DE2245545B2 - Verfahren zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in Proteinmaterialien unter Verwendung eines neuen Hefestammes - Google Patents

Description

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bis 993, Oberem rait dem Unterschied, daß bei Züch- H₈SO₄., 0,172 g

tung auf GIukose/Hefeextrakt/Peptonagar oder bei Thiaminhydrochlorid 220/mg

Delmau-Plattenkulturen auf Maismehlagar (Lodder, Leitungswasser , .zur Aufteilung auf 11

2. Auflage 1970, S. 992) die Kolonien cremefarben

und glatt sind und eine matte Oberfiäcbe ohne Faltung 5 Nach einer Anfahrzeit von etwa 16 Stunden, wäh-

haben und kein Pseudomycelium gebildet wird. rend der die Kultur eine Konzentration von 16 g/l

Dies steht im Gegensatz zu der Bildung von Pseudo- erreichte, wurde mit dem kontinuierlichen Betrieb bei

mycelium bei typischen Stämmen von Candida lipo- einer Vsrdünnungsrate von 0,16 V/V/Std., einer Tem-

lytica, z. B. beim Stamm C.B.S. 2078 und beim peratur von 32 ⁰C und einem pH-Wert vt,a 5,5 begon-Stamm C.M.I. 93 743. _{10 nen>} rj_er pH-Wert wurde durch Zusatz von Ammoniak

Die physiologischen Eigenschaften sind mit denen das gleichzeitig als Stickstoffquelle dient, nach Bedarf

von C. lipolytica, Stamm C.B.S. Nr. 2078 und Stamm aufrechterhalten. Der Kohlenstoffwasser wurde in

C.M.I. 93743, die bereits erwähnt wurden, identisch. einer Menge von 13 1/Std. und das wäßrige Nährme-

*) Morphologische Beobachtungen bei Kultivierung in £^{ium in} *?" ^Menf ^v?ⁿ, cn^K;.^mf (-!^' ^Daj

Glukose/Hefeextrakt/Pepton/Wasser ^l5 kulturmedium wurde mit 1,50 V/V/Min belüftet, und

der Druck im Fermenter wurde bei 2,50 kg/cm² ab-

Bei Züchtung für 3 Tage bei 25 ⁰C in Glukose/Hefe- solut gehalten.

(Sxtrakt/Pepton/Wasser sind die Zellen kurz oval bis Der Ausbeutefaktor betrug 0,88 (Ausbeutefaktor =--

länglich oval, und ihre Größe beträgt 3- bis 6mal 5 bis Gewicht des Hefeprodukts/Gewicht des von der er-

11 μ. Selten werden einige langgestreckte Zellen beob- ao zeugten Hefe verbrauchten Kohlenwasserstoffs). Das

achtet, die eine Länge bis etwa 20 μ haben. Eine Pelli- Kulturmedium enthielt pro Liter 23,6 g Zellen (Trok-

cula wird nicht gebildet. kengewicht).

b) Bildung von Ascosporen oder Ballistosporen Der Versuch wurde 1000 Stunden fortgesetzt. Wäh-• * rend dieser Zeit wurden zur Untersuchung der Kultur Ascosporen oder Ballistosporen werden nicht ge- a₅ auf Veränderungen des Stammes Proben des Kulturbildet, wenn der Stamm auf den Standard-Sporula- mediums in Absenden von 24 Stunden entnommen, tionsmedien gezüchtet wird. Die Proben wurden auf Sabourand-Dextroseagar und

C) Assimilierung von Nitrat und Zersetzung von ^MalzextraH^ta8^a' ^^f^- D^ Platten wurden Harnstoff £^e bebrütet. Die gebildeten Kolonien

30 waren cremefarben und glatt und hatten eine matte

Der Stamm assimiliert Kaliumnitrat nicht. Harnstoff Oberfläche und keine Faltung.

wird zersetzt. Während der gesamten Dauer der Fermentation

wurden keine Anzeichen einer Änderung der Kultur d) Verwertung von Zuckern _{bei der} p_Iattierung festgestellt. Bei der Untersuchung

Der Stamm fermentiert Zucker nicht, aber die fol- 35 unter dem Mikroskop wurde kein Pseudomycelium Senden Verbindungen werden assimiliert: Glukose, beobachtet.

