DE2406708B2 - Verfahren zum submersen, aeroben Züchten von Hefezellen - Google Patents

Verfahren zum submersen, aeroben Züchten von Hefezellen

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Description

Die gewerbliche Produktion von Hefezellen aus Normalparaffin wurde in einigen Ländern realisiert, und die Ausnutzung der Produkte als Futtermittel befindet sich in der Entwicklung, über verschiedene Hefestämme wurde berichtet, daß sie Methanol, Äthanol, Essigsäure u. dgl. als ihre Hauptkohlenstoffquelle assimilieren können, und von einigen diesen Stämmen kann man erwarten, daß sie zur Produktion von Hefezellen verwendet werden.
S. O m a t a et al. untersuchten die Fähigkeit verschiedener Hefestämme, niedermolekulare Alkohole zu assimilieren. Sie berichteten in Journal of the Fermentation Association, Japan, Bd. 26, S. 313 bis 316 (1968), daß keiner der von ihnen untersuchten Hefestämme tatsächlich sekundäres Butanol ausnutzte, während nur einige wenige Normalbutanol ausnutzten.
Es wurde nun eine neue Species von Hefestämmen gefunden, die die Fähigkeit hat, durch Assimilierung von normalem und/oder sekundärem Butanol als ihre Hauptkohlenstoffquelle zu wachsen, so daß es möglich ist, Hefezellen aus diesen Butanolen zu produzieren.
Die Erfindung entspricht dem Gegenstand des Patentanspruchs.
Gemäß der Erfindung kann man nun Hefezellen unter Verwendung von Hefestämmen, die zu den Gattungen Candida und Trichosporon gehören, und unter Ausnutzung von Normalbutanol und/oder sekundärem Butanol als Hauptkohlenstoffquelie produzieren. Das nach der vorliegenden Erfindung verwendete n- und sek.-Butanol kann in wirtschaftlicher Weise erhalten werden, indem man C^-Olefine hydratisiert, welche ihrerseits Nebenprodukte der Kohlenwasserstoffkrackverfahren bei der Herstellung von
ίο Äthylen sind.
Die Hefestämme, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden und die sowohl Normalbutanol als auch Sekundärbutanol assimilieren:
Candida butanolphila nov. sp. FERM-P 1882,
Candida butanolytica nov. sp. FERM-P 1883,
Candida alcophila nov. sp. FERM-P 1884,
Trichosporon butanophilum nov. sp. FERM-P 1885,
Trichosporon alcophilum nov. sp. FERM-P 1886.
Die Hefestämme, die erfindungsgemäß verwendet werden und die nur Normalbutanol assimilieren
Candida ellipsis nov. sp. FERM-P 1908,
Candida splitica nov. sp. FERM-P 1909,
Trichosporon opalum nov. sp. FERM-P 1910,
Candida spherica nov. sp. FERM-P 1911.
Diese Hefearten wurden bezüglich ihrer Gattungen klassifiziert und sind neue Species auf Grund ihrer taxonomischen Eigenschaften, die nachfolgend erwähnt sind:
Taxonomische Eigenschaften
a) Die Wachstumseigenschaften der vegetativen Zellen in verschiedenen Medien sind in Tabelle I nachfolgend aufgeführt.
b) Ascosporenproduktion
Für alle Arten auf Gorodkwa-Agar und Gipsblock (bei 30° C während 7 Tagen) nicht vorhanden.
40
c) Ballistosporenproduktion
Bei allen Arten auf Malzhefeextrakt-Agar nicht vorhanden.
d) Physiologische Eigenschaften sind in Tabellen nachfolgend aufgeführt.
e) Assimilierung verschiedener Kohlenstoffquellen. Diese ist in der nachfolgenden Tabelle III aufgeführt.
f) Fermentierung von Zuckern. Diese ist in der nachfolgenden Tabelle IV aufgeführt.
Tabelle I
Wachstumseigenschaften vegetativer Zellen in verschiedenen Medien
Medium und Bedingungen
Beobachtung des Wachstums FERM-P 1882
C. butanophila
FERM-P 1883
C. butanolytica
Malzhefeextraktmedium
Pepton 5 g
Hefeextrakt ... 3 g
Malzextrakt ... 3 g
D-Glucose 10 g
Dest. Wasser.. 1000 ml.
