DE2406708C3

DE2406708C3 - Verfahren zum submersen, aeroben Züchten von Hefezellen

Info

Publication number: DE2406708C3
Application number: DE19742406708
Authority: DE
Inventors: Shun-Ichi Matsumoto; Eiji Sato
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1973-02-21
Filing date: 1974-02-13
Publication date: 1976-08-12
Also published as: FR2218382B1; FR2218382A1; DE2406708A1; NL7402227A; IT1009219B; US3879261A; DE2406708B2; GB1453022A

Description

Die gewerbliche Produktion von Hefezellen aus Normalparaffin wurde in einigen Ländern realisiert, und die Ausnutzung der Produkte als Futtermittel befindet sich in der Entwicklung, über verschiedene Hefestämme wurde berichtet, daß sie Methanol, Äthanol, Essigsäure u. dgl. als ihre Hauptkohlenstoffquelle assimilieren können, und von einigen diesen Stämmen kann man erwarten, daß sie zur Produktion von Hefezellen verwendet werden.

S. Oma ta et al. untersuchten die Fähigkeit verschiedener Hefestämme, niedermolekulare Alkohole zu assimilieren. Sie berichteten in Journal of the Fermentation Association, Japan, Bd. 26, S. 313 bis 316 (1968), daß keiner der von ihnen untersuchten Hefestämme tatsächlich sekundäres Butanol ausnutzte, während nur einige wenige Normalbutanol ausnutzten.

Es wurde nun eine neue Species von Hefestämmen gefunden, die die Fähigkeit hat, durch Assimilierung von normalem und/oder sekundärem Butanol als ihre Hauptkohlenstoffquelle zu wachsen, so daß es möglich ist, Hefezellen aus diesen Butanolen zu produzieren.

Die Erfindung entspricht dem Gegenstand des Patentanspruchs.

Gemäß der Erfindung kann man nun Hefezellen unter Verwendung von Hefestämmen, die zu den Gattungen Candida und Trichosporon gehören, und unter Ausnutzung von Normalbutanol und/oder sekundärem Butanol als Hauptkohlenstoffquelle produzieren. Das nach der vorliegenden Erfindung verwendete n- und sek.-Butanol kann in wirtschaftlicher Weise erhalten werden, indem man C₄-Oleiine hydratisiert, welche ihrerseits Nebenprodukte der Kohlenwasserstoffkrackverfahren bei der Herstellung von Äthylen sind.

Die Hefestämme, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden und die sowohl Normalbutanol als auch Sekundärbutanol assimilieren:

Candida butanolphila nov. sp. FERM-P 1882,
Candida butanolytica nov. sp. FERM-P 1883,
Candida alcophila nov. sp. FERM-P 1884,
Trichosporon butanophilum nov. sp. FERM-P

1885,
Trichosporon alcophilum nov. sp. FERM-P 1886.

Die Hefestämme, die erfindungsgemäß verwendet werden und die nur Normalbutanol assimilieren

Candida ellipsis nov. sp. FERM-P 1908,
Candida splitica nov. sp. FERM-P 1909,
Trichosporon opalum nov. sp. FERM-P 1910,
Candida spherica nov. sp. FERM-P 1911.

Diese Hefearten wurden bezüglich ihrer Gattungen klassifiziert und sind neue Species auf Grund ihrer taxonomischen Eigenschaften, die nachfolgend erwähnt sind:

Taxonomische Eigenschaften

a) Die Wachstumseigenschaften der vegetativen Zellen in verschiedenen Medien sind in Tabelle I nachfolgend aufgeführt.

b) Ascosporenproduktion

Für alle Arten auf Gorodkwa-Agar und Gipsblock (bei 30⁰C während 7 Tagen) nicht vorhanden.

c) Ballistosporenproduktion

Bei allen Arten auf Malzhefeextrakt-Agar nicht vorhanden.

d) Physiologische Eigenschaften sind in Tabellen nachfolgend aufgeführt.

e) Assimilierung verschiedener Kohlenstoffquellen. Diese ist in der nachfolgenden Tabelle III aufgeführt.

0 Fermentierung von Zuckern. Diese ist in der nachfolgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle I

Wachstumseigenschaften vegetativer Zellen in verschiedenen Medien

Medium und Bedingungen Beobachtung des Wachstums

FERM-P 1882 C. butanophila

FERM-P 1883 C. butanolytica

Malzhefeextraktmedium

Pepton 5 g

Hefeextrakt ... 3 g
Malzextrakt ... 3 g

D-Glucose 10 g

Dest. Wasser.. 1000 ml.

