DE1442263A1 - Verfahren zur Herstellung von a-Ketolglutarsaeure und L-Glutaminsaeure - Google Patents

Description

Dr.-lng. HANS RUSCNKE '"°^N™* Dipl.-ing. HEINZ AGULAR PATENTANWÄLTE

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K 633 - Pa*eiitaiuaeldung P 14 42 263ο 0

Kyowa Hakko Kogyo Company Limited, Tokyo / Japan

Verfahren aur Herstellung von a-Ketoglutax-H, eUure und L-Glutaminsäure

Die vorliegende Erfindung 'betrifft ein Verfahren zur Herstel lung von α-Ketoglu tar säure und L-&lutaminsäiire und ist dadurch gekennEeiohnet, öaes ein zum Genus Arthrobacter gehörender Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Hährmedium gezüchtet v/ird, daa wenigstens ein n-Paraffin ale Hauptkohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganiflche Salse einGoixlieaslich wenigstens siner Quelle, die EisenlcjJen an daß Medium liefert,

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(Art. J % \ Al». 2 Nr, l Satz 3 de· λτ*ί·ηιηβ»ββο. ν. 4919*/J

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Paktoren» die wenigstens Biotin, Sihiamin und Vitamin B^₂ an das Medium abgeben» enthält, und die auf diese Weise erzeugte «-Ketoglutarsäure und !^glutaminsäure abgetrennt wird₀

Erfindungsgemäss wurde festgestellt, dass eine geeignete Hege« lung bestimmter Bestandteile, wie Vitaminen und anorganischen Salzen für das geeignete Wachstum von Bakterien, die zum Genua Arthrobaeter gehören, in einem Kulturmedium, das n-Paraffine als Kohlenstoff quelle enthält, zur Anreicherung grosser Mengen an «-Ketoglutarsäure und Ii-Glutaminsäure au bevorzugen ist«. Spezifisch wird das Wachstum der Mikroorganismen und die Ausbeute an den gewünschten Produkten äusserst beschlaimigt, wenn ein Kulturmedium "/en/endet wird, das mindestens eine der folgenden Substanzen Vitamin B₁ (OJhiamine), Vitamin B₁₂, p-Amänobenzoesäure, Vitamin H (Biotin), deren Derivate ©der eng verwandte Verbindungen und eine hohe Konzentration an Eiseniönen enthält.

Darüber hinaus wird durch Zugabe von Calciumcarhonat zu dem !»ermentierungsmedium ein wirksamer und erheblicher Anstieg der Anhäufung an ot-Ketoglutarsäure erreichte Unter Verwendung geeigneter KuIturbsdingungen beträgt die Menge an angesammelter a-Eetoglutarsäure mehr als 70 g/l, was einer Ausbeute von etwa 70 $ hinsichtlich der verbrauchten Menge an η-Paraffin entspricht,,

9 09 8 U 1 / 0 3 U 5 BAD ORIGlNAi.

Ή42263 - 3 ~

Auf Grund des erfindungsgemässen Verfahrens ergibt eich eine PermentierungBausbeute, die « verglichen mit den üblichen oc-Ketoglutarsäure- und IMElutaminsäure-Pe^entieinmgeverfahren* bei denen Kohlehydrate als Ausgangsraaterial verwendet werden bemerkenswert ho oh ist« Dies dürfte darauf zurückzuführen sein, dass das epfindungegemass verwendete Kohlenwasserstoffausgangs«· material einen hohen Kohlenstoffgehalt je Volumeneinheit hat, die die Kohlenetoffstruktur des Produktes ergibt, verglichen mit den üblichen Kohlehydratausgangsmaterialieno Darüber hinaus ist die Iiuftoxydationsreaktion bei dem erfindungegemllss angewandten Genus der Mikroorganismen äusserst wirksame

Vie vorstehend ausgeführt» zeigt die vorliegende Erfindung viele Vorteile, beispielsweise die Herstellung von (^Ketoglutarsäure in bemerkenswert hoher Ausbeute bei niedrigen Kosten auf Grund der Verwendung eines Kohlenwasserstoffes anstelle eines Kohlehydrates als Ausgangsmaterial, einfache Abtrennung des Produktes aus der Fermentierungeflüssigkeit und dergleichen,, Infolgedessen ergibt sich auf Grund der vorliegenden Erfindung ein äusserst vorteilhaftes Industrieverfahren zur Herstellung von CC-Ke toglutarsäure.

Bekanntlich lässt sich a-Ketoglutarsäure als Vorläufer bei der Biosynthese von !-Glutaminsäure verwenden, die im v/ei ten Umfang als Geschmackssteigerer in form ihres Mononatriumsalzes

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verwendet wird_e Infolgedessen wurde in einer weiteren Ausbildungsform der Erfindung ein Verfahren zur direkten tlberftthrung von a-Ketoglutarsäure, die dae Hauptprodukt der vorstehend aufgeführten Stumme der Mikroorganismen darstellt, zu L-Glutaminsäure entwickelte

Bei Verwendung von Saechariden ale Ausgangsraaterial zur Herstellung von !»«Glutaminsäure naoh bekannten Verfahren ist es vorteilhaft ₉ die Permentlerungsfltissigkeit bei einem pH von 6 durch Zugabe von Ammoniumionen als Quelle für den Aminorest zu« zugeben» da dies wesentlich für die Biosynthese von !^Glutaminsäure ist ο Diese Maßnahme ist auch beim vorliegenden Verfahren wirksam_r d_eh₀ wenn diese Stufe angewandt wird» werden 30 - 50 $> der erhaltenen a-Ketoglutarsäure in L-Slutasiinsäure überführt_o

Jedoch besitzen die siir Herstellung von a-Ketoglutarsäure unter Verv/endung von Kohlenwasserstoffen als Ausgangsmaterial geeigneten Mikroorganismen eine Oxydationskapazität, die sich von den industriell zur Serstellung von !«•Glutaminsäure Verwendeten Mikroorganismen unterscheidet. Infolgedessen besteht eine Neigung, dass die erzeugte li-Glutaminsäure zu a-Ketoglutarsäure oxydiert wird.

Im Rahmen der Erfindung wurden Mutantenst&mae von Mikroorganismen gefunden, die nur eine geringe oder keine Oxydationskapazität

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für L-Glutaminsäura besitzen,, Darüber hinaus wurde gefunden, dass durch geeignete Hemmung der Zersetzung von L-Glutaminsäure und geeignete Zufuhr einer wesentlichen Quelle für den Aminorest zu der Kultur eine direkte Umwandlung von mehr als 90 ?S der erzeugten a-Ketoglutarsäure zu !-Glutaminsäure erreicht werden kann«,

Znsbesondere werden die vorstehenden Ergebnisse erhalten,

Io Adenin erfordernde Mutantenstämme von Mikroorganismen, die eine geringe oder keine Zersetzungstendenz für L= Glutaminsäure zeigen, verwendet und

2_o die Fermentierung in einem Kulturmedium ausgeführt wird, das einen primären und/oder sekundären einwertigen Alkohol mit 4-12 Kohlenstoffatomen, Benzoesäure oder damit verwandte Verbindungen, mehrwertige Alkohole ₉ wie Glycerin oder die Zuckeralkohole, beispielsweise Sorbit, Mannit oder dergleichen, aromatische Sulfonsäuren, wie Sulfanilsäure, oder Mischungen davon enthält _o

Der Mechanismus, auf Grund dessen diese Substanzen die vorstehenden Ergebnisse erlauben, ist noch nicht geklärte Ohne auf Irgendeine Theorie beschränkt zu sein, wird angenommen, dass sie die Oxydationsreaktlon hemmen und ebenso als Quellen für Aminoreste dienen, da viele der Kohlenwasserstoff assi»

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6 - . ■■■- " ■■-■·■

miliersnden Bakterien, di© sum Senus i&ihxobactes? Aminosäuren* wie Asparaginsäure, TaIiH₉ GrXutaminsEur© und ösr¹· gleichen durch Permentierung mit Sorbit öder Mannit

Das er^indungsgemäss© Yerfalirsn unter Verwendung τοη 2sum Senus Affbhrotoaoter gehörenden Bakterien mit einer Assimiliereigniang für n-Paraf£ine und ©iner guten 'SssodtdctlTltät an cc-Ketoglutar= säure ist am wirksamsten bei der Herstellung ^m ^Ketoglutars unä !»Glutaminsäure, vjemi Kohlenwasserstoffe, insbesondere n-Paraffine, als Ausgangsstoffe verwendet werden_e

Sie folgenden» nicht als Beschränkung aufzufassenden äseigen im einseinen das eriindungsgemässeVerfahrano falls nicht anders angegeben,, sind die angegebenen Iroseatsätse auf das Gewicht bezogene

Die Tersuche wurden unter Verwendung der - folgenden BakterisnstSmme ausgeführti

Arthrobacter simplex ASGO Nr₀ 15799
Arthrobacter roseoparaffinus ITr. 1661 AiBGO Hr₀ 15584 Arthrobacter hydrocarboglatamious IT2*_?2339 ΑΪ00 JTr₀ 15583 "'" Arthrobaoter paraffineus Nr₀ 24-11 AiCOO Hr₉ 15591 Arthrobacter paraffineus Hr. 851 Aföö Hr> 1559Ö

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Arthrobacter paraffineus Hr. 5601 ATGG Hr₀ 19065 Arthrobacter paraffineus Hr₆ 5883 ATGG Nr₀ 19064

Die vorstellend aufgeführten Stämme wurden nie Impfbakterien verwendet, und jeder wurde unter Schütteln in einem Kulturmedium kultiviert, welches 1,0 # Kerosin, 0,2 # Hefeextrakt, 1,0 <?o Fleischextrakt, 1,0 $ Pep ton und 0,5 i> HaGl enthielt, wobei bei einem pH-Wort von 7,2 bei einar Temperatur von 28^eG in einer Kammer von konstanter Temperatur während 24 Stunden gearbeitet wurde. 2 ml von jeder dloner Kulturan wurde im Ptrmentierungemedium verwendet. Die Zusammensetzung der Per» mentierungemedien war folgende:

a) 5 $> η-Paraffin^, 0,2 Ji KHgPO_{4 s} 0,1 Ji MgSO₄^H₂O, 0,005 $ MnSO₄,4H₂O, 2,0 $ HH₄NO₃, 5 Y~/l Vitamin B₁, 0,1 m^/1 Vitamin B₁₂, 10 y/1 p-Aminobönaoesäure, 2^/1 Vitamin H, 0,005 $ FeS0₄.7H₂0, 0,01 Ji MalsquellflÜEBigkeit, 3,0 %

b) 5,0 36 n-Paraffin⁺\ 0,2 $ KH₂PO₄, 0,1 jfc MgSO₄₀TH₂O, 0,001 $ MnS0₄„4H₂0, 2,0 36 HH₄NO₃, 0,001 j£ PeSO₄₀THgO, 0,01 36 Maisquellflüssigkeit, 2,0 36 OaCO-.'

+) η-Paraffins Mischung mit einem Gehalt 95 $>

Die Kultur -wurde bei 23°C in einem 500 ml=Sskaguchi-Kolben durch-

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BAD ORIGINAL

-■ geführt, wobei jeder 20 ml der Torstehend aufgeführten. Fermeiitierungsiiiedien enthielte Die Kultivierung wurde während 4 Sagen unter aerobem Schütteln ausgeführt_o "

Vergleichsergebnisse des Wachstums und der Menge, an erzeugter cc-Ketoglutarsäure und Ii-Glutaminsäure bei der Durchführung der vorstehenden Fermentierung sind in Tabelle I zusammengefasste

• tabelle I

Wachstum ct-Ketoglutarsäure L-aiutaminsäure Angewandter _i ,Stamm "a),,,.,.,,,;??,),.,,, a)_mjft/dl ^ ₁ b) ßfül a) ff/dl ' p) /

Arthrobacter simplex .AiEOC Hr. 15799 ή-μη· *++ 1,5 1,0 0,2 0,1 ''■

Arthrobacter roseoparaffinas ITr»1661
AICC-Br,-15584-' -H-++ ++ 1„9 0,6 .0,6 O₉ 3

Arthrobacter hydro- -

carboglutamicus

Ur₀ 2389 AICG Ur„ ·■

15583 +*+·{· 'H~^ 1,0 0*8 0,7 0,4

paraffineus Nr., 2411
A2CC Hr₀15591 Ή-+++ +++. 2,9 2,0 0,5 O₉Z.

Arthrobacter paraffi— «

neus Nr₀ 851 -

AECO Hr₀15590 ++++-?- ψ++ 2,5 1,5 0,4 0,2

Wie aus Tabelle I ersichtlich, wird bei Vorhandensein von Vitaminen und anorganischen Salzen, insbesondere Eisenionen_ff in entsprechenden Konzentrationen als Bestandteile des Kulturmediums das Wachstum der Bakterien und die Erzeugung von <x~KetogXutar-

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- . . COPY ^ ORiGtNALlNSPECTED

säure und !«Glutaminsäure bemerkenswert erhöht₀ Weiterhin ißt ersichtlich» dass erhebliche liengen an a-Kstoglutarsäure aus
η-Paraffinen durch Verwendung des Mikroorganisztiafl irsnus Arthrobacter erhalten werden ₀

Das Verfahren sur Überführung der a~Ketoglutarsäurefarmßntie~ rung in eine 3?ermentierung zur Herstellung τοη überwiegendIr-Glutaminsäure durch Verwendung des Arthrobacter-Genus ist
in den folgenden Versuchen dargestellt.

Zu diesem Zweck ist es notwendig* eine Reaktion einzuführen,
die die Aminogruppe der !!-Glutaminsäure aus a-Kstoglutarsiiure ergibt, während gleichseitig die Zersetzung der erhaltenen
!-Glutaminsäure gehemmt v/ird, um bei der Permentierung hauptsächlich !-Glutaminsäure zu erzeugen»

Infolgedessen wurden Ammoniumionen₉ die wesentlich als Amingruppenquelle bei der »Synthese von L-Glutaminaäure sindj, kontinuierlich in das Fennentierungsmedium angeführt und &e:c pH-Wert desselben bei 4,0 « 9,0 gehaltene Dieser pH«Bereieh
erwies sich als optimal für die Herstellung von ^Glutaminsäure,,

Die pH-Wert-Einstellung des ITsmentie.iungsmedliiBis und di<3
Zufuhr 7021 Ammantumionen wurden durch Zugabe τοη entweder einer

COPY

wässrigen Lösung von Harnstoff _B AmmonialEvrasaer oder einer wässrigen AaMoniiimoarboaatlSsimg erreichte Das Kultivierungsverfahsön was? das gleich© „ wie ©s verstehend In Yerbindung mit SabeXle I beschrieben wurde_e Ais Eemaeirblerungsmediura wurde' das vorstehend unter a) angegebene verwandet.

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle II susammen« gefasst«

Säbelle	Arthröbaotär" simplex ASOG Hr0 15799	II	säure ϊ tT- f rt J u	säure
	Arthrobäcter paraffineus ITr0 2411 ASOO Nr. 15591		no	0?8
Arthrobacter paraffineus BTrο 851 AiDOO Hr8 15590		no	't,-3
Arthrobacter paraffineus Wr0 2367		■■ι.?	no
	no	n-5

VJie aiis Sabelle II ersiehtlish_e iat die Menge an säure gesteigert ₉ während diejjs^g® ⁰^ «^Ketp'glutarsSttKe gesenkt lot, vTOstm die vorstehend auf geführt pH-Einregeluag und die Zufuhr von Ammoniumipnen in das ffermentieiiuageHieöium an·=» gewandt werdenβ Se ergibt sish daraus ₉ dass die Zufuhr von Ammoniuraionen und die beschriöbene pH«»linstellung wesentlich, sind» uffl eine hohe Menge aa_; L«l&lutaia;tn!3Ö,ur© gu erhalten,,

iiif41/i|4| BAD ORIGINAL

Es wurde jedoch festgestellt _t dass grosae Mengen an a glutarsäure dennoch angehäuft wurden, und äasB d£® L-ßlutamin- säure eine Neigung zeigte, während der letzten Stuf en der Kultivierung Zersetzung zu erleiden₀ Um äieoe verbliebenen Probleme zu lösen» wurden, die folgenden Versuche ausgeführt,, wobei Substanzen zur Begünstigung der Herstellung von Ir=GIu= taminsäure angewandt wurden,, Sie Kultivierung wurde. . genäse dem in Verbindung mit Tabelle ZI beschriebenen Verfahren durch» geführt. Die Ergebnisse sind in tabelle IXX zusammengefasste

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Zugegebene

^rthrobaeter
»araifineus ITr₆ 2411
.SCC Ur, 15591

keine
Sorbit
Sorbit
Mannit
Mannit
Glycerin
Glycerin
Butanol
Butanol
Octanol
Octanol
Benzoesäure
Sulfanilsäure

iirthrobacter
par&ffinsus Kr₉5888
ISGO ITr, 19064 -

Arthrobacter
paraffineus ITr₀ 5601
Αίσσ Hrο 19065

Adenin*!,
keine**)

Konsentration der zugegebe nen Substan

2,0

1,0

2,0

t..O

2,0

1,0

2,0

O₉ 5

1pO

0,1

0,02 α-Ketoglutar- Ii«=Glutaaiir säure säure

(g/dl)

1,2 0,6 0,5 0,3 0,4 0,9 0,5 0_?7 O₉ 5 0,5 0,2 O₉ 8 O₉ 5

0*2 0,3 "

1,	O	W 7
τ.	9	8
h	3	O
2,	O	5
2,8	5
U	7
•1,
2,
2,
2,

2₉p

2,5

*) Adenin erfordernder Mutantenstaaaa

Mutantenstairaii (mit schwacher Zeraetaimgskapazität für

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ORIGINAL iNSPECTED

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Wie aus Eabelle III ersichtlich, sind Suokeralkohole, höhere einwertige Alkohole, Glycerin, Bensoesäure und damit verwandte Verbindungen sowie aromatische Sulfonsäuren wirksame Substanzen» um die Erzeugung von !!»Glutaminsäure durch 3?ermentierung zu begünstigen,, Weiterhin wurde gefunden, dass Adenin erfordernde Mutantenstämme und Mutantenstämme mit einer schwachen Zersetzungskapazität für !»-Glutaminsäure praktisch kaum a-Ketoglutarsäure ansammeln und direkt bemerkenswert grosse Mengen an L-Glutaminsäure in der Kulturflüssigkeit ergeben«,

Zusammenfassend umfasst die vorliegende Erfindung einige Gesichtspunkte, Einer dieser Gesichtspunkt besteht darin? dass grosse Mengen an a-Ketoglutarsäure und ^Glutaminsäure in einer Kulturflüssigkeit erzeugt μerden, wenn sum Genus Arthrobacter gehörende Mikroorganismen verwendet und n-Paraffine mit 11-18 Kohlenstoffatomen als Ausgangsmaterial verwendet werden« Ein weiterer Gesichtspunkt besteht darin, dass ein Herstellungsverfahren gefunden wurde, das auf Xndustriebasis äusserst vorteilhaft ist» da bei ihm in gewünschter Weise das überwiegende Produkt der Fermentiesung in «»Ketoglutarsäure baw_o !!«Glutaminsäure bestehen kann«

Es kann entweder ein einziges n-Paraffia mit 11 — 18 Kohlenstoffatomen oder ein Gemisch von mehr als einem dieser n-Paraffine

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COPY

"bei dem erfindungsgenüässen Verfahren angewandt "werden· hin kann ein Gemisch won einem oder mehr dieser mit einer weiteren Kohlenstoff quelle eingesetzt werden* wobei das B-Paraffin der Hauptbestandteil ist«, Eu »«»Paraffinen innerhalb des -vorstehend aufgeführten Bereiches der Kohlenstoff» zahl gehören n»TJndeca3i, n-Po&eean, n«Sridecan_y n-Sstradecanj, n-Pentadecan, n-Hexadecan, n-Eeptadecan und n-Oetadeoan sowie Mischungen davon«

Die Einzelheiten der Kultivierung sind Üblich und dem Paehmann geläufige ZοB₀ gehören au anderen Kohlenstoffquellen» die in geringeren Anteilen -verwendet werden können» Kohlehydrate, S₀B₀ Glucose ₉ Stärkehydrolysate j Melassen und dergleichen oder andere Übliche Kohlenstoff ^seilen«, Zu anorganischen Salzen, die ange» wandt werden könn@n₉ gehören KöliumphO9phat₉ Magnesiumsulfat _g Mangansulfats SaliiM0iil®ridg- lerrosulfat₉ öaleiunearbonat und dergleich©n₀ 2u üblichen Stickstoffquellenj, die angewandt wer«= den kennen j gehören Hefeextrakt ₈ Peptang fis.ehmehl ©dar dergleicheno Wie vorstellend aufgeführt^ können ir@rs0lii@den© wesent·= liehe Nährstoffe su Hem Mediua sugegeben

Die η-Paraffine kSimen su dem Medium in ©iner Menge zwischen "e-twa. 5 und 15 öewichts«^ sugesetst werden_o Die Permentierung wird vorzugsweise bei einer Kulturtemperatur von 25■ - 38©G ausgeführt»

Nach Beendigung des 3?ementierungsver£sateens kann die Glutaminsäure und/oder «-Ketoglutarsäure nach üblichen Meth®«= den gewonnen werden, "beispielsweise durch ein Ionenaustausch harz oder durch Zentrifugieren* ■

Sie folgenden Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne sie zu beechrl£siken_Q Palis nicht anders angegeben, beziehen sich die angegebenen Prozentsätze attf das Gewichte

Beispiel 1

3 1 eines Kulturmediums ans 0,2 $> E₂HPO,, 0₉1 $> MgSO₄ 0,002 # HnSO₄J^H₂O* 0,02 $ PeSO₄₀THgO, S₈O $ HH₄SrO₅, 3 Vitamin B₁, 0,1 m^rnl Yitamin B₁₂, O₉OI i> HaisQuellflüssigkeit und 3,0 i> CaCO- wurden bei einem pH-Wert von 7,2 in einest 5 1-Poraellanfermentiergefäss sterilisiert, Bann wurden 200 g eines Gemisches von C₁₁- bis C₁₈~n~Para£finen (C₁₁:?^ 0₁₂:5O £_v C₁₅i25 ?έ, 0₁₄824 ^i O^gStO "^, 6|gi1*S fS) hierzu zuge se tat ο Eine la^ilculturfltiasigkeit von Är^toobaqter paraffi«» neue JTr. 24-11» AECC Hr₀ 15591» die vorhergehend mittels einer Schüttelkultur in einem Bouillonmeäium während 24 Stunden in« kubiert «orden war, wurde dann hierzu in einer Menge von 10 $ inokulierte Die Kultivierung wurde dann während 96 Stunden unter BÜhren mit 600 tJpm ausgejEÜhrt, während keimfreie Luft mit 1 l/Minute von 28°C eingeblasen wurde ₀ Haeh, Beendigung

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ι -τ -r *. β- \j-\j

der Kultur "betrugen dia aagesaiamelten lengen an ««Ketoglutarsäure und !^Glutaminsäure 43 g/l ."bsw₀ β g/l_o

Kristalle von ««Ketoglutarsäure (100 g) und von !.-Glutaminsäure (1p g) wurden aus S 1 der lesmentleEungsflüseigkeit aittels Üblicher Terfaliren

Arthro*bact©r simplex ASOO Kr₀ 15799 wurde in derselben wie in Beispiel 1 "besehrielaenj kultivierte Haoh 96-stÖadiger Kultur -wurden 18 g/l a«=>Ketoglutari3äure und 1 g/X ^-Glutaminsäure erhaltene *

Beispiel, ,J₁

Es wurde dieselbe Kultur, wie in Beispiel 1 beschrieben» ausgeführt, jedoch wurde die Permentierungsflüssigkeit auf einen pH~Wert von 7_s0 »» l_t5 dureh lcöntinuierliche Sugabe von Ammo« niakwasser eingeregelt₀ '

lach 72-stündiger Kultur waren 20 g/l Ii-G-lutaminsäure und 20 g/l a«Ketoglutarsäure in der KuIturflüssigkeit vorhanden,,

Arthrobaeter paraffineus Hr₀ 5601 (ASGO Nr₆ 19065) wurde in derselben Weise _t wie in Beispiel 3 beschrieben» kultiviert₀

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1U2263 - 17 - "'

!fach 72-stündiger Kultur waren 35 g/l fr-Slutsminsäure und 3 g/l a-Ketoglutarsäure vorhanden,,

Die Kultivierung wurde in derselben Weis©, wie in Beispiel 3 beschrieben, ausgeführt» mit der Ausnahme_B dass Oet&nol eben» falls zu dem Kulturmedium in einer Menge von 1 $ su Beginn der Kultivierung zugesetzt wurde_o Nach 96~stündiger Kultivierung waren 30 g/l ^-Glutaminsäure und 6 g/l «-Ketoglutarsäure vorhanden_o

Die Kultivierung wurde in derselben Weise wie in Beispiel 3 in einem Kulturmedium durchgeführt, das weiterhin 2_s0 i> Mannit enthielt, Mach 96~stündiger Kultivierung wurden 36 g/l Glutaminsäure und 8 g/l α-Ketoglutarsäur© erhalten,,

Beispiel,%

Arthrobacter paraffineus Ur« 5888 (ASOC STr₀ 19064) wurde in 20 ml ©ines Kulturmediums, das 0,1 ^ KHgPO., 0₉1 ^ IaHPO^₄12H_g0_g Opt ?ί MgSO₄^TH₂O, 0,002 $ ^SO₄₀TH₂O, 5^/1 fitaffiia B₁, 2,0 ?δ CMH₄)₂SO_4!) 0,03 Si Maisq.uellflüssigk©it₉ 100)7ml Adenin und 5*0 ^ n»D©deean enthielt, bei ©inem pH»¥ört von 7»0 in ©inem 500 ml=»Sakagttehi-»K©lben inokuliert und das &emiseh unter Sshüt« teln während 96 Stunden bei 30⁰G kultivierte Der pEhWert

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- 18 - '.■■■:; . ■;_

auf etwa 7»O - 8₉0 durch Zugabe von Harnstofflösung und Ammoniakwasser zu der KuIturf lüssigkeit eingestellt« Nach Beendigung der Kultivierung waren 20 mg/ial. fr-Slutaiziinsäure und 3 mg/ml «»Ketoglutarsäure in der ICultuxflüssigkeit vor» handen₀

ßeraäss der vorliegenden Erfindung gehören au den gegebenen^ falls su dem Permentierungsmediiim zur Steigerung der Ausbeute an LMJlutaminsäure durch üiawandlung von oc-itetoglutareäure ssususetzenden Substanzen, vie bereits vorstehend ausgeführt, aliphatisch^ Alkohole, d.h₀ die Zuckeralkohole, Glyosrin, primäre oder sekundäre einwertige Alkohole mit 4 - 12 Kolilenstoffatomen^ Benssoesäure, SuIfänilsäure und Mischungen derartiger Substanzen. Me Zuckeralkohole sind bekannt und umfassen Verbindungen;, wie Sorbit, Mannit, ualactit und äer«- gleichen. 2u den primären oder sekundären einwertigen Aiko» h.oleß_p die verwendet werden können, gehören z_oB„ 1-Butanolg 2«Butanol _s 2-Methyl«-1 «propanol, 1 -Pentanol, 2 -t-Helxanol, 2~Hesano! _? 1-Heptanol, 2~Heptanol, 2-Octanol, 1-Dodecanol und derglel6hen₉ d_Qh_eäie primären und sekundären einwertigen Alkohole mit 4 - 12 Eehlenstoff atomen ο Biese Substanzen können zu dem iPementiermediup. in einer Menge von O₉01 ■=■ 2₉0 Sewichts·=^ zugegeben werden*

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Der Mikroorganismus Arthrobaeter simplex ist begannt und in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« I₀ Auflage, 1957» beschrieben,, Arthrobaeter roseoparaffinus und baoter hyärocarboglutaioicus sind neue SWsme von men und sind in der Patentschrift « ·_{0o aoo} (Patentanmeldung K §6 898 IVa/6b der selben Anmelderin vom 16₀ August 1965 0 BearDeitungsseichen E 651) besohrieben. Sie Arthrobacter paraffineus-Stämme sind ζ.B₀ in der Patentschrift ₀ o.» «_eo (Patentanmeldung £ 56 584- IV/6h be&ohrieben₀

vorstehend beschriebene Erfindung lässt sich selbstverständlich vielfach variieren und die vorstehenden Ausführungen sind als Erläuterung aufzufassen»

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   SSSSSSSSBSSSSSS

   Π, Werfahren ssm? Herstellung von oc-Eetoglutarsäure und Glutaminsäure₈ dadurch gekennzeichnet ₉ dass ein zum Genus Arthrobacter gehörender Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium gezüchtet wird β das wenigstens ein η-Paraffin als Haupt·» kohlenstoff quelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze einschliesslich wenigstens einer Quelle, die Eisenionen an das Medium liefert, sowie wachstumsbegtinstigende Paktoren, die wenigstens Biotin, ihi&min und Vitamin B_{1 g}, an das Medium abgeben, enthält und die auf diese Weise er·* zeugte a-Eetoglutarsäure und It-Glutäminsäure abgetrennt wird«

   ο Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1 sur Herstellung von a-Ketoglutarsäure und L«ölutaminsäure, wobei eine überwiegende Menge sxl ^Glutaminsäure durch Umwandlung der ot-Ketoglutarsäure in 3j»61utaminsäure erzeugt wird, dadurch gekennzeichnet j dass zusätslich aliphatische Alkohol©, Bensoesäure₈ Sulfanilsäure oder Mischungen dieser Verbindungen, verwendet werden*,

   3ο Verfahren nach Anspruch 1 und 2_S dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete n-Paraffin 11 -18 Kohlenstoff atome enthalte

   Unterlagen tr?ÄMsWi JIÄe* Änderungen*, v. 4

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   Verfahren nach Anspruch 1 und 2₉ dadurch gekennzeichnet ₉ dass p-Aminobenzoesäure Sem Medium angesetzt wird₀

   ο Verfahren nach Anspruch 1 und 2₉ dadurch gekexmzsioiinet» dass Oaleiumcarbonat dem Medium zugesetzt wird,,

   S₀ Verfahren naoh Anspruch 1₉ dadurch gekenns:eichn@t₈ dass der pH durch Zugabe iron Amoniumionen zn dem Medium zur Erhöhung der Ausbeute an erzeugter L-ftlutaminsäure auf 7fO - 8,2 gehalten wird_o

   7e Verfahren nach Anspruch I₉ dadurch g@l£enns@iehsieij_s dass eine wässrige Lösung aus Harnstoff _f Ammoniak oder carbonat dem Medium als Ammoniumionenguelle migesetst

   Verfahren nach Anspruch 1₉ dadurch gekenngeiotoetj, als Mikroorganismus Arthrobaeter eimple^₉ Arthrobaeter rose©· paraffinusj Arthrobaeter hydroearboglutamieus oder Arthro=· bacter paraffineiis verwendet

   9_e Verfahren nach Ansprach 2_S dadurch gekennzeichnet ₉ dass als aliphatisehe Alkohole Zuckeralkohole, Qljoe^in ©d©^ primäre und sekundäre einwertige Alkohole mit 4-12 Koh lenstoffatomen verwendet werden_o

   9O9841/034S

   1öo Verfahren nach Anspruch S₉ dadurch gekennzeichnet* dass als Zuekeralkohol Serbit verwendet wird*

   H₀ Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnei;, dass als Zuckerallsoliol Mannit verwendet

   12V Verfahren nach Anspruch 2 _p dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus ein Mwfcantenstamm ύοά Arthrobactsr ist ρ der für sein Wachstum Adenin "benötigt» und Adenin dem Medium zugesetztwird_o

   13o 'Verfahren nach Anspruch 12₉ dadurch gekeniigeiehnetg dass als Mikroorganismus Arthrobaoter paraffineiis Hr_β 5888 (ISOO Hr₀ 19064) verwendet

   H₀ Verfahren nach Ansprush 2„ dadurch gekenngaiehnet» dass als Mikroorganismus ©in MutantenstsimB von Agthro"baot©r i det wird ₉ der nur^ eine^ schwach ausgebildete Fähigkeit
   Zersebsung von Ii=*&lutaminaäure besitzt.

   15«, Verfahren nach Anspnaeh Hv dadureh gakssinaeichnetj dass als Mikroorganismus Arthrobaoter paraffineus Hr. 5601 (ASÖG
   19065) verwendet wird.

   9 09341/0345