(300C, 2 bis 7 Tage)
1. Form
2. Größe
3. Vegetative Reproduktion
4. Häutchen
5. Gasbildung
6. Trübung des Mediums
7. Sedimentbildung
8. Farbe des Mediums
oval oder lang oval
(3—8 μ) · (8 -14 μ)
Knospung
dünnes und glattes
Häutchen, kriechende
Ringbildung
kompaktes Sediment
keine Veränderung
zylindrisch
(2—5 μ) · (7—15 μ)
Knospung
dünnes und glattes
Häutchen, kriechende
Ringbildung
nicht
mäßig
kompaktes und blockartiges Sediment
keine Veränderung
Fortsetzung
Medium und Bedingungen Beobachtung des Wachstums
FERM-P 1882 C. butanophila
FERM-P 1883 C. butanolytica
Malzhefeextrakt-Agar 1. Wachstum reichlich stumpf reichlich Knospung Knospung nicht reichlich
2. Kolonie milchigweiß, dünnes und glattes dünnes Häutchen, nicht
Pepton 5 g a) Form unregelmäßig rund etwas gräulich unregelmäßig rund schweres und Häutchen, kriechende kriechende Ringbildung Blocksediment unregelmäßig rund
Hefeextrakt ... 3 g b) Rand fadenförmig fadenförmig dickes Häutchen Ringbildung keine Veränderung keine Veränderung fadenförmig
Malzextrakt ... 3 g
D-Glucose 10 g
Α.Ε&Γ 15 fi		 c) Oberfläche radial runzelig FERM-P 1911 FERM-P 1908 radial runzelig nicht nicht radial runzelig
Dest. Wasser. . 1000 ml_ d) Form des senk- buckelig C. Spherica C. ellipsis buckelig mäßig etwas buckelig
rechten Schnittes kugelig oval schuppiges und Blocksediment
(25°C. 7 bis 10 Tage) e) Glanz stumpf kompaktes Sediment nicht
0 Farbe milchigweiß, keine Veränderung keine Veränderung keine Veränderung milchigweiß
(Fortsetzung) etwas gräulich reichlich reichlich
Beobachtung des Wachstums
FERM-P 1884 FERM-P 1909 unregelmäßig rund rund FERM-P 1910
1. Form C. alcophila C. splitica fadenförmig glatt T. opalum
2. Größe kurz oval lang oval radial runzelig glatt oval
3. Vegetative Reproduk (2—6 μ) · (5- 8 μ) (5—10 μ) (2- -5 μ) · (3—7 μ) (2 -5 μ) · (5— I 5 μ) kissenförmig erhöht (2—5 μ) · (3—8 μ)
tion Knospung Knospung Knospung Knospung
4. Häutchen nicht glänzend Häutchenbildung
dünnes und glattes schweres und Ringbildung milchigweiß, milchigweiß
5. Gasbildung Häutchen dickes Häutchen etwas gräulich
6. Trübung des Mediums nicht nicht nicht nicht
7. Sedimentbildung mäßig nicht mäßig FERM-P 1886 mäßig
kompaktes und kompaktes Blocksediment T. alcophilum Blocksediment
8. Farbe des Mediums blockartiges Sediment oval keine Veränderung
1. Wachstum keine Veränderung (8—12 μ) · (10—20 μ) (7—14 μ) · (10-20 μ)
2. Kolonie reichlich 3. Vegetative Reproduktion Knospung
a) Form 4. Häutchen
b) Rand unregelmäßig rund
c) Oberfläche fadenförmig
d) Form des senk radial runzelig 5. Gasbildung
rechten Schnittes buckelig 6. Trübung des Mediums
e) Glanz 7. Sedimentbildung
0 Farbe nicht 8. Farbe des Mediums
milchigweiß,
(Fortsetzung) etwas gräulich
Beobachtung des Wachstums
FERM-P 1885
1. Form T. butanophilum
2. Größe oval
Fortsetzung 24 06 FERM-P 1885 708 6 FERM-P 1886 C. butanophila FERM-P 1910
5 Beobachtung des Wachstums T. butanophilum T. alcophilum ja T. opalum
reichlich reichlich ja reichlich
1. Wachstum nein
2. Kolonie rund rund nein unregelmäßig rund
a) Form gezackt gezackt nein gezackt
b) Rand körnig rauh spezielles farnartiges rauh
c) Oberfläche erhöht konvex Mycel flach
d) Form des senkrechten
Schnittes nicht nicht nicht
e) Glanz milchigweiß, milchigweiß, milchigweiß
0 Farbe etwas gräulich etwas gräulich
(Fortsetzung) Beobachtung des Wachstums FERM-P 1882 FERM-P 1883
Medium und Bedingungen C. butanolyticu
1. echtes Mycel ja
Kartoffelagar (Scheibenkultur) 2. Pseudomycel ja
frische Kartoffel... 100 g 3. Chlamydosporen nein
D-Glucose 20 g 4. Blastsporen nein
Agar .. 20 g 5. Arthrosporen nein
Dest. Wasser 1000 ml 6. morphologische spezielles farnartiges
Eigenschaften Mycel
(301C, 3 Tage)
(Fortsetzung)
Beobachtung des Wachstums
1. echtes Mycel
2. Pseudomycel
3. Chlamydosporen
4. Blastsporen
5. Arthrosporen
6. morphologische Eigenschaften
FERM-P 1884 C. alcophila
FERM-P 1911 C. Sphcrica
ja ja
ja ja
nein nein
nein nein
nein nein spe7ielles farnartiges Mycel
FERM-P 1908
C. ellipsis
nein
ja
nein
teilweise ja
nein
FERM-P 1909 C. splitka
ja
ja
nein
nein
teilweise ja
(Fortsetzung)
Beobachtung des Wachstums
1. echtes Mycel ■
2. Pseudomycel
3. Chlamydosporen
4. Blastsporen
5. Arthrosporen
6. morphologische Eigenschaften
FERM-P 1885 T. butanophilum
nein nein nein nein ja
FERM-P 1886
T. alcophilum
nein nein nein nein ja
spezielles farnartiges Mycel
FERM-P 1910 T. opalum
nein nein nein nein ja
reichlich Arthrosporen
Tabelle 11 Physiologische Eigenschaften
FERM-Nummer Name der Species FERM-P 1884 FERM-P 1911
FERM-P IR82 FERM-P 1883 C. alcophila C. spherica
C. butanophila C. butanolytica
Optimale Wachstums
bedingungen 3,0—7,0 3,0—7,0
PH 3,0—7,0 3,0- 7.0 20—35° C 20—36° C
Temperatur 20-35° C 20—35° C
Wachst umsgrenze knappes Wachs knappes Wachs
pH knappes Wachs knappes Wachs tum bei pH 7,8 tum bei pH 7,8
tum bei pH 7,8 tum bei pH 7,8 knappes Wachs knappes Wachs
Temperatur knappes Wachs knappes Wachs tum bei 40° C tumbei42cC
tum bei 40° C tum bei 40° C nicht nicht
Assimilierung von nicht nicht
Kaliumnitrat nicht beobachtet
Spaltung von Arbutin nicht nicht reichliches reichliches
Äthanol als einzige reichliches reichliches Wachstum Wachstum
Kohlenstoffquelle Wachstum Wachstum keine gelb und
Wirkung von Lackmus· keine keine Veränderung Verfestigung
milch Veränderung Veränderung + +
Ureasetest + + nicht nicht
Produktion von nicht nicht
Carotenoidpigment
(Fortsetzung)
FERM-Nummer Name der Species
FERM-P 1908 FERM-P 1909 FERM P 1885 FERM P 1886 FERM-P 1910
C. ellipsis C. splilica T. bulanophilum T. alcophilum T. opalum
Optimale Wachstums 3,0—7,0 3,0—7,0 3,0—7,0 3,0—7,0 3,0—7,0
bedingungen 20 -36° C 20—36" C 20—35° C 20—35°C 20—36° C
pH
Temperatur knappes knappes knappes knappes knappes
Wachstumsgrenze Wachstum Wachstum Wachstum Wachstum Wachstum
PH bei pH 7,8 bei pH 7,8 bei pH 7,8 bei pH 7,8 bei pH 7,8
knappes knappes knappes knappes knappes
Wachstum Wachstum Wachstum Wachstum Wachstum
Temperatur bei 42" C bei 42° C bei 400C bei 400C bei 42° C
nicht nicht nicht nicht nicht
Assimilierung von nicht beobachtet nicht nicht nicht
Kaliumnitrat reichliches reichliches reichliches reichliches reichliches
Spaltung von Arbutin Wachstum Wachstum Wachstum Wachstum Wachstum
Äthanol als einzige keine gelb und keine keine keine
Kohlenstoffquelle Veränderung Verfestigung Veränderung Veränderung Veränderui
Wirkung von Lackmus + + + + +
milch nicht nicht nicht nicht nicht
Ureasetest
Produktion von
Carotenoidpigment
ίο
(Fortsetzung) FERM-Nummer Name der Species FF-RM-P 1884 FERM-P 1911 FERM-P 1908
FERM-P 1882 FERM-P 1883 C. alcophila C. spherica C. ellipsis
C. buüinophila C. butanolytica nicht beobachtet nicht
nicht nicht
Produktion von stärke ± ± ±
ähnlichen Verbindungen ± ± nicht nicht nicht
Vitamin-Erfordernisse nicht nicht
Produktion von 10% 10% 10%
organischer Säure 10% 10%
Wachstumsgrenze in (sek.-) (n-)reichliches (n-)reichliches
NaCl-Lösung (sek.-) (sek.-) reichliches Wachstum Wachstum
Butanol als einzige reichliches reichliches Wachstum
Kohlenstoffquelle Wachstum Wachstum nicht beobachtet beobachtet
nicht nicht
Gelatineverflüssieuns
(Fortsetzung)
Produktion von stärkeähnlichen Verbindungen Vitamin-Erfordernisse Produktion von organischer Säure Wachstumsgrenze in NaCl-Lösung Butanol als einzige Kohlenstoffquelle Gelatineverflüssigung
FERM-Nummer
FERM-P 1909
C. splitica 		Name der Species
FERMi-P 1885
T. butanophilum 		FERM-P 1886
T. alcophilum 		FERM-P 1910
T. opal um
beobachtet nicht nicht nicht
nicht nicht ±
nicht		 nicht
10% 10% 10% 10%
(n-)reichliches
Wachstum
beobachtet		 (sek.-)reichliches
Wachstum
nicht		 (sek.-)reichliches
Wachstum
nicht		 (n-)reichliches
Wachstum
beobachtet
Tabelle III
Assimilierung verschiedener Kohlenstoffquellen
Hefespecies FERM-P 1883 FERM-P 1884 FERM-P 1911 FERM-P 1908
FERM-P 1882 C. butanolytica C. alcophila C. spherica C. ellipsis
C. butanophila
Kohlenstoffquclle + + + +
D-Glucose + + + + +
D-Galactose + — — + -
Saccharose — — — + -
Maltose _ — — + -
Lactose — — - + -
Raffinose — — — + —
Esculin — — — - -
Inulin — — — + -
Dextrin — + —
Melibiose
11 12
(Fortsetzung)
Hefespecies FERM-P 1909 FERM-P 1885 FERM-P 1886 FERM-P 1910 C. splitica T. butanophilum T. alcophilum T. opalum
Kohlenstoffquelle
D-Glucose
D-Galactose
Saccharose
Maltose
Lactose
Raffinose
Esculin
Inulin
Dextrin
Melibiose
(Fortsetzung)
Hefespecies FERM-P 1882 FERM-P 1883 FERM-P 1884 FERM-P 1911 FERM-P 1908 C. butanophila C. butanolytica C. alcophila C. spherica C. ellipsis
D-Arabinose — — —
Lösliche Stärke - -
Trehalose — — —
D-Mannose + + +
a-Methyl-D-glucose — — —
D-Xylose — — —
(Fortsetzung)
Hefespecies FERM-P 1909 FERM-P 1885 FERM-P 1886 FERM-P 1910 C. splitica T. butanophilum T. alcophilum T. opalum
D-Arabinose
Lösliche Stärke
Trehalose
D-Mannose
a-Methyl-D-glucose
D-Xylose
Tabelle IV
Zuckerfermentierung
Zucker Hefespecies
FERM-P 1882 FERM-P 1883 FERM-P 1884 FERM-P 1911 FERM-P 1908 C. butanophila C. butanolytica C. alcophila C. spherica C. ellipsis
D-Glucose — — — + —
D-Galactose _____
Saccharose — - - _ -
Maltose — — - — -
Lactose _____
Raffinose _ _ _ + _
(Fortsetzung) Hefespccics
FERM-P 1909
C. splitica 		FERM-P 1885
T. butanophilum 		FERM-P 1886
T alcophilum 		FERM-P 1910
T. opalum
Zucker I I I I I I I
IiSIII 		-
D-Glucose
D-Galactose
Saccharose
Maltose
Lactose
Raffinose
Sechs Stämme der oben aufgeführten Hefen (FERM-P 1882, 1883, 1884, 1911, 1909 und 1910) bilden keine Ascosporen, Ballistosporen oder Arthrosporen. Ihre vegetativen Zellen sind oval oder zylindrisch mit einigen Variationen in der Größe. Sie reproduzieren sich durch Knospung oder Keimung und bilden echte oder Pseudomycels. Es wird kein Carotinoidpigment gebildet.
Es ist somit angebracht, diese Arten als Candida anzusehen, im Hinblick auf die Beschreibung in »The Yeasts, a Taxonomic Study« von J. L ο d d e r und N. W. J. K reg er—van R ij (1952).
Beim Vergleich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften von FERM-P 1882, 1883 und 1884 (C. butanophila, C. butanolytica und C. alcophila) mit jenen der beschriebenen Arten von Candida ergibt sich, daß sie in den Fermentationseigenschaften und in der Assimilation von Zuckern ähnlich wie C. rugosa sind. Sie unterscheiden sich jedoch wesentlich von C. rugusa hinsichtlich der Äthanolassimilierung, der Wirkung auf Lackmusmilch und hinsichtlich der Abwesenheit langer zylindrischer Zellen.
FERM-P 1911 (C. spherica) ist ähnlich C.solani, C. guilliermoudii und C. molibiosi hinsichtlich der Eigenschaften der Fermentation und Assimilierung von Zuckern. FERM-P 1911 unterscheidet sich aber von diesen beschriebenen Arten hinsichtlich der Lactoseassimilierung. der Wirkung auf Lackmusmilch und der Form der vegetativen Zelle.
FERM-P 1908 (C. ellipsis) ist ähnlich C. rugosa in den Fermentationseigenschaften und der Assimilierung von Zuckern. FERM-P 1908 unterscheidet sich aber von diesen beschriebenen Arten hinsichtlich der Äthanolassimilierung, der Wirkung auf Lackmusmilch und der Form der vegetativen Zelle.
FERM-P 1909 (C. splitica) ist ähnlich C. humicola und C. curvata insofern, als keine Fermentierung von Zuckern erfolgt, und hinsichtlich der Assimilierung von D-Glucose, D-Galactose, Saccharose und Maltose. FERM-P 1909 unterscheidet sich auch von C. humicola hinsichtlich der Äthanolassimilierung und der Morphologie der Pseudomyceln und von C. corvata hinsichtlich der Form der vegetativen Zelle und der Arbutinaufspaltung.
Die drei obengenannten Stämme, FERM-P 1985, 1886 und 1910 wurden auf der folgenden Grundlage als der Gattung Trichosporon angehörig identifiziert. Diese Arten bilden weder Ascosporen noch Ballistosporen. Sie bilden Arthrosporen. Die vegetativen Zellen sind oval und reproduzieren sich durch Knospung. Carotinoidpigment wird nicht gebildet.
FERM-P 1885(T. butanophilum)ähnelt T. sericeum und T. capitatum hinsichtlich der Zuckerfermentierung und der Assimilierung von Glucose und Galactose. FERM-P 1885 unterscheidet sich jedoch von T. sericeum durch die Nitratassimilierung und die Bildung von echtem Mycel auf Kartoffelagar. T. capitatum ist nicht identisch mit ihm hinsichtlich der Äthanolassimilierung und einiger morphologischer Eigenschaften.
FERM-P 1886 (T. alcophilum) ist ähnlich wie T. cutaneum hinsichtlich der Fermentierung und Zuckerassimilierung. Sie sind jedoch nicht identisch hinsichtlich der Assimilierung von Galactose und Äthanol sowie hinsichtlich der Form der vegetativen Zellen.