Äthanol, Glycerin, Erythrit und Bernsteinsäure. Der Rohproteingehalt wurde in regelmäßigen Ab-

Die folgenden Verbindungen werden nicht assimi- ständen nach der Methode ermittelt, die in »Fertiliser liert: Galactose, Sorbose, d-Ribose, L-Rhamnose, and Feeding Stuffs Regulation«, Statutory Instrument Saccharose, Maltose, Cellobiose, Trehalose, Laktose, 40 Nr. 218, 1968, beschrieben ist.
Mellibiose, Raffinose, Melezitose, Inulin, lösliche Die Hefe hatte einen Rohproteingehalt im Bereich

Stärke, d-Xylose, L-Arabinose, d-Arabinose, Ribit, von 63 bis 66 Gewichtsprozent, bezogen auf das Galactit, d-Mannit, d-Glucit, a-Methyl-d-glukosid, Trockengewicht der Hefe.
Salicin und Inosit. Gelatine wird verflüssigt und Lak- ., . . . ,, ,

tnusmüchpeptonisiert. 45 Vergle.chs-Versuch

Das Wachstum auf vitaminfreien Medien ist Zum Vergleich wurde ein bekannter, Kohlenwasser-

$chwach. Es wird durch die Anwesenheit von Thiamin stoffe verwertender Stamm von Candida lipolytica, »ngeregt. nämlich der Stamm C.M.I. Nr. 93743, unter den

gleichen Bedingungen gezüchtet, die vorstehend für

Beispiel 1 5° den neuen Stamm C.B.S. Nr. 6331 beschrieben wurden.

_,,.,,.,. „ ^_T Nach Ablauf der 16stündigen Anfahrperiode betrug

Candida lipolytica, Stamm C.B.S. Nr. 6331, wurde _{die Ze}ii_konZentration etwa 1,5 g/l. Auf Grund der kontinuierlich unter aseptischen Bedingungen in einem „ringen Wachstumsgeschwindigkeit wurde die Anfahrinit Rührer versehenen, belüfteten Druckgefäß mit _xnt verlängert, bis eine Zellkonzentration von 16 g/l •inem Arbeitsvolumen von 1800 1 gezüchtet. Als erreicht war (nach etwa 40 Stunden). Der kontinuier-Kohlenstoffquelle diente ein Gemisch von im Kerosin- _{liche Betrieb wurde} ^ _einer Verdünnungsrate von tereich siedenden η-Paraffinen mit lObis 13 C-Atomen _{0 ]5 Y}/_Y/Std, aufgenommen, wobei die Kultur wegim Molekül, die durch Behandlung einer Erdölfraktion „_ewaschen wurde. Es war nicht möglich, stetigen mit einem Molekularsieb erhalten worden waren. Das _{Bctrieb zu erre}j_chen, da die Wachstumsgeschwindigwäßrige Nährmedium hatte folgende Zusammen- _6o j^ _{zu n}j_ecjrig war.
Setzung: Stationärer Betrieb wurde bei einer niedrigeren Ver-

H₈PO₄ 1,594 g dünnungsrate von 0,07 V/V/Std. bei Anwendung eines

KCl 0,916 g Überdrucks von 1,5 kg/cm* absolut erreicht. Der Roh-

MgSO₄ · 7 H₁O 0,521 g proteingehalt des Hefeprodukts betrug etwa 54 Ge-

MnSO₄ · 4 H₁O 0,035 g 6_S wichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht der

FeSO₄ · 7 H₁0 0,052 g Hefe. Die plattierten Kolonien waren cremefarben,

ZnSO₄ · 7 H₁O 0,153 g faltig, rauhhaarig, matt und grob gefaltet. Die mikro-

CuSO₄ · 7 H₁O 4,36 · 10~* g skopische Untersuchung ergab reichliche Bildung von

Pseudomyceliura. Septatmycelium wurde ebenfalls ge- wurde mechanisch geröhrt und nut 0,75 V/V/Min,

funden. Der Ausbeutefaktor betrug 0,58. belüftet, Der Druck im Fermenter wurde bei 1,5 kg/cm"

ρ . ... absolut gehalten.