(30⁰C, 2 bis 7 Tage)

1. Form

2. Größe

3. Vegetative Reproduktion

4. Häutchen

5. Gasbildung

6. Trübung des Mediums

7. Sedimentbildung

8. Farbe! des Mediums

oval oder lang oval
(3—8 μ) (8-14 μ)
Knospung

dünnes und glattes

Häutchen, kriechende

Ringbildung

kompaktes Sediment

keine Veränderung

zylindrisch

(2-5 _μ). (7-15 μ)
Knospung

dünnes und glattes
Häutchen, kriechende
Ringbildung
nicht
mäßig

kompaktes und blockartiges Sediment
keine Veränderung

Fortsetzung

Medium und Bedingungen Beobachtung des Wachstums

FERM-P 1882 C. buianophüa

FERM-P 1883 C. butanolytica

Malzhefeextrakt-Agar

"Pepton 5 g

Hefeextrakt ... 3 g
Malzextrakt ... 3 g

D-Glucose 10 g

Agar 15 g

Dest. Wasser.. 1000 ml_

(25⁰C, 7 bis 10 Tage)

(Fortsetzung)
Beobachtung des Wachstums

1. Wachstum

2. Kolonie

a) Form

b) Rand

c) Oberflache

d) Form des senkrechten Schnittes

e) Glanz 0 Farbe reichlich

unregelmäßig rund
fadenförmig
radial runzelig
buckelig

stumpf
milchigweiß,
etwas gräulich

reichlich

unregelmäßig rund fadenförmig radial runzelig buckelig

stumpf
milchigweiß, etwas gräulich

FERM-P 1884 C. alcophila

FERM-P 1911 C. Spherica

1. Form

2. Größe

3. Vegetative Reproduktion

4. Häutchen

5. Gasbildung

6. Trübung des Mediums

7. Sedimentbildung

8. Farbe des Mediums

1. Wachstum

2. Kolonie

a) Form

b) Rand

c) Oberfläche

d) Form des senkrechten Schnittes

e) Glanz
0 Farbe

kurz oval (2-6 μ) · (5-Knospung

kugelig μ) (5—10 μ) Knospung

dünnes und glattes

Häutchen

nicht

kompaktes und

blockartiges

Sediment

keine Veränderung

reichlich

unregelmäßig rund fadenförmig radial runzelig buckelig

nicht

milchigweiß, etwas gräulich

schweres und dickes Häutchen

nicht nicht

kompaktes Sediment

keine Veränderung reichlich FERM-P 1908
C. ellipsis

oval

(2-5 μ) · (3-7 μ)

Knospung
Ringbildung

nicht

mäßig

Blocksediment

FERM-P 1909 C. splitica

keine Veränderung
reichlich

unregelmäßig rund rund

fadenförmig glatt

radial runzelig glatt

kissenförmig erhöht

nicht milchigweiß,
etwas gräulich

glänzend
milchigweiß

lang oval

(2—5 μ) -(5—15 μ)

Knospung

schweres und dickes Häutchen

nicht
mäßig

schuppiges und kompaktes Sedimen

keine Veränderung reichlich

unregelmäßig rund fadenförmig radial runzelig buckelig

nicht milchigweiß

(Fortsetzung)
Beobachtung des Wachstums

1. Form

2. Größe

3. Vegetative Reproduktion

4. Häutchen

5. Gasbildung

6. Trübung des Mediums

7. Sedimentbildung

8. Farbe des Mediums

FERM-P 1885 T. butanophilum

oval

(8--Ι2μ)·(1Ο- -20 μ)

Knospung

dünnes und glattes

Häutchen, kriechende

Ringbildung

nicht

etwas

Blocksediment

keine Veränderung FERM-P 1886
T. alcophilum

oval

(7—14 μ) -(10—20 μ)

Knospung
dünnes Häulchen,
kriechende Ringbildung

nicht
nicht

Blocksediment
keine Veränderung

FERM-P 1910 T. opalum

oval

(2-5 μ) -(3—8 μ)

Knospung Häutchenbildung

nicht
mäßig

Blocksediment keine Veränderung

Fortsetzung

ieobachtung des Wachstums

FERM-P 1885 T. but&nophilum

1. Wachstum

2. Kolonie

a) Form

b) Rand

c) Oberfläche

d) Form des senkrechten Schnittes

e) Glanz
0 Farbe

reichlich

rund gezackt körnig erhöht

nicht

milchigweiß, etwa: gräulich

FERM-P 1886 T. alcophilum

reichlich

rund gezackt rauh konvex

nicht

milchigweiß, etwas gräulich

FERM-P 1910 T. opal um

reichlich

unregelmäßig rund

gezackt

rauh

flach

nicht milchigweiß

(Fortsetzung)

Medium und Bedingungen

Beobachtung des Wachstums FERM-P 1882 C butanophila

Kartoffelagar (Scheibenkultur)

[frische Kartoffel... 100 g "

I D-Glucose 20 g

j Agar 20 g

LDest. Wasser 1000 ml

(3O⁰C, 3 Tage)

(Fortsetzung)

Beobachtung des Wachstums

1. echtes Mycel

2. Pseudomycel

3. Chlamydosporen

4. Blastsporen

5. Arthrosporen

6. morphologische Eigenschaften ja

nein nein nein

spezielles farnartiges Mycel

FERM-P 1883 C. butanolytica

ja

nein

spezielles farnartiges

Mycel

FERM-P 1884 C. alcophila FERM-P !911 C. Splierica

FERM-P 1908 C. ellipsis

1. echtes Mycel

2. Pseudomycel

3. Chlamydosporen

4. Blastsporen

5. Arthrosporen

6. morphologische Eigenschaften

(Fortsetzung)

ja

nein

nein ja

ja

nein

ja

nein

teilweise ja

nein

FERM-P 1909 C. splitica

ja

nein

teilweise ja

Beobachtung des Wachstums

spezielles farnartiges Mycel

FERM-P 1885 T. butanophilum

1. echtes Mycel

2. Pseudomycel

3. Chlamydosporen

4. Blastsporen

5. Arthrosporen

6. morphologische Eigen

nein

nein nein nein

spezielles farnartiges Mycel

	FERM-P 1910
FERM-P 1886	T. opalum
T. alcophilum	nein
nein	nein
nein	nein
nein	nein
nein	ja
ja	reichlich Arthrosporen

Tabelle II

['hysiologischc Eigenschaften

ll/.KM-Nummcr Name der Species

	FBRM-P 1882	FERM-P 1883	FERM-P 1884	FERM-P 1911
	C. butanophila	C. bulanolytica	C. alcophila	C. sphcrica
Optimale Wachstums
bedingungen
pH	3,0 7,0	3,0 7,0	3,0-7,0	3,0—7,0
Temperatur	2O--35°C	2O--35°C	20--35⁰C	20—36° C
Wachstumsgrenze
pH	knappes Wachs	knappes Wachs	knappes Wachs	knappes Wachs
	tum bei pH 7,8	tum bei pH 7,8	tum bei pH 7,8	turn bei pH 7,8
Temperatur	knappes Wachs	knappes Wachs	knappes Wachs	knappes Wachs
	tum bei 40⁰C	tum bei 4O⁰C	tum bei 40⁰C	turn bei 42⁰C
Assimilierung von	nicht	nicht	nicht	nicht
Kaliumnitrat
Spaltung von Arbutin	nicht	nicht	nicht	beobachtet
Äthanol als einzige	reichliches	reichliches	reichliches	reichliches
Kohlenstoffquelle	Wachstum	Wachstum	Wachstum	Wachstum
Wirkung von Lackmus	keine	keine	keine	gelb und
milch	Veränderung	Veränderung	Veränderung -	Verfestigung
Ureasetest	+	+	+	+
Produktion von	nicht	nicht	nicht	nicht
Carotencidpigment
(Fortsetzung)
	FERM-Nummcr Name der Species
	FERM-P 1908 FERM-P 1909 FERM-]	⁵ 1885 FERM-P 1886	FERM-P 1910
	C. ellipsis C	'. splilica T. bulanophilum T. alcophilum	T. opalum