FERM-P 1910 (T. opalum) ähnelt T. sericeum und T. capitatum hinsichtlich der Zuckerfermentierung und der Assimilierung von D-Glucose und D-Galactose. FERM-P 1910 unterscheidet sich aber von den beschriebenen Hefen hinsichtlich der Morphologie von echtem Mycel.
Aus diesen Gründen wurde geschlossen, daß diese Hefen als neue Arten bezeichnet werden sollten, und wurden, wie oben erwähnt, benannt.
Bei der Bildung von Hefezellen kann einer der Hefestämme in einem Medium gezüchtet werden, das Normalbutanol und/oder Sekundärbutanol als Hauptkohlenstoffquelle, Stickstoffverbindungen, Nährstoffsalze und wachstumsfördernde Materialien enthält. Bezüglich der Zusammensetzung des Kulturmediums ist zu sagen, daß man entweder solches synthetischen oder natürlichen Ursprungs verwenden kann, solange es die obenerwähnten Materialien enthält.
Die Konzentration an Normalbutanol und/oder Sekundärbutanol in dem Medium sollte sorgfältig bestimmt werden. Wenn die Konzentration zu hoch wäre, würde dies zu einer Hemmung des Wachstums der Hefe führen. Außerdem würde dann ein Verlust an Butanolen als Abgas größer. Aus diesem Grund werden die Butanole dem Kulturmedium am besten stufenweise oder kontinuierlich während der Fermentationszeit zugesetzt, um eine geeignete Konzentration aufrechtzuerhalten.
Außer dem Normalbutanol und/oder Sekundärbutanol können zu dem Kulturmedium auch ausnutzbare Kohlenstoffquellen, wie Zucker oder andere Alkohole, zugesetzt werden, um das Wachstum der Hefestämme zu fördern.
Die Stickstoffquelle des Mediums kann beliebig aus stickstoffhaltigen Materialien, die von der Hefe ausgenutzt werden, ausgewählt werden. Gewöhnlich
erhält man gute Resultate, wenn Ammoniak, Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat oder Ammoniumphosphat, als Stickstoffquelle mit einer Konzentration zwischen etwa 0,1 und 4% verwendet werden.
Als andere Bestandteile außer Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können Nährstoffsalze und wachstumsfördernde Materialien zugesetzt werden, die alle oder einige der folgenden Verbindungen einschließen: Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, eisenhaltige Verbindungen, Mangan, Zink und andere Mineralien, Vitamine, Aminosäuren und Nucleotide.
Die Hefen werden unter submersen aeroben Bedingungen während etwa 1 bis 3 Tagen bei einer Temperatur von etwa 20 bis 300C gezüchtet. Der pH-Wert des Kulturmediums wird vorzugsweise zwischen etwa
3 und 7 gehalten. Infolge der Produktion organischer Säuren aus Butanolen und/oder des Verbrauchs von Ammoniumionen in dem Kulturmedium kann der pH-Wert abnehmen. Um den pH-Wert des Mediums in einem erwünschten Bereich zu halten, ist es erforderlich, entweder Calciumcarbonat oder eine Pufferlösung zuzusetzen oder das Medium während des Kulturverlaufs mit einer Ammoniak- oder Alkalilösung zu titrieren.
Wenn die Kultur beendet ist, können die Hefezellen von dem Kulturmedium entweder durch Filtration oder durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Die Zellen werden dann gewaschen und getrocknet.
An Hand der folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.
Beispiel 1
Ein Kulturmedium aus 0,02% (Gewicht je Volumen) KH2PO4, 0,12% (Gewicht je Volumen) K2HPO4, 0,05% (Gewicht/Volumen) MgSO4 · 7H20,0,3% (Gewicht/Volumen) (NRj)2SO4 und 0,3% Hefeextrakt wurde in einer Menge von 50 ml in drei Sakaguchi-Kulturkolben (500 ml) gegeben und in einem Autoklav bei 1200C während 15 Minuten sterilisiert. Nachdem das Medium abgekühlt war, wurde Sekundärbutanol jedem Kolben zugesetzt, um eine Endkonzentration an Sekundärbutanol von 0,5% (Gewicht/Volumen) zu ergeben. Der pH-Wert des Mediums lag bei 6,0 vor und nach der Sterilisierung.