α e j sp t e ι ι _Etwa 240 stunden nach der ursprünglichen impfung

Candida h'polytica, Stamm C.B.S. 6331, wurde unter 5 mit der Kulturhefe wurde ein Inoculum, das fünf

den gleichen Bedingungen und bei der gleichen Ver- Bakterien der Gattungen Acinetobacter, Escherichia,

dünnungsrate von 0,07 V/V/Std. und bei dem gleichen Paracolobactrum und Pseudomonas enthielt, dem

Überdruck von 1,5 kg/cm¹ absolut wie beim Stamm Kulturmedium im Fermenter zugesetzt Bakterien-·

C.M.I. 93743 von Candida lipolytica gezüchtet, dessen zählungen, die in Abständen während der folgenden

Kultivierung vorstehend rum Vergleich auschließend 10 180 Stunden an Proben des Kulturmediums vorge-

an Beispiel 1 (Versuch) beschrieben wurde. Der Aus- nommen wurden, zeigten, daß die Zahl der vorhan-

beutefaktor betrug 0,73 und der Rohproteingehalt denen lebensfähigen Bakterienzellen zwischen 300000

etwa 59 Gewichtsprozent bezogen auf das Trocken- und 2500000/ml Kulturmedium variierte,
gewicht der Hefe. Nach einer Kultivierungsdauer von 330 bis 402

15 Stunden betrug die Zelldichte der Hefe (Candida üpo-

^BeisP^{iel 3} lytica, Stamm C.B.S. 6331) 23,5 g/l und der Ausbeute-

Candida lipolytica, Stamm C.B.S. 6331, wurde in faktor 0,99. Das Hefeprodukt hatte einen Rohprotein-

ein wäßriges Nähnnedium und einen als Quelle von gehalt von 59 Gewichtsprozent bezogen auf das

verwertbarem Kohlenstoff dienenden Kohlenwasser- Trockengewicht der ganzen Zellen,
stoff geimpft, die in einem mit Rührer versehenen, ao Zwischen der 520. und 6SO. Stunde des Versuclis

belüfteten Druckgefäß mit einem Arbeitsvolumen von wurde der pH-Wert des Kulturmediums von 4,5 auf

55 1 enthalten waren. Der Kohlenwasserstoff bestand 4,8 erhöht. Bakterienzählungen, die am Kulturmedium

aus einem Gemisch von im Gasölbereich siedenden zwischen der 800. und 1200. Betriebsstunde vorge-

n-Paraffinen mit 11 bis 18, hauptsächlich 14 bis 17 nommen wurden, ergaben etwa 10* bis 3-10⁹ Zellen/ml.

C-Atomen im Molekül. Dieses Gemisch war durch 35 Die Zahl der während der gleichen Zeit vorhandenen

eine Molekularsiebbehandlung eines Gasöls aus lirdöl Zelien von Candida lipolytica lag in der gleichen

erhalten worden. Das wäßrige Nährmedium hatte die Größenordnung wie die Zahlen der Eakterienzellen.
folgende Zusammensetzung: Zwischen der 1122. bis 1218. Betriebsstunde betrug

it pQ 2 acc das Gewicht der Trockenzellen der Hefe 21,3 g/l und

£³gQ⁴ q'₉6<j 30 der Ausbeutefaktor 0,96. Der Rohproteingehalt der

M²BSO -7 HO 0470 e ^^{efe betru}8 ^{etwa 59} Gewichtsprozent, bezogen auf das

ZnSO*· 7 H O 0138 e Trockengewicht der ganzen Zellen.

FeSO*· 7 H*O 0047 e ^Nac* ^{emer Betr}'^{ebsdauer von 121}^ Stunden wurde

MnSO · 4 H O 0041 e ^der PH-Wert weiter auf 5,0 erhöht, worauf der Betrieb

(NH )*SO * 0500 ε ^{35 des} F^ermenters unstetig wurde und schwierig zu regu-

Γιι<;η s*H η ri'di 1 ma Heren war. Gleichzeitig schwankte der Ausbeutefaktor

ThTam'nhydiochlorid \ \ \ \ \ \ \ \ \ VloT mg |»^{Γ d}>^e JeTe %τ&Ο*η Zeit stieg die Bakterienzahl,

Leitungswasser zur Auffüllung auf 11 ^bis «^{e die} _n ^Zahl .^d" Hefezdlen ubcnüeg.