Optimale Wachstumsbedingungen

pH
Temperatur

Wachstumsgrenze
pH

Temperatur

Assimüierung von Kaliumnitrat

Spaltung von Arbutin

Äthanol als einzige Kohlenstoffquelle

Wirkung von Lackmusmiich

Ureasetest

Produktion von Carotenoidpigment

3.0—7,0 20—W C

knappes Wachstum bei pH 7,8

knappes

Wachstum

beJ42°C

nicht

reichliches Wachstum

3.0-7.0 20—36^CC

knappes Wachstum bei pH 7,8

knappes

Wachstum

bei42^cC

nicht

beobachtet

reichliches Wachstum

3,0—7.0
20—35^CC

knappes
Wachstum bei pH 7,8

knappes Wachstum bei 40⁰C

reichliches Wachstum

3,0—7,0 20—35-C

knappes Wachstum bei pH 7,8

knappes Wachstum bei 40⁰C

nicht

reichliches Wachstum

3,0-7,0 20—36¹C

knappes Wachstum bei pH 7,8

knappes Wachstum bei 42° C

nicht

reichliches Wachstum

keine gelb und keine keine keine

Veränderung Verfestigung Veränderung Veränderung Veränderung

nicht

(Fortsetzung)

Produktion von stärkeähnlichen Verbindungen Vitamin-Erfordernisse Produktion von organischer Säure Wachstumsgrenze in NaCl-Lösung Butanol als einzige Kohlenstoffquelle

Gelatineverflüssigung

FERM Nummer Name der Species

FERMP 1882 FHRM-P 1X8.1 1'ERM-I' 1X84

C. bulunophila (Λ rniianolyticn C alcnphiln

nicht

± nicht

10%

(sek.-) reichliches Wachstum nicht

nicht

i. nicht

10%

(sek.-) reichliches Wachstum nicht

nicht

nicht 10% (sek.-)
reichliches
Wachstum
nicht

IERM-P 1911 C. sphcrica

beobachtet

±
nicht

10%

FERM-P (908 C. ellipsis

nicht

nicht 10%

(n-)reichliches (n-)reichlichcs Wachstum Wachstum

beobachtet

(Fortsetzung)

Produktion von stärkeähnlichen Verbindungen Vitamin-Erfordernisse Produktion von organischer Säure Wachstumsgrenze in NaCl-Lösung Butanol als einzige Kohlenstoffquelle Gelatineverfliissigung

FhRM-Nummer FERM-P 1909 C. splitica	Name der Species FERM-P 1885 T. buliinophiliim	FERM-P I88(i T. alcophilum	FERM-I' 1910 T. opal um
beobachtet	nicht	nicht	nicht
+ nicht	± nicht	± nicht	-τ η ich t
10%	10%	10%	10%
(n-Jreichlichi's Wachstum beobachtet	(sek.-lrcichüches Wachstum nicht	(sek.-)reichliches Wachstum nicht	(n-)reichliches Wachstum beobachtet

Tabelle III

Assimilierung verschiedener Kohlenstoffquellen

Kohlenstoffquelle

D-Glucose

D-Galactose Saccharose

Maltose

Lactose

Raffinose

Esculin

Inulin

Dextrin

Melibiose

Hefespecies FERM-P 1882 C. butanophila

FERM-P 1883 C. butanolytica FERM-P 1884
C. alcophila

FERM-P 1911 C spherica

FERM-P 1908 C ellipsis

(Fortsetzung)

11

Hcfcspccics

FHRM-P 19(W FERM-P 1885 FF.RM-P 1886 FERM-P 1910

C splitiea T. butanophilum T. alcophilum T. opalum

Kohlcnstoffquclle D-Glucosc D-Galactose Saccharose Maltose Lactose Raffinose Esculin Inulin Dextrin Melibiose

(Fortsetzung)

Hcfcspccics

FERM-P 1882 FERM-P 1883 FERM-P 1884 FERM-P 1911 FERM-P 1908

C. bulanophila C. butanolytica C. alcophila C. spherica C. ellipsis

D-Arabinose Lösliche Stärke Trehalose D-Mannose Ί-Melhyl-D-glucose ι )-Xylose

(Fortsetzung)

Hefespecics

FERM-P 1909 HrRM-P 1885 FERM-P 1886 FERM-P 1910

C. splitica T. butanophilum T. alcophilum T. opalum

D-Arabinose Lösliche Stärke Trehalose D-Mannose ii-Methyl-D-glucose D-Xylose

Tabelle IV Zuckerfcrmentieniüg

Zucker Hefespecics

FERM-P 1882 FERM-P 1883 FERM-P 1884 FERM-P 1911 FERM-P 1908

C bulanophila C. butanolytica C alcophila C spherica C. ellipsis

D-Glucose ___-}-_

D-Galactose _ _ _ _ _ Saccharose — — — ± — Maltose — — — — — Lactose - — — — —

Raffinose — — — + —

(Fortsetzung)

Zucker

llcfespecics	IKRM-I' IXS5	I-	IiRM-P IhKd	r	IiRM-P 1410
FERM-P IWH	T. hut.innphilum	T	alcophiliim	T	. ο na I um
C. splitica

D-Gl UCOSC

D-Galaclose

Saccharose

Maltose

Lactose

Raffinose

Sechs Stämme der oben aufgeführten Helen (FERM-P 1882, 1883, 1884, 1911, 1909 und 1910) bilden keine Ascosporen, Ballistosporen oder Arthrosporen. Ihre vegetativen Zellen sind oval oder zylindrisch mit einigen Variationen in der Größe. Sie reproduzieren sich durch Knospung oder Keimung und bilden echte oder Pseudomycels. Es wird kein Carotinoidpigment gebildet.

Es ist somit angebracht, diese Arten als Candida anzusehen, im Hinblick auf die Beschreibung in »The Yeasts, a Taxonomic Study« von J. L ο d d e r und N. W. J. K r e ge r-- ν a η R i j (1952).

Beim Vergleich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften von FERM-P 1S82, 1883 und 1884 (C. butanophila, C. butanolytica und C. alcophila) mit jenen der beschriebenen Arten von Candida ergibt sich, daß sie in den Fermentationseigenschaften und in der Assimilation von Zuckern ähnlich wie C. rugosa sind. Sie unterscheiden sich jedoch wesentlich von C. rugusa hinsichtlich der Äthanolassimilierung, der Wirkung auf Lackmusmilch und hinsichtlich der Abwesenheit langer zylindrischer Zellen.

FERM-P 1911 (C. spherica) ist ähnlich C. solani, C. guilliermoudii und C. molibiosi hinsichtlich der Eigenschaften der Fermentation und Assimilierung von Zuckern. FERM-P 1911 unterscheidet sich aber von diesen beschriebinen Arten hinsichtlich der Lactoseassimilierung, der Wirkung auf Lackmusmilch und der Form der vegetativen Zelle.

FERM-P 1908 (C. ellipsis) ist ähnlich C. rugosa in den Fermentationseigenschaften und der Assimilierung von Zuckern. FERM-P 1908 unterscheidet sich aber von diesen beschriebenen Arten hinsichtlich der Äthanolassimilierung, der Wirkung auf Lackmusmilch und der Form der vegetativen Zelle.

FERM-P 1909 (C. splitica) ist ähnlich C. humicola und C. curvata insofern, als keine Fermentierung von Zuckern erfolgt, und hinsichtlich der Assimilierung von D-Glucose, D-Galactose, Saccharose und Maltose. FERM-P 1909 unterscheidet sich auch von C. humicola hinsichtlich der Äthanolassimilierung und der Morphologie der Pseudomyceln und von C. corvata hinsichtlich der Form der vegetativen Zelle und dei Arbutinaufspaltung.

Die drei obengenannten Stämme, FERM-P 1985, 1886 und 1910 wurden auf der folgenden Grundlage als der Gattung Trichosporon angehörig identifiziert. Diese Arten bilden weder Ascosporen noch Ballistosporen. Sie bilden Ärthrosporen. Die vegetativen Zellen sind oval und reproduzieren sich durch Knospung. Carotinoidpigment wird nicht gebildet.

FERM-P 1885(T. butanophilum)ähnelt T. sericeum und T. capitatum hinsichtlich der Zuckerfermentierung

und der Assimilierung von Glucose und Galactose. FERM-P 1885 unterscheidet sich jedoch von T. sericeum durch die Nilralassimilierung und die Bildung von echtem Myce! auf Kartoffclagar. T. capitatum ist nicht identisch mit ihm hinsichtlich der Äthanolassimilierung und einiger morphologischer Eigenschaften.