FERM-P 1882 (C butanophila), FERM-P 1883 (C butanolytica) und FERM-P 1884 (C alcophila) wurden einzeln in getrennte Kolben geimpft und unter Schütteln bei 3O0C gezüchtet.
Die Konzentration an Sekundärbutanol in dem Kulturmedium wurde durch Gaschromatographie bestimmt. Innerhalb einer Kulturzeit von 18 Stunden war das Sekundärbutanol in dem Kulturmedium nahezu vollständig verbraucht. Sodann wurde Sekundärbutanol auf 0,5% zugesetzt (Volumen/Volumen). Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt, um eine hohe Dichte der Zellen zu erhalten. Der pH-Wert des Mediums während der Züchtung wurde zwischen
4 und 6 gehalten, indem mit 10%igem Ammoniak titriert wurde. Die Hefezellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeuten an trockenen Zellen betrugen 14,0 g je Liter Brühe für FERM-P1882 (Cbutanophila), 10,0g/l Brühe Tür FERM-P 1883 (C butanolytica) und 12 g/l Brühe für FERM-P1884 (C. alcophila). Die Fortpflanzungsgeschwindigkeit dieser Hefen in den Medien betrug 2,5,2,9 bzw. 3,2 Stunden Verdoppelungszeit. Die Werte der Elementar analyse der Trockenzellen dieser Hefen sind in der Tabelle V aufgeführt.
Beispiel 2
FERM-P 1885 (T. butanophilum) und FERM-P 1886 (T. alcophilum) wurden einzeln in getrennte Kolben geimpft, die das gleiche Medium enthielten, welches im Beispiel 1 verwendet wurde, und die Züchtung erfolgte in ähnlicher Weise. Der Verbrauch
ίο an Sekundärbutanol in dem Medium war vollständig innerhalb von 20 bis 24 Stunden. Sekundärbutanol wurde sechsmal zugesetzt, um bei jeder Zugabe eine Konzentration von 0,5% Butanol (Volumen/Volumen) zu ergeben. Die Zellen wurden abgetrennt, gewasahen und getrocknet. Die Ausbeute an getrockneten Zellen (g/l Brühe) betrug 10,0 für FERM-P 1885 (T. butanophilum) und 8,0 für FERM-P 1886 (T. alcophilum). Die Fortpflanzungsgeschwindigkeiten dieser Hefen betrugen 2,8 bzw. 3,2 Stunden für die Verdoppelungs zeit. Die Werte für die Elementaranalyse der getrock neten Zellen sind in Tabelle V aufgeführt.
Tabelle V
Kohlenstoff Wasserstoff Stiel
FERM-P 1882 46,9 6,5 7,5
C. butanophila
FERM-P 1883 45,3 6,7 5,2
C. butanolytica
FERM-P1884 46,1 6,9 6,7
C. alcophila
FERM-P1885 46,5 6,9 6,7
C. butanophilum
FERM-P 1886 45,0 6,8 6,5
T. alcophilum
Beispiel 3
Zu dem im Beispiel 1 hergestellten Medium wurde Normalbutanol zugesetzt, um eine Endkonzentration von .0,5% (Gewicht/Volumen) zu ergeben.
Sechs Stämme von Candida und drei Stämme von Trichosporon, die in der Tabelle VI aufgeführt sind,
wurden einzeln in diese getrennten Kolben geimpft und unter Schütteln bei 3O0C während 24 Stunden gezüchtet.
Die Hefezellen wurden in gleicher Weise wie im Beispiel 1 abgetrennt und behandelt. Die Ausbeute der Zellen ist in der Tabelle VI gezeigt.