⁶ - Dieses Seispiel veranschaulicht die zufnedenstel-

Nach einer Periode des Chargenwachstums wurde 40 lende kontinuierliche Durchführung einer Fermenta-

kontinuierlicher Betrieb bei einer Verdünnungsrate tion zur Herstellung von Hefe als Biomasse unter

von 0,14 bis 0,15 V/V/Std. bei einer Temperatur von Verwendung des neuen Stamms Candida lipolytica

12°C und einem pH-Wert von 4,5, der durch Zusatz C.B.S. 6331, in Gegenwart von in erheblicher Menge

von Ammoniak, das als weitere Stickstoffquelle dient, vorhandenen verunreinigenden Bakterien. Es zeigt

nach Bedarf aufrechterhalten wurde, aufgenommen. 45 ferner, daß die Großherstellung von Hefe als Biomasse

Der Kohlenwasserstoff wurde in einer Menge von unbefriedigend ist, wenn die Fermentation unter nicht

220,5 ml/Std. und das wäßrige Nährmediuni in einer aseptischen Bedingungen bei pH-Werten von etwa 5

Menge von 7,42 1/Std. zugeführt. Das Kulturmedium oder höher durchgeführt wird.

Claims (2)

1 2 ganzen Zellen, ist durch Züchtung des neuen Stammes Patentansprüche; auf den bevorzugten η-Paraffinen im Kerosinsiede- bereich erzielbftr,

1. Verfahren zur Umwandlung von Kohlen- Produktionsgeschwindigkeiten von etwa 5 g pro Wasserstoffen in Proteinmaterialien, wobei man eine 5 Liter und Stunde bei einem Minimum von etwa 2,5 g Candida-Hefe, die geradkettige Kohlenwasserstoffe pro Liter und Stunde sind durch Verwendung des verwertet, in Gegenwart eines geradkettigen Koh- neuen Stammes erreichbar. Der Stamm hat einen lenwasserstoffs mit wenigstens 10 Kohlenstoff- hoben Ausbeutefaktor von etwa 1. Der Ausbeuteatomen im Molekül, eines wäßrigen Nährmediums faktor ist das Verhältnis des Gewichts der erzeugten und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases io Hefe zum Gewicht des von der Hefe verbrauchten züchtet, dadurch gekennzeichnet, daß Kohlenwasserstoffs. Der Stamm hat eine hohe Wachman Candida lipolytica C.B.S. Nr. 6331 verwendet. stumsgeschwindigkeit, insbesondere auf den bevor-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- zugten Kohlenwasserstoffen, so daß mit verhältniszeichnet, daß die Züchtung unter nicht aseptischen mäßig hohen Verdünnungsraten gearbeitet werden Arbeitsbedingungen bei einem pH-Wert im Bereich »5 kann. Beispielsweise betragen die Wachstumgsgevon 4 bis 4,8 durchgeführt wird. schwindigkeiten (Teilungszeiten) weniger als 4 Stunden. Dies ergibt einen Wert für Dmax vor mehr als 0,15 Std.-¹. Er kann mit großtechnisch annehmbaren

Wachstumsgeschwindigkeiten und Ausbeuten unter

ao nicht aseptischen Bedingungen in Gegenwart verunreinigender Bakterien kultiviert werden. Bei Kultivie-

Die Erfindung befrifft ein Verfahren zur Umwand- rung in einem Druckgefäß unter erhöhtem Druck lung von Kohlenwasserstoffen in Proteinmaterialien, beispielsweise im Bereich von 1,5 bis 5,0 kg/cm² vorwobei man eine Candida-Hefe, die geradkettige Koh- zugsweise unter aseptischen Arbeitsbedingungen zeigt lenwasserstoffe verwertet, in Gegenwart eines gerad- as der Stamm einen deutlichen Anstieg des Ausbeutekettigen Kohlenwasserstoffs mit wenigstens IO Kohlen- faktors. Dies hat einen großen und nützlichen Einfluß Stoffatomen im Molekül, eines wäßrigen Nährmediums auf die Gsamtwirtschaftlichkeit des Verfahrens, da der und eines freien Sauerstoffs enthaltenden Gases züchtet. Ausbeutefaktor ein Maß des V/irkungsgrades ist, mit

