DE1442255C

DE1442255C - Verfahren zur Steigerung der L-Glutaminsaurebildung bei der biochemischen Herstellung von L-Glutammsäure durch aerobe Züchtung von n-Paraffinkohlenwasserstoff assimilierenden Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1442255C
Authority: DE
Inventors: Katsunobu: Kimura. Kazuo: Machida Tanaka. (Japan)
Original assignee: K\owa Hakko Kogyo Co.. Ltd.. Tokio:

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung der L-Glutaminsäurebildung bei der biochemischen Herstellung von L-Glutaminsäure durch aerobe Züchtung von n-Paraffinkohlenwasserstoff assimilierenden Mikroorganismen.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die L-Glutaminsäure das alleinige Umwandlungsprodukt im Züchtungsmedium, wodurch dessen Aufarbeitung erleichtert wird. Die Bildung von Nebenprodukt-Aminosäuren, die ein Hauptnachteil der mit Zucker enthaltenden Kohlenstoffquellen arbeitenden Verfahren ist, wird also weitgehend vermieden.

Die Fortschrittlichkeit beruht nicht auf den erzielten Ausbeuten an sich, sondern in erster Linie auf der Verwendung von n-Paraffinkohlenwasserstoffen, die im Rahmen eines industriellen Züchtungsverfahren bisher noch nicht als Kohlenstoffquelle bei derAminosäurefermentation ausgenutzt werdenkonnte.

Es sind Mikroorganismen bekannt, die zur fermentativen Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in Aminosäuren befähigt sind. Die gebildete Menge an Aminosäuren liegt jedoch im allgemeinen nur in der Größenordnung von einigen hundert γ je Kubikzentimeter der Nährmedien. Mit anderen Worten, die gebildete Aminosäuremenge ist bei diesen bekannten Fällen derartig geringfügig, daß die auf diese Weise gebildeten Aminosäuren als nichts weiter als Produkte der Selbstverdauung der Mikroorganismen angesehen werden können. Auf jeden Fall kann eine solche Umwandlung, die mit der Bildung von praktisch nicht mehr als Spuren von Aminosäuren verbunden ist, kaum als von Bedeutung angesehen werden, wenigstens insofern, was die wirtschaftliche Herstellung von L-Glutaminsäuren anbetrifft.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung der L-Glutaminsäurebildung bei der biochemischen Herstellung von L-Glutaminsäure durch aerobe Züchtung von n-Paraffinkohlenwasserstoff assimilierenden Mikroorganismen in solche Kohlenwasserstoffe enthaltenden Nährmedien bei pH-Werten von 5 bis 9, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Arthrobacter simplex ATCC 15 799 oder Corynebacterium hydrocarboclustus ATCC 15 592 einsetzt und das Nährmedium zusätzlich zur Paraffinkohlenwasserstoff-Kohlenstoffquelle Azetationen enthält, wobei die Azetationenmenge gegenüber der Paraffinkohlenwasserstoffmenge geringer ist.

Weitere Ausbildungen des Verfahrens sind dadurch gekennzeichnet, daß man die Azetationen in Form von Essigsäure oder Alkaliazetat zuführt; daß man als Alkaliazetat Ammoniumazetat verwendet; daß man dem Nährmedium eine geringe Menge Penicillin G zusetzt; daß man als n-Paraffinkohlenwasserstoff einen n-Paraffinkohlenwasserstoff mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen oder ein Gemisch von solchen Kohlenwasserstoffen verwendet und daß man als n-Paraffinkohlenwasserstoffe Kerosin verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Beobachtung, daß die Mikroorganismen Cornynebacterium hydrocarboclustus ATCC 15 592 und Arthrobacter simplex ATCC 15 799 nicht nur zur fermentativen Bildung von bemerkenswert großen Mengen an !.-Glutaminsäure in einem wäßrigen Nährmedium, das n-Paraffinkohlenwasserstoffc bzw. n-Paraffinkohlenwasserstoffgemische als hauptsächliche oder alleinige Quelle Tür assimilierbaren Kohlenstoff enthält, befähigt und daher zur Verwendung bei in technischem Maßstab durchgeführten Verfahren besonders geeignet sind, sondern daß ihre Fähigkeit zur Umwandlung von n-ParaffinkohlcnWasserstoffen in L-Glutaminsäure noch beträchtlich gesteigert wird, wenn in dem Nährmedium gleichzeitig Essigsäure (als solche oder in Form eines ihrer Alkalisalze, wie z. B. des Natrium- oder Kaliumsalzes, oder in Form ihres Ammoniumsalzes) als Hilfsquelle für Kohlenstoff und als die Umwandlung steigerndes Mittel enthalten ist. Diese Steigerung der Umwandlung der Kohlenwasserstoffe in. L-Glutaminsäure erhöht entsprechend die Bedeutung des Verfahrens in bezug auf seine Wirtschaftlichkeit und industrielle Durchführbarkeit.

Die Essigsäure kann bei der in Frage stehenden Umwandlung selbst als assimilierbare Kohlenstoffquelle dienen. Die durch die gleichzeitige Verwendung von n-Paraffinkohlenwasserstoffen und Essigsäure bzw. deren Salzen erzielte Umwandlung ist jedoch beträchtlich größer als die Summe der Umwandlungen in L-Glutaminsäure, die aus den beiden Kohlenstoffquellen bei getrennter Verwendung erzielt werden kann.

Die Essigsäure — die vorzugsweise im Vergleich zu den n-Paraffinkohlenwasserstoffen, die die hauptsächliche und billige Kohlenstoffquelle darstellen, in geringer Menge verwendet wird — steigert nicht nur die Wirksamkeit der verwendeten n-Paraffinkohlenwasserstoffe, sondern führt außerdem zur Unterdrückung der Bildung von als Nebenprodukten entstehenden unerwünschten Aminosäuren, d. h. anderen Aminosäuren als L-Glutaminsäure. Eine solche Bildung anderer Aminosäuren als Nebenprodukte tritt in unerwünschter Weise auf, wenn saccharidartige Materialien als assimilierbare Kohlenstoffquelle verwendet werden.

Es ist daher ein charakteristischer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die L-Glutaminsäure praktisch das alleinige Umwandlungsprodukt in dem flüssigen Fermentationsmedium darstellt.

Was die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als assimilierbare Kohlcnstoffquclle zu verwendenden n-Paraffinkohlen Wasserstoffe angeht, so können n-Paraffinkohlenwasserstoffe mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen verwendet werden. Die besten Ausbeuten an L-Glutaminsäure werden mit η-Paraffinen erhalten, die 10 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisen. Zu für die erfindungsgemäßen Zwecke geeigneten n-Paraffinkohlenwasserstoffen gehören daher n-Decan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridccan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadccan, n-Heptadecan und n-Octadecan — entweder einzeln oder in Form von Gemischen
wie z. B. in Form von technischen Gemischen.

Die folgende Tabelle erläutert die erfindungsgemiiße Herstellung von i.-Glutaminsäure und erläutert insbesondere den synergistischen Effekt, der durch die Anwesenheit von Essigsäure bzw. deren Salzen in bezug auf die Steigerung der Umwandlung der n-Paraffinkohlcnwasserstoffe erzielt wird, die als hauptsächliche Kohlenstoffquelle dienen:

Name des Stammes

Gebildete Menge an !.-Glutaminsäure*)

Niihrmedium A | Nährmedium B | Nährmedium C

(mg/ccm, in Klammern die Ausbeute in %)

Arthrobacter. simplex ATCC 15 799

Corynebacterium hydrocarboclustus
ATCC 15 592

4,6 (9,27ο)
4,2 (8,47ο)

3,8 (3,87ο)
4,5 (4,57ο)

18,8 (317ο)
17,9(30%)

*) Sämtliche Prozcntzahlen bezichen sich auf das Gewicht.

Anmerkungen

Kohlenstoffquelle bei Nährmedium A:
Kohlenstoffquelle bei Nährmedium B:
Kohlenstoffquelle bei Nährmedium C:

5% Undecan.

% Natriumazetat (berechnet als Essigsäure).

5% Undecan und 1 % Natriumazetat (berechnet als Essigsäure).

Weitere Bestandteile der Nährmedien

Gewichtsprozent

KH₇PO₄ 0,1

NaJiPO₄- 12H₂O 0,1

MgSO₄-7H₂O 0,1

FeSO₄-7H₂O 0,02

MnSO₄ · 4H₂O 0,002

Fleischextrakt 0,1

(NH₄J₂SO₄ 2,0

Phenolrot 0,001

CaCO₃... 2,0

Rest Wasser, eingestellt auf pH = 7,0.

Züchtungsbedingungen

Zu drei Anteilen des oben beschriebenen Nährmediums wurden gesondert die oben angegebenen Kohlenstoffquellen A, B und C gegeben, wonach die Medien mit Arthrobacter simplex ATCC 15 799 beimpft und der Schüttelkultur bei 72"C für einen Zeitraum von 72 Stunden bei 120 Schüttelbewegungen ' pro Minute unterworfen wurden.

Eine Verringerung des pH-Wertes der Medien wurde durch Zugabe von (NH₄J₂CO₃ verhindert, und es wurde ein Wert von pH = 7,0 bis 8,0 aufrechterhalten.

Das Verfahren wurde danach mit Corynebacterium hydrocarboclustus ATCC 15 592 wiederholt.

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß die Ausbeute an aus dem n-Paraffinkohlenwasserstoff gebildeter L-Glutaminsäure in jedem Falle durch Zugabe von Essigsäure äußerst stark gesteigert wird.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Fermentationsmedium außer dem bzw. den n-Paraffinkohlenwasserstoffen und der Acetationen liefernden Substanz (Essigsäure oder einem Azetat), die als Kohlenstoffquelle dienen, übliche Stickstoffquellen — wie z. B. Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid od. dgl., oder Harnstoff — sowie außerdem die üblicherweise ver- 55· wendeten anorganischen Salze und bestimmte übliche organische Nährstoffe enthalten. Als organische Nährstoffe sind Pepton, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Hydrolyseprodukte von Sojabohnenmehl od. dgl. brauchbar. Die Zugabe von Fleischextrakt erweist sich bei der Herstellung von L-Glutaminsäure als besonders wirksam. An Stelle dieser organischen Nährstoffe läