei Züchtung für 3 Tage bei 25°C in Glukose/Hefeextrakt/Pepton/Wasser sind die Zellen kurz oval bis länglich oval, und ihre Größe beträgt 3 bis 6 mal 5 bis 11 μ. Selten werden einige langgestreckte Zellen beobachtet, die eine Länge bis etwa 2Ou haben. Eine Pellicula wird nicht gebildet.

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b) Bildung von Ascosporen oder Ballietosporen

Ascosporen oder Ballistosporen werden nicht gebildet, wenn der Stamm auf den Standard-Sporulationsmedien gezüchtet wird.

c) Assimilierunp; von Nitrat und Zersetzung von Harnstoff

Der Stamm assimiliert Kaliumnitrat nicht. Harnstoff wird zersetzt. .

d) Verwertung von Zuckern

Der Stamm fermentiert Zucker nichts aber die folgenden' Verbindungen werden assimiliert: Glukose, Äthanol, Glycerin, Erythrit und Bernsteinsäure.

Die folgenden Verbindungen werden nicht assimiliert: Galactose, Sorbose, d-ßibose, L-Ehamnose, Saccharose, Maltose, Cellobiose, Trehalose, Laktose, Mellibiose, Eaffinose, Melezitose, Inulin, lösliche Stärke, d-Xylose, L-Arabinose, d-Arabinose, Ribit, Galactit, d-Mannit, d-Glucit, ot-Methyl-d-glukosid, Salicin und Inosit. Gelatine wird verflüssigt und Lakmusmilch peptonisiert.

Das Wachstum auf vitaminfreien Medien ist schwach. Es wird durch die Anwesenheit von Th'iamin angeregt.

Beispiel 1

Candida lipolytica, Stamm G.B.S. Nr. 6331, wurde kontinuierlich unter aseptischen Bedingungen in einem mit Rührer versehenen, belüfteten Druckgefäß mit einem Arbeitsvolumen von 1800 1 gezüchtet. Als Kohlenstoffquelle diente ein Gemisch von im Kerosinbereich siedenden η-Paraffinen mit-10 bis 13 C-Atomen im Molekül, die durch Behandlung einer Erdölfraktion mit einem Molekularsieb erhalten worden waren. Das wässrige Nährmedium hatte folgende Zusammensetzung:

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KCl
MgS0₄-7H₂0

H₂SO₄

Thiaminhydrochlorid Leitungswasser

	g
0,916	S
0,521	B
0,035	ε
0,052	g
0,153	χ 10~⁴ g
4,36	ε
0,172	mg
220

zur Auffüllung auf 1 1

Nach einer Anfahrzeit von etwa 16 Stunden, während der die Kultur eine Konzentration von 16 g/l erreichte, wurde mit dem kontinuierlichen Betrieb bei einer Verdiinnungsrate von 0,16 V/V/Std., einer Temperatur von 32⁰C und einem p_H-Wert von 5»5 begonnen. Der p-q-Wert wurde durch Zusatz van Ammoniak nach Bedarf aufrechterhalten. Der Kohlenwasserstoff wurde in einer Menge von 10 1/Std. und das wässrige Nährmedium in einer Menge von. 260 1/Std. zugeführt. Das Kulturmedium wurde mit 1,50 V/V/Min. belüftet, und der Druck im Fermenter wurde bei 2,50 kg/

ρ
cm absolut gehalten.

Der Ausbeutefaktor betrug 0,88 (Ausbeutefaktor = Gewicht des Hefeprodukte/Gewicht des von der erzeugten Hefe verbrauchten Kohlenv/asserstoffs). Das Kulturmedium enthielt pro Liter 23,6 g Zellen (Trockengewicht).

Der Versuch wurde 1000 Stunden fortgesetzt. Während dieser Zeit wurden zur Untersuchung der Kultur auf Veränderungen des Stammes Proben des Kulturmediums in Abständen von 24 Stunden entnommen. Die Proben wurden auf Sabouraud-Dextroseagar (Oxoid) und Malzextraktagar (Oxoid) aufgebracht. ("Oxoid" ist eine Handelsbezeichnung.) Die Platten wurden 3 Tage bei 30⁰C bebrütet. Die gebildeten Kolonien waren cremefarben und glatt und netter» eine matte Oberfläche und keine Faltung.