In den letzten Jahren wurde ein Anzahl von Ver- dem die assimilierbaren Kohlenwasserstoffe in Zellen fahren zur Herstellung von einzelligem Protein durch 30 des Mikroorganismus umgewandelt werden.
Kultivieren von Candida-Hefen auf Kohlenwasser- Die Kultivierung kann nach beliebigen bekannten

stoffsubstr^ten in Gegenwart eines wäßrigen Nähr- Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugt werden mediums und eines freien Sauerstoff enthaltenden Temperaturen im Bereich von 27 bis 33 ⁰C und pH-Gases vorgeschlagen. Die vorgeschlagenen Verfahren Werte im Bereich von 4,0 bis 5,5. Besonders geeignet können chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt 35 ist die Kultivierung in einem mit Rührer versehenen, werden. Zahlreiche Hefestämme, die Kohlenwasser- belüfteten Druckgefäß. Bei Anwendung von Überstoffe assimilieren, sind als geeignet für die Verwen- druck kann dieser im Bereich bis 5 kg/cm² absolut dung bei solchen Verfahren genannt worden. liegen. Es ist ein weiteres Merkmal des neuen Stammes,

Die Anmelderin macht einen neuen Candida-Hefe- daß hohe Wachstumsgeschwindigkeiten über weite stamm verfügbar, der für die Verwendung bei kon- 40 Bereiche von Temperaturen und pH-Werten, beispielstinuierlichen großtechnischen Verfahren det vor- weise in einem pH-Bereich von 3 bis 5,7 und in einem stehend genannten Art besonders gut geeignet ist. Der Temperaturbereich von 20 bis 35 °C aufrechterhalten neue Stamm bleibt über lange Zeiten kontinuierlicher werden können. Dies erleichtert bei nicht aseptischem Züchtung stabil, und die erzeugte Hefe hat einen hohen Betrieb die Wahl d<*r Bedingungen des pH-Wertes und Gehalt an Rohprotein. 45 der Temperatur, die das Verschwinden von verunreini-

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Ver- genden Mikroben oder zumindest eine Verminderung fahren zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in der Verunreinigung auf Werte bewirken, die die Er-Proteinmaterialien, wobei man eine Candida-Hefe, die zeugung der Hefe als Biomasse nicht wesentlich beeingeradkettige Kohlenwasserstoffe verwertet, in Gegen- träcruigen. Beispielsweise kann eine Verunreinigung wart eines geradkettigen Kohlenwasserstoffs mit we- 50 durch Bakterien durch Arbeiten bei einem pH-Wert nigstens 10 Kohlenstoffatcmen im Molekül, eines im Bereich von 4 bis 4,8 unterdrückt werden, wobei wäßrigen Nährmediums und eines freien Sauerstoff die Temperatur zweckmäßig im Bereich von etwa 27 enthaltenden Gases züchtet, und das dadurch gekenn- bis 33⁰C liegt.

zeichnet ist, daß man Candida lipolytica C.B.S. Der neue Stamm ist ein Mutant, der aus einem

Nr. 6331 verwendet. 55 Hefewildstamm erzeugt worden ist, der von der An-

Bevorzugt als Kohlenwasserstoffe werden n-Paraf- melderin isoliert und nach den taxonomischen Kritefine, die aus Erdölfraktionen im Leuchtpetroleum- rien von Lodder als Candida lipolytica identifiziert oder Gasölsiedebereich gewonnen werden. Bei diesen worden ist. Der neue Stamm wurde beim Centraal-Kohlenwasserstoffen handelt es sich um η-Paraffine, bureau Voor Schimmelcultures, Baarn, Holland, wo die im Gasölbereich sieden und 11 bis 23, hauptsäch- 60 er die C.B.S.-Nummer 6331 erhielt, hinterlegt,
lieh 14 bis 21 C-Atome im Molekül enthalten, und um Außer den bereits genannten Merkmalen hat der

η-Paraffine, die im Kerosinbereich sieden und 10 bis neue Stamm die folgenden Charakteristiken:
13 C-Atome im Molekül enthalten. Besonders gut Die morphologischen Eigenschaften des neuen

geeignet sind geradkettige Kohlenwasserstoffe, die aus Stammes sind die gleichen wie bei Candida lipolytica Erdölfraktionen durch Behandlung mit Molekular- 65 C.B.S. Nr. 2078 und C.M.I. 93743. Diese Eigensieben erhalten werden. schäften stimmen mit der Standardbeschreibung von

Ein Rohproteingehalt im Bereich von 63 bis 65 Ge- C. lipolytica var lipolytica durch J. Lodder in »The Wichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht der Yeasts. A taxonomic study«, 2. Auflage 1970, S. 991