FLRM-P 1886 (T. alcophilum) ist ahnlich wie T. cutaneum hinsichtlich der Ferincntierung und Zuckerassimilierung. Sie sind jedoch nicht identisch

hinsichtlich der Assimilierung von Galactose und Äthanol sowie hinsichtlich der Form der vegetativen Zellen.

FERM-P 1910 (T. opalum) ähnelt T. sericeum und T. capitatum hinsichtlich der Zuckerfermentierung

und der Assimilierung von D-Glucose und D-Galactose. FERM-P 1910 unterscheidet sich aber von den beschriebenen Hefen hinsichtlich der Morphologie von echtem Mycel.
Aus diesen Gründen wurde geschlossen, daß diese

Hefen als neue Arten bezeichnet werden sollten, und wurden, wie oben erwähnt, benannt.

Bei der Bildung von Hefezellen kann einer der Hefestämme in einem Medium gezüchtet werden, das Normalbutanol und/oder Sekundärbutanol als Haupt-

kohlenstoffquelle. Stickstoffverbindungen, NährstofF-salze und wachstumsfördernde Materialien enthält. Bezüglich der Zusammensetzung des Kulturmediums ist zu sagen, daß man entweder solches synthetischen oder natürlichen Ursprungs verwenden kann, solange

es die obenerwähnten Materialien enthält.

Die Konzentration an Normalbutanol und/oder Sekundärbutanol in dem Medium sollte sorgfältig bestimmt werden. Wenn die Konzentration zu hoch wäre, würde dies zu einer Hemmung des Wachstoms

der Hefe führen. Außerdem würde dann ein Verlust an Butanolen als Abgas größer. Aus diesem Grund werden die Butanole dem Kulturmedium am besten stufenweise oder kontinuierlich während der Fennentationszeit zugesetzt, um eine geeignete Konzentration

aufrechtzuerhalten.

Außer dem Normalbutanol und/oder Sekundärbutanol können zu dem Kulturmedium auch ausnntzbare Kohlenstoffquellen, wie Zucker oder andere Alkohole, zugesetzt werden, um das Wachstum der

Hefestämme zu fordern.

Die Stickstoffquelle des Mediums kann beliebig aus stickstoffhaltigen Materialien, die von der Hefe ausgenutzt werden, ausgewählt werden. Gewohrik*

erhält man gute Resultate, wenn Ammoniak, Harnstoff oder Ammoniumsa?-;e, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Ammoniumphosphat, als Stickstoffquelle mit einer Konzentration zwischen etwa 0,1 und 4% verwendet werden.

Als andere Bestandteile außer Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können Nährstoffsalze und wachstumsfördernde Materiahen zugesetzt werden, die alle oder einige der folgenden Verbindungen einschließen: Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, eisenhaltige Verbindungen, Mangan, Zink und andere Mineralien, Vitamine, Aminosäuren und Nucleotide.

Die Hefen werden unter submersen aeroben Bedingungen während etwa 1 bis 3 Tagen bei einer Temperatur von etwa 20 bis 30° C gezüchtet Der pH-Wert des Kulturmediums wird vorzugsweise zwischen etwa

3 und 7 gehalten. Infolge der Produktion organischer Säuren aus Butanolen und/oder des Verbrauchs von Ammoniumionen in dem Kulturmedium kann der pH-Wert abnehmen. Um den pH-Wert des Mediums in einem erwünschten Bereich zu halten, ist es erforderlich, entweder Calciumcarbonat oder eine Pufferlösung zuzusetzen oder das Medium während des Kultur Verlaufs mit einer Ammoniak- oder Alkalilösung zu titrieren.

Wenn die Kultur beendet ist, können die Hefezellen von dem Kulturmedium entweder durch Filtration oder durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Die Zellen werden dann gewaschen und getrocknet.

An Hand der folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.

Beispiel 1

Ein Kulturmedium aus 0,02% (Gewicht je Volumen) KH₂PO₄, 0,12% (Gewicht je Volumen) K₂HPO₄, 0,05% (Gewicht/Volumen) MgSO₄ · 7H₂0,0,3% (Gewicht/Volumen) (NH₄)₂SO₄ und 0,3% Hefeextrakt wurde in einer Menge von 50 ml in drei Sakaguchi-Kulturkolben (500 ml) gegeben und in einem Autoklav bei 120" C während 15 Minuten sterilisiert. Nachdem das Medium abgekühlt war, wurde Sekundärbutanol jedem Kolben zugesetzt, um eine Endkonzentration an Sekundärbutanol von 0,5% (Gewicht/Volumen) zu ergeben. Der pH-Wert des Mediums lag bei 6,0 vor und nach der Sterilisierung.

FERM-P 1882 (C. butanophila), FERM-P 1883 (C. butanolytica) und FERM-P 1884 (C. alcophilr.) wurden einzeln in getrennte Kolben geimpft und unter Schütteln bei 3O⁰C gezüchtet.

Die Konzentration an Sekundärbutanol in dem Kulturmedium wurde durch Gaschromatographie bestimmt. Innerhalb einer Kulturzeit von 18 Stunden war das Sekundärbutanol in dem Kulturmedium nahezu vollständig verbraucht. Sodann wurde Sekundärbutanol auf 0,5% zugesetzt (Volumen/Volumen). Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt, um eine hohe Dichte der Zellen zu erhalten. Der pH-Wert des Mediums während der Züchtung wurde zwischen

4 und 6 gehalten, indem mit 10%igem Ammoniak titriert wurde. Die Hefezellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeuten an trockenen Zellen betrugen 14,0gje Liter Brühe fur FERM-P 1882 (C. butanophila), 10,0g/l Brühe für FERM-P1883 (C. butanolytica) und 12 g/l Brühe für FERM-P 1884 (C. alcophila). Die Fortpflanzungsgeschwindigkeit dieser Hefen in den Medien betrug 2,5, 2,9 bzw. 3,2 Stunden Verdoppelungszeit. Die Werte der Elementaranalyse der Trockenzellen dieser Hefen sind in der Tabelle V aufgeführt.

Beispiel 2

FERM-P 1885 (T. butanophilum) und FERM-P 1886 (T. alcophilum) wurden einzeln in getrennte Kolben geimpft, die das gleiche Medium enthielten, welches im Beispiel 1 verwendet wurde, und die Züchtung erfolgte in ähnlicher Weise. Der Verbrauch an Sekundärbutanol in dem Medium war vollständig innerhalb von 20 bis 24 Stunden. Sekundärbutanol wurde sechsmal zugesetzt, um bei jeder Zugabe eine Konzentration von 0,5% Butanol (Volumen/Volumen) zu ergeben. Die Zellen wurden abgeltrennt, gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute an getrockneten Zellen (g/l Brühe) betrug 10,0 für FERM-P1885 (T. butanophilum) und 8,0 für FERM-P1886· (T. alcophilum). Die Fortpflanzungsgeschwindigkeiten dieser Hefen betrugen 2,8 bzw. 3,2 Stunden für die Verdoppelungszeit. Die Werte für die Elementaranalyse der getrockneten Zellen sind in Tabelle V aufgeführt

Tabelle V	Kohlenstoff	Wasserstoff	Stic
	46,9	6,5	7,5
FERM-P 1882
C. butanophila	45,3	6,7	5,2
FERM-P 1883
C. butanolytica	46,1	6,9	6,7
FERM-P 1884
C. alcophila	46,5	6,9	6,7
FERM-P 1885
C. butanophilum	45,0	6,8	6,5
FERM-P 1886
T. alcophilum	Beispiel	3

Zu dem im Beispiel 1 hergestellten Medium wurde Normalbutanol zugesetzt, um eine Endkonzentration von .0,5% (Gewicht/Volumen) zu ergeben.

Sechs Stämme von Candida und drei Stämme von Trichosporon, die in der Tabelle VI aufgeführt sind, wurden einzeln in diese getrennten Kolben geimpft und unter Schütteln bei 30⁰C während 24 Stunden gezüchtet.

Die Hefezellen wurden in gleicher Weise wie im Beispiel 1 abgetrennt und behandelt Die Ausbeute der Zellen ist in der Tabelle VI gezeigt

Tabelle VI	Name der Hefespecies	Ausbeute g/l Brühe
FERM-Nummer	C. butanophila	1,0
1882	C. butanolytica	1,1
1883	C. alcophila	0,9
1884	C. spherica	1,1
1911	C. ellipsis	.0,8
1908	C. splitica	0,9
1909	T. butanophilum	1,1
1885	T. alcophilum	1,2
1886	T. opalum	0,7
1910		609623/295

Vergleichsversuch

In ein 30-1-Fermentiergefäß wurden 101 Kulturmedium übhcher Zusammensetzung gegeben und 2 Stunden mit Wasserdampf sterilisiert. Sodann wurde das Kulturmedium mit dem Hefestamm FERM-P 1882 (C. butanophfla) geimpft und bei 30? C gezüchtet, wobei kontinuierlich 201 je Minute Luft und sek.-Butanol zugeführt wurden und durch 200 Umdrehungen je Minuten gerührt wurde. Es wurde 42 Stunden gezüchtet, während die Luft aus dem Fermentiergerät zusammen mit sek.-Butanol durch eine mit Wasser gefüllte Falle perlte, um entweichendes sek.-Butanol aufzufangen. Die Gesamtmenge an sek.-Butanol, die in das Fermentiergerät eingeführt wurde, betrug

Die Menge an sek.-Butanol, die aus dem Fermentiergerät entwich, betrug Il 1,3 g und 16,5 g sek.-Butanol blieben in dem Fermentiergerät am Ende der Züchtung. Somit waren 168,7 g sek.-Butanol für das Wachstum der Hefe verbraucht worden.

Die Hefezellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser dreimal gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die so erhaltenen getrockneten Hefezellen wogen 140 g. Die Ausbeute der Hefezellen bzw. Proteinausbeute auf der Grundlage des sek.-Butanolgewichtes, berechnet nach der folgenden Formel, betrug 83%.

„_ . , Gewich) der erhaltenen trockenen Hefezellen

Proteinausbeute = ——r-:—_; :—τ?-. ^ _;

Gewicht des assimilierten Butanols

100.

Der gleiche Versuch wurde unter Verwendung von Normalbutanol an Stelle von sek.-Butanol wiederholt. 3LOg n-Butanol wurden in das Fermentiergerät eingespeist, und 119g n-Butanol wurden assimiliert. Die Menge der so erhaltenen getrockneten Hefezellen betrug U)Og. Die Ausbeute lag bei 84%, berechnet auf das n-Butanolgewicht.

Die gleichen Versuche wurden auch für die übrigen in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Hefestämnae durchgeführt, wobei im Falle der vier letzten Hefestämme lediglich n-Butanol verwendet wurde. Die Ausbeuten sind alle in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.

Gemäß dem Stand der Technik wurden 17 g trockene Hefezellen bzw. Protein aus 100 ml (etwa 78 g) η-Paraffin erhalten. Diese Ausbeute entspricht etwa 22%, berechnet auf das n-Paraffingewicht. Daraus ist ersichtlich, daß nach dem vorliegenden Verfahren Proteinausbeuten erzielt werden, die dreibis viermal so groß sind wie nach dem Stand der Technik.

Hefestämmc	Proteinausbeute	n-Butanol (%)
	sek.-Butanol (%)	84
C. butanophila	83
FERM-P1882		72
C. butanolytica	75
FERM-P1883		75
C. alcophila	72
FERM-P 1884		82
T. butanophilum	78
FERM-P 1885		80
T. alcophilum	80
FERM-P1886		78
C. ellipsis	—
FERM-P1908		76
C. splitica	—
FERM-P 1909		72
T. opal um	—
FERM-P 1910		75
C. spherica	—
FERM-P 1911
Stand der Technik	C 11-18-n-Paraffine
	~22%

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zum submersen, aeroben Züchten von Hefezellen wänrend etwa 1 bis 3 Tagen bei einer Temperatur von etwa 20 bis 30⁰C₁ einem pH-Wert des Kulturmediums vorzugsweise zwischen etwa 3 und 7 und dem Einsatz von Butanol als Hauptkohlenstoffquelle, dadurchgekennzeichnet, daß man als Normalbutanol oder Sekundärbutanol assimilierenden Hefestamm Can- ι ο dida butanolphila nov. sp. FERM-P 1882, Candida butanolytica nov. spez. FERM-P 1883, Candida alcophüa nov. sp. FERM-P 1884, Trichosporon butanophilum nov. sp. FERM-P 1885 oder Trichosporon alcophilum nov. sp. FERM-P1886 oder als Normalbutanol assimilierenden Hefestamm Candida ellipsis nov. sp. FERM-P 1908, Candida splitica nov. sp. FERM-P1909, Trichosporon opalum nov. sp. FERM-P 1910 oder Candida spherica nov. sp. FERM-P 19 Π einsetzt.