DE1442263C

DE1442263C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von alpha-Ketoglutarsäure und L-Glutaminsäure

Info

Publication number: DE1442263C
Authority: DE
Inventors: Katsunobu; Kimura Kazuo; Machida; Yamaguchi Ken Tokio; Tanaka (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Publication date: 1972-02-03

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von «-Ketoglutarsäure und !.-Glutaminsäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter in n-Paraffine mit Π bis 18 Kohlenstoffatomen als Hauptkohlenstoffquelle, Stickstoffsubstanzen, anorganische Salze und Wachstumsfaktoren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen pH-Werten. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter, Arthrobacter simplex ίο ATCC 15799, Arthrobacter paraffineus ATCC 15590, Arthrobacter paraffineus ATCC 19064 oder ATCC 19065 einsetzt.

Spezifisch wird das Wachstum der Mikroorganismen und die Ausbeute an den gewünschten Produkten äußerst beschleunigt, wenn ein Kulturmedium verwendet wird, das als Wachstumsfaktoren mindestens eine der folgenden Substanzen Vitamin B₁ (Thiamin), Vitamin B₁₂, p-Aminobenzoesäure, Vitamin H (Biotin), deren Derivate oder eng verwandte Verbindungen und in bezug auf die anorganischen Salze eine hohe Konzentration an Eisenionen enthält.

Darüber hinaus wird durch die Anwesenheit von Calciumcarbonat im Fermentierungsmedium ein wirksamer und erheblicher Anstieg der Anhäufung an «-Ketoglutarsäure erreicht. Unter Verwendung geeigneter Kulturbedingungen beträgt die Menge an angesammelter «-Ketoglutarsäure mehr als 70 g/l, was einer Ausbeute von etwa 70% hinsichtlich der verbrauchten Menge an η-Paraffin entspricht.

Auf Grund des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt sich eine Fermentierungsausbeute von gleichzeitig «-Ketoglutarsäure und L-Glutaminsäure, die — verglichen mit üblichen «-Ketoglutarsäure- und L-GIutaminsäure-Fermentierungsverfahren (»J. Am. Chem. Soc«, 74, 1952, S. 5142 ff., und französische Patentschrift 1 229 336), bei denen zudem im Gegensatz zu den im vorliegenden Verfahren zum Einsatz kommenden wohlfeilen Kohlenwasserstoffen Kohlehydrate als Ausgangsmaterial verwendet werden — bemerkenswert hoch ist. Dies dürfte darauf zurückzuführen sein, daß das erfindungsgemäß verwendete Kohlenwasserstoffaiisgangsmaterial einen hohen Kohlenstoffgehalt je Volumeinheit hat, die die Kohlenstoffstruktur des Produktes ergibt, verglichen mit den üblichen Kohlehydratausgangsmaterialien. Darüber hinaus ist die Luftoxydationsreaktion bei dem erfindungsgemäß angewandten Mikroorganismen äußerst wirksam.

Wenn eine überwiegende L-GIutaminsäurebildung durch Überführung von «-Ketoglutarsäure, die das Hauptprodukt der vorstehend aufgeführten Mikroorganismen-Stämme darstellt, erzielt werden soll, können die bei der Verwendung von Sacchariden als Ausgangsmaterial zur Herstellung von l.-Glutaminsäure bekannten Maßnahmen, nämlich dem Fermentierungsmedium bei einem pH von 6 bis 9 Ammoniumionen zuzugeben, angewandt werden. Es können so bis 50% der sonst gebildeten λ-Ketoglutarsäure als L-Glutaminsäure erhalten werden.

Jedoch besitzen die genannten zur Herstellung von «-Ketoglutarsäure unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Ausgangsmaterial geeigneten Mikroorganismen eine Oxydationskapazität, die sich von den industriell zur Herstellung von L-GIutaminsäure verwendeten Mikroorganismen unterscheidet. Infolgedessen besteht eine Neigung, daß die erzeugte L-Glutaminsäure wieder zu «-Ketoglutarsäure oxydiert wird.

Durch geeignete Hemmung der Zersetzung von L-Glutaminsäure und geeignete Zufuhr einer wesentlichen Quelle für den Aminorest zu dem Medium, kann aber die sonst gebildete «-Ketoglutarsäure zu mehr als 90% als i.-Glutaminsäure erhalten werden.

Insbesondere werden die vorstehenden Ergebnisse mit dem erfindungsgemäß zum Einsatz kommenden Mikroorganismen erhalten, wenn nach einer besonderen Ausführungsform die Züchtung in einem Fermentierungsmedium ausgeführt wird, das einen primären oder sekundären einwertigen Alkohol mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, Benzoesäure, Glycerin, einen Zuckeralkohol, beispielsweise Sorbit, Mannit od. dgl., Sulfanilsäure, oder Mischungen davon enthält.

Die folgenden Versuche dienen der Erläuterung der Erfindung. Falls nicht anders angegeben, sind die angegebenen Prozentsätze Gewichts/Volumprozent.

Die Versuche werden unter Verwendung der folgenden Bakterienstämme ausgeführt:

Arthrobacter simplex ATCC Nr. 15799, Arthrobacter paraffineus ATCC Nr. 15590.

Die vorstehend aufgeführten Stämme wurden als Impfbakterien verwendet, und jeder wurde unter Schütteln in einem Kulturmedium kultiviert, welches 1,0% Kerosin, 0,2% Hefeextrakt, 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton und 0,5% NaCl enthielt, wobei bei einem pH-Wert von 7,2 bei einer Temperatur von 28°C in einer Kammer von konstanter Temperatur während 24 Stunden gearbeitet wurde. 2 ml von jeder dieser Kulturen wurde im FermentierungsmecTi'um verwendet. Die Zusammensetzung der Fermentierungsmedien war folgende:

a) 5% n-Paraffin+), 0,2% KH.,PO₄, 0,1% MgSO₁ · 7 H₂O, 0,005% MnSO₄ · 4 H,O, 2,0% NH₁NO₃, 5γβ Vitamin B₁, O,lmy/I Vitamin B₁₂, 10 γ/1 p-Aminobenzoesäure, 2γ/\ Vitamin H, 0,005% FeSO₄-7 H..O, 0,01% Maisciuellwasser, 3,0% CaCO₃.

b) 5,0% n-Paraffin+), 0,2% KH-PO₁,0,1 % MgSO₁ · 7 H₂O, 0,001% MnSO₁ · 4 H.,0, 2,0% NH₁NO₃, 0,001% FeSO₁ · 7 H₂O, 0,01 % Maisquellwasser, 2,0% CaCO₃.

+ ) η-Paraffin: Mischung mit einem Gehalt 95" υ Cn-Ci«- n-Paraffinen.

Die Kultur wurde bei 28 C in einem 500-ml-Sakaguchi-Kolben durchgeführt, wobei jeder 20 ml der vorstehend aufgeführten Fermentierung.smedien enthielt. Die Kultivierung wurde während 4 Tagen unter aerobem Schütteln ausgeführt.

Vergleichsergebnisse des Wachstums und der Menge an erzeugter «-Ketoglutarsäure und i.-Glutaminsäure bei der Durchführung der vorstehenden Fermentierung sind in Tabelle I zusammengefaßt.

	15799 Nr. 15590 ....	Tabelle I	b)	x-Ketüglularsüure a)g/d! b)g.'dl	1,0 1,5	ι -Glutaminsäure a) g/dl b) g/dl	0,1 0,2
Angewandter Stamm		H- 1-	1,5 2,5		0,2 0,4
Arthrobacter simplex ATCC Nr. Arthrobacter paraffineus ATCC	Wachstum a) j
	ι ι ι ι ι- I- H ■ ι-

Wie aus Tabelle I ersichtlich, wird bei Vorhandensein von Vitaminen und anorganischen Salzen, insbesondere Eisenionen, in entsprechenden Konzentrationen als Bestandteile des Kulturmediums das Wachstum der Bakterien und die Erzeugung von ίΥ-Ketoglutarsäure und L-Glutaminsäure bemerkenswert erhöht. Weiterhin ist ersichtlich, daß erhebliche Mengen an «-Ketoglutarsäure neben L-Glutaminsäure aus η-Paraffinen durch Verwendung der genannten Mikroorganismen des Genus Arthrobacter erhalten werden.

Die Überführung der Fermentierung zur überwiegenden Λ-Ketoglutarsäurebildung in eine Fermentierung zur überwiegenden L-Glutaminsäurebildung unter Verwendung der genannten Arthrobacter-Stämme ist in den folgenden Versuchen dargestellt.

Zu diesem Zweck ist es notwendig, eine Reaktion einzuführen, die die Aminogruppe der L-Glutaminsäure aus ^-Ketoglutarsäure ergibt, während gleichzeitig die Zersetzung der erhaltenen L-Glutaminsäure gehemmt wird, um bei der Fermentierung hauptsächlich L-Glutaminsäure zu erzeugen. .

Infolgedessen wurden Ammoniumionen, die wesentlich als Amingruppenquelle bei der Synthese von L-Glutaminsäure sind, kontinuierlich in das Fermentierungsmedium zugeführt und der pH-Wert desselben bei 7,0 bis 8,2 gehalten. Dieser pH-Bereich ist optimal für die Herstellung von L-Glutaminsäure.

Die pH-Wert-Einstellung des Fermentierungsmediums und die Zufuhr von Ammoniumionen wurden durch Zugabe von entweder einer wäßrigen Lösung von Harnstoff, Ammoniakwasser oder einer wäßrigen Ammoniumcarbonatlösung erreicht. Die Züchtung war die gleiche, wie sie vorstehend in Verbindung mit Tabelle I beschrieben wurde. Als Fermentierungsmedium wurde das vorstehend unter a) angegebene verwendet. -

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

	Λ-Ketoglutar-	L-Glutamin
	säure	säure
	(g/dl)	(g/dl)
Arthrobacter simplex
ATCC Nr. 15799 ...	1.0	0,8
Arthrobacter paraffineus
ATCC Nr. 15590] ...	1,2	1,0

Wie aus Tabelle Il ersichtlich, ist die Menge an L-Glutaminsäure gesteigert, während diejenige an Λ-Ketoglutarsäure gesenkt ist, wenn die vorstehend aufgeführte pH-Einregelung und die Zufuhr von Ammoniumionen in das Fermentierungsmedium angewandt werden. Es ergibt sich daraus, daß die Zufuhr von Ammoniumionen und die beschriebene pH-Einstellung wesentlich sind, um eine hohe Menge an L-Glutaminsäure zu erhalten.

Es wurde jedoch festgestellt, daß große Mengen an λ-Ketoglutarsäure dennoch angehäuft wurden und daß die L-Glutaminsäure eine Neigung zeigte, während der letzten Stufen der Züchtung Zersetzung zu erleiden. Um dieses Problem zu lösen, werden dem Fermentierungsmedium, wie bereits auch schon vorstehend ausgeführt, die gegebenenfalls zur Steigerung der Ausbeute an L-Glutaminsäure durch Umwandlung von \-Ketoglutarsaure zuzusetzenden Substanzen, aliphatische Alkohole, d. h. die. Zuckeralkohole, Glycerin, primäre oder sekundäre einwertige Alkohole mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, Benzoesäure, Sulfanilsäure und Mischungen derartiger Substanzen, eingesetzt. Die Zuckeralkohole sind bekannt und umfassen Verbindungen wie Sorbit, Mannit, Galactit u. dgl. Zu den primären oder sekundären einwertigen Alkoholen, die verwendet werden können, gehören z. B. l-Bulanol, 2-Butanol, 2-Methyl-l-propanol, I-Pentanol, 2-Pentanol, 1-Hexanol, 2-Hexanol, 1-Heptanol, 2-Heptanol, 1-Octanol, 2-Octanol, 1-Dodecanol u. dgl., d. h. die primären und sekundären einwertigen Alkohole mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen. Diese Substanzen können zu dem Fermentierungsmedium in einer Menge von 0,01 bis 2,0 Gewichtsprozent zugegeben werden.

Es. kann entweder ein einziges n-Paraflin mit Il bis 18 Kohlenstoffatomen oder ein Gemisch von mehr als einem dieser n-Paraffine bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden. Weiterhin kann ein Gemisch von einem oder mehr dieser η-Paraffine mit einer weiteren Kolilenstoffquelle eingesetzt werden, wobei das n-Paraflin der Hauptbestandteil ist. Zu η-Paraffinen innerhalb des vorstehend aufgeführten Bereiches der Kohlenstoffzahl gehören n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan. n-Heptadecan und n-Octadecan sowie Mischungen davon.

Die Einzelheiten der Züchtung sind üblich und dem Fachmann geläufig. Zum Beispiel gehören zu ändern Kohlenstoffquellen, die in geringeren Anteilen verwendet werden können, Kohlehydrate, z. B. Glucose, Stärkehydrolysate, Melassen u. dgl. oder andere übliche Kohlenstoffquellen. Zu anorganischen Salzen, die angewandt werden können, gehören Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Maiigansulfat, Kaliumchlorid, Ferrosulfat, Calciumcarbonat u. dgl. Zu üblichen Stickstoffquellen, die angewandt werden können, gehören Hefeextrakt, Pepton, Fischmehl od. dgl. Wie vorstehend aufgeführt, können verschiedene wesentliche Nährstoffe zu dem Medium zugegeben werden.

Die η-Paraffine können zu dem Medium in einer Menge zwischen etwa 5 und 15 Gewichtsprozent zugesetzt werden. Die Fermentierung wird vorzugsweise bei einer Kultur-Temperatur von 25 bis 38 C ausgeführt.

Nach Beendigung des Fermentierungsverfalirens kann die L-Glutaminsäure und \-Ketoglutarsäure nach üblichen Methoden gewonnen werden, beispielsweise durch eine lonenaustauschbehandlung.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die angegebenen Prozentsätze auf Gewichts/Volumpro/ent.

Beispiel 1

3 1 eines Nährmediums aus 0,2% K-HPO₄, 0.1% MgSO,-7 HP, 0,002% MnSO₁- 4 H-O, 0.02% FeSO₁-THoO, 2,0% NH,NO_:1, Jj-¹I Vitamin B₁, 0,1 m y/ml Vitamin B₁-, 0,01% Maisquellwasser und 3,0% CaCO,, wurden bei einem pH-Wert von 7,2 in einem 5-l-Porzellanfermentiergefäß sterilisiert. Dann wurden 200 g eines Gemisches von C₁₁- bis C,„-η-Paraffinen (C₁₁: 7,0%, C₁₂: 30%, C₁₃: 25%, C₁₁: 24%, C_1S: 10%, C₁₈: 1,5%, C₁₇-C₁₈ 2,5%) hierzu zugesetzt. Dieses Fermentierungsmedium wurde dann mit einer Impfkulturflüssigkeit von Arthrobacter simplex ATCC Nr. 15799, die vorübergehend mittels einer

SchüttelkuHur in einem Bouillonmedium während 24 Stunden inkubiert worden war, in einer Menge von 10 "Z₀ geimpft. Die Züchtung wurde dann während 96 Stunden unter Rühren mit 600 UpM ausgeführt, während keimfreie Luft mit 1 I/Min, von 28^CC eingeblasen wurde. Nach Beendigung der Züchtung wurden 18 g/I ^Ketoglutarsäure und 1 g/l L-Glutaminsäure erhalten.

Beispiel 2

IO

Arthrobacter paraffineus ATCC Nr. 19065 wurde in derselben Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, jedoch wurde das Fermentierungsmedium durch kontinuierliche Zugabe von Ammoniakwasser auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5 eingeregelt.

Nach 72stündiger Kultur waren 35 g/I i.-Glutaminsäure und 3 g/l ^Ketoglutarsäure vorhanden.

B e i s ρ i e 1 3

'Arlhrobacter parafiincus ATCC Nr. 19064 wurde in 20 ml eines Fermentierungsmediums, das 0,1 % KH..PO.,, 0,1 «/0 NaHPO₄-12 H.,0, 0,1% MgSO₄-7 HoO, 0,002% FeSO₁-7 H₂O, 5)'/' Vitamin B₁, 2.0% (NH₄)₂SO₄. 0,03% Maisquellwasser, lOOy/ml Adenin und 5,0% n-Dodecan enthielt, bei einem pH-Wert von 7,0 in einem .500-ml-Sakaguchi-Kolben eingeimpft und das Gemisch unter Schütteln während 96 Stunden bei 30/ C gezüchtet. Der pH-Wert wurde auf etwa 7,0 bis 8.0 durch Zugabe von Harnstoff lösung und Ammoniakwasser zu dem Fermentierungsmedium eingestellt. Nach Beendigung der Züchtung waren mg/ml i.-Glutaminsäure und 3 mg/ml Λ-Ketoglutarsäure in dem Fermentierungsmedium vorhanden.

Claims

Patentansprüche:'

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von ^-Ketoglutarsäure und L-GIutaminsäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter in η-Paraffine mit 11 bis 18 Kohlenstoffatomen als Hauptkohlenstoff quelle, Stickstoffsubstanzen, anorganische Salze und Wachstumsfaktoren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen pH-Werten, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter, Arthrobacter simplex ATCC 15799, Arthrobacter paraffineus ATCC 15590, Arthrobacter paraffineus ATCC

. 19064 oder Arthrobacter paraffineus ATCC 19065 einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch .1, dadurch gekennzeichnet, daß man die genannten Mikroorganismenstämme in einem Nährmedium zum Einsatz bringt, das zusätzlich 0,01 bis 2,0 Gewichtsprozent eines primären oder sekundären einwertigen Alkohols mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, einen Zuckeralkohol, Glycerin, Benzoesäure, Sulfanilsäure oder Mischungen dieser Substanzen enthält.