Tabelle VI FERM-Nummer Name der Hefespecies
Ausbeute g/l Brühe
1882 C. butanophila 1,0
1883 C. butanolytica 1,1
1884 C. alcophila 0,9
1911 C. spherica 1,1
1908 C. ellipsis 0,8
1909 C. splitica 0,9
1885 T. butanophilum 1,1
1886 T. alcophilum 1,2
1910 T. opalum 0,7
509 544/359
17
Vergleichsversuch
In ein 30-1-Fermentiergefäß wurden 101 Kulturmedium üblicher Zusammensetzung gegeben und 2 Stunden mit Wasserdampf sterilisiert. Sodann wurde das Kulturmedium mit dem Hefestamm FERM-P1882 (C. butanophila) geimpft und bei 30" C gezüchtet, wobei kontinuierlich 201 je Minute Luft und sek.-Butanol zugeführt wurden und durch 200 Umdrehungen je Minuten gerührt wurde. Es wurde 42 Stunden gezüchtet, während die Luft aus dem Fermentiergerät zusammen mit sek.-Butanol durch eine mit Wasser gefüllte Falle perlte, um entweichendes sek.-Butanol aufzufangen. Die Gesamtmenge an sek.-Butanol, die IO
in das Fermentiergerät eingeführt wurde, betrug 296,5 g.
Die Menge an sek.-Butanol, die aus dem Fermentiergerät entwich, betrug 111,3g und 16,5 g sek.-Butanol blieben in dem Fermentiergerät am Ende der Züchtung. Somit waren 168,7 g sek.-Butanol für das Wachstum der Hefe verbraucht worden.
Die Hefezellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser dreimal gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die so erhaltenen getrockneten Hefezellen wogen 140 g. Die Ausbeute der Hefezellen bzw. Proteinausbeute auf der Grundlage des sek.-Butanolgewichtes, berechnet nach der folgenden Formel, betrug 83%.
Proteinausbeute =
Gewicht der erhaltenen trockenen Hefezellen
Gewicht des assimilierten Butanols
100.
Der gleiche Versuch wurde unter Verwendung von Normalbutanol an Stelle von sek.-Butanol wiederholt. 310 g n-Butanol wurden in das Fermentiergerät eingespeist, und 119 g n-Butanol wurden assimiliert. Die Menge der so erhaltenen getrockneten Hefezellen betrug 100 g. Die Ausbeute lag bei 84%, berechnet auf das n-Butanolgewicht.
Die gleichen Versuche wurden auch für die übrigen in der nachfolgenden Tabelle aufgerührten Hefestämme durchgeführt, wobei im Falle der vier letzten Hefestämme lediglich n-Butanol verwendet wurde. Die Ausbeuten sind alle in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.
Gemäß dem Stand der Technik wurden 17 g trockene Hefezellen bzw. Protein aus 100 ml (etwa 78 g) n-Paraffin erhalten. Diese Ausbeute entspricht etwa 22%, berechnet auf das n-Parafnngewicht. Daraus ist ersichtlich, daß nach dem vorliegenden Verfahren Proteinausbeuten erzielt werden, die dreibis viermal so groß sind wie nach dem Stand der Technik.
Hefestämme Proteinausbeute n-Butanol
sek.-Butanol 84
C. butanophila 83
FERM-P1882 72
C. butanolytica 75
FERM-P 1883 75
C. alcophila 72
FERM-P 1884 82
T. butanophilum 78
FERM-P 1885 80
T. alcophilum 80
FERM-P 1886 78
C. ellipsis —
FERM-P 1908 76
C. splitica —
FERM-P 1909 72
T. opalum —
FERM-P 1910 75
C. spherica —
FERM-P 1911
Stand der Technik Cll-18-n-Paraffine
-22%

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zum submersen, aeroben Züchten von Hefezellen während etwa 1 bis 3 Tagen bei einer Temperatur von etwa 20 bis 3O0C, einem pH-Wert des Kulturmediums vorzugsweise zwischen etwa 3 und 7 und dem Einsatz von Butanol als Hauptkohlenstoffquelle, dadurch gekennzeichnet, daß man als Normalbutanol oder Sekundärbutanol assimilierenden Hefestamm Candida butanolphila nov. sp. FERM-P 1882, Candida butanolytica nov. spez. FERM-P 1883, Candida alcophila nov. sp. FERM-P 1884, Trichosporon butanophjlum nov. sp. FERM-P 1885 oder Trichosporon alcophilum nov. sp. FERM-P1886 oder als Normalbutanol assimilierenden Hefestamm Candida ellipsis nov. sp. FERM-P 1908, Candida splitica nov. sp. FERM-P1909, Trichosporon opalum nov. sp. FERM-P 1910 oder Candida spherica nov. sp. FERM-P 1911 einsetzt.
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