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Während der· gesanten Dauer der Fermentation wurden keine Anzeichen einer· Änderung der Kultur bei der Plattierung festgestellt. Bei der Untersuchung unter dem Mikroskop wurde kein Fseudomycelium beobachtet;.

Der EohproöCiingeLalt wurde in regelmäßigen Abständen nach der Methode ermittelt, die .in "Fertiliser and Feeding Stuffs Regulation", Statutory Instrument Nr. 218, 1958, beschrieben ist.

Sie Hefe hatte einen Rohproteingehalt im Bereich von 63 bis 66 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht der Hefe.

Versuch

Sum Vergleich wurde ein bekannter, Kohlenwasserstoffe verwertender Stamm von Candida lipolytica, nämlich der Stamm C.M.I. Nr. 9374-3, unter den gleichen Bedingungen gezüchtet, die vorstehend für den neuen Stamm C.B.S.· Nr. 6331 beschrieben wurden.

Nach Ablauf der 16-stündigen Anfahrperiode betrug die Zellkonzentration etwa 1,5 g/l· Aufgrund der geringen Wachstumsgeschwindigkeit wurde die Anfahrzeit verlängert, bis eine Zellkonzentration von 16 g/l erreicht war (nach etwa 40 Stunden). Der kontinuierliche Betrieb wurde bei einer Verdünnungsrate von 0,15 V/V/Std. aufgenommen, wobei die Kultur weggewaschen wurde. Ss'war nicht möglich, stetigen Betrieb zu erreichen, da die Wachstumsgeschwindigkeit zu niedrig war. .

Stationärer Betrieb wurde bei einer niedrigeren Verdünnungsrate von 0,07 V/V/Std. bei Anwendung eines Überdrucks von 1,5 kg/cm absolut erreicht. Der Rohproteingehalt des Hefeprodukts betrug etwa 54- Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht der Hefe. Die plattierten Kolonien waren cremefarben, faltig, rauhhaarig, matt und grob gefaltet. Die mikroskopische Untersuchung ergab reichliche

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Bildung von Pseuoomycelium. Septatmycelium wurde ebenfalls gefunden. Der Ausbeutefaktor betrug 0,53.

Beispiel 2

Candida lipolytica, Stamm CB.S. 6331» wurde unter den gleichen Bedingungen und bei der gleichen Verdünnungsrate von 0,07 V/V/S-;d. und bei den gleichen überdruck von 11 7 .kg/cm¹" absolut wie beim Stamai C.M.I. 93743 von Candida lipolytica gezüchtet, dessen Kultivierung vorstehend zum Vergleich anschließend an Beispiel 1 (Versuch) beschrieben vrorde. Der Ausbeutefaktor betrug 0,73 und der RohproteingehaIv etwa 59 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht der Hefe.

Beispiel 3

Candida lipolytica, Stamm C.B.S. 6331, wurde in ein wässriges Nährmedium und einen als Quelle von verwertbarem Kohlenstoff dienenden Kohlenwasserstoff geimpft, die in einem mit Rührer versehenen, belüfteten Druckgefäß mit einem Arbeitsvolumen von 55 1 enthalten waren. Der Kohlenwasserstoff bestand aus einem Gemisch von im Gasölbereich siedenden η-Paraffinen mit 11 bis 18, hauptsächlich 14 bis 17 C-Atomen im Molekül. Dieses Gemisch war durch eine Molekularsiebbehandlung eines Gasöls aus Erdöl erhalten worden. Das wässrige Nährmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

H₅IO₄ 1,455 g

K₂SO₄ 0,969 g

MgSO₄V⁷HpO 0,470 g

ZnS0₄'7H₂0 0,138 g

FeSO₄^HsO 0,047 g

D 0,041 g

<+ 0,500 g . . .

D 0,413 mg
Thiaminhydrochlorid 203 mg

Leitungswasser zur Auffüllung auf 1 Liter

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Nach einer Periode des OhargenwacLstums wurde kontinuierlicher Betrieb bei einer Verdünhungsrate. von 0,14 bis 0,15 V/V/Std. bei einer Temperatur von ;52°G und einem p„-Wert von 4,5. der durch Zusatz von Ammoniak nach. Bedarf aufrechterhalten wurde, aufgenommen. Der Kohlenwasserstoff wurde in einer Menge von 220,5 ial/Std. und das wässrige Nährmedium in einer Menge von 7,42 1/Std, zugeführt. Das Kulturmedium wurde mechanisch gerührt \ιηά mit 0,75 V/V/Min, belüftet. Der Druck im Fermenter wurde

p -.

bei 1,5 kg/cm~ absolut gehalten.

Etwa 240 Stunden nach der ursprünglichen Impfung mit der Kulturhefe wurde ein Inoculum, das fünf Bakterien der Gattungen Acinetobacter, Escherichia, Paracolobactrum und Pseudomonas enthielt, dem Kulturmedium im Ferment er zugesetzt. Bakterienzählungen, die in Abständen während der folgenden 180 Stunden an Proben des Kulturmediuns vorgenommen wurden, zeigten, daß die Zahl der vorhandenen lebensfähigen Bakterienzellen zwischen 300 000 und 2 500 000/ml Kulturmedium variierte.

•Nach einer Kultivierungsdauer von 330 bis 402 Stunden betrug die Zelldichte der Hefe (Candida lipolytica, Stamm C.B.S. 6331) 23,5 g/l und der Ausbeutefaktor 0,99. Das Hefeprodukt hatte einen Bohproteingehalt von 59 Gew.-%, bezogen auf das !Trockengewicht der ganzen Zellen.

Zwischen der 520. und 680. Stunde des Versuchs wurde der Pjj-Wert des Kulturmediums von 4,5 auf 4,8 erhöht. Bakterienzählungen, die am Kulturmedium zwischen der 800. und 1200. Betriebsstunde vorgenommen wurden, ergaben etwa ICK bis 3 χ 1θ" Zellen/ml. Die Zahl der während der gleichen Zeit vorhandenen Zellen von Candida lipolytica lag in der gleichen Größenordnung wie die Zahlen der Bakterienaellen.

Zwischen der 1122. bis 1218. Betriebsstunde betrug das Gewicht der Trockenzellen der Hefe 21,3 g/l und der

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Ausbeutefaktor 0,96. Der Rohproteingehalt der Hefe, betrug etwa 59 Gev/.-%, bezogen auf äaa Trockengewicht der ganzen Zellen.

Nach einer Betriebsdauer von 1218 Stunden wurde der p„-V/ert weiter auf 5>,0 erhöht, worauf der Betrieb des Permenters unstetig wurde und schwierig zu regulieren war. Gleichzeitig schwankte der Ausbeutefaktor für die Hefe. Zur gleichen Zeit stieg die Bakterienzahl, bis sie die Zahl der Hefezellen übersI

Dieses* Beispiel veranschaulicht die zufriedenstellende kontinuierliche Durchführung einer Fermentation zur Herstellung von Hefe als Biomasse unter Verwendung des neuen Stamms Candida lipolytica C.B.S. 63J1 in Gegenwart von in erheblicher Menge vorhandenen verunreinigenden Bakterien. Es zeigt ferner, daß die Großherstellurg von Hefe als Biomasse unbefriedigend ist, wenn die Fermentation unter nicht-aseptischen Bedingungen bei pr--Werten von etwa 5 oder höher durchgeführt wird".

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Claims

Paten tan s ρ r ü c h e

1. Verfahren zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in
Proteinmaterialien, wobei man Hefe, die geradkettige
Kohlenwasserstoffe verwertet, in Gegenwart eines geradkettigen Kohlenwasserstoffs mit wenigstens 10 Kohlenstoffatomen im Molekül, eines wässrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases züchtet,
dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Candida lipolytica, Stamm CB.S. Mr. 6331, verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung unter nicht-aseptis.chen Arbeitsbedingungen bei. einem ρττ-Υ/ert im Bereich von 4- bis 4,8 durchgeführt wird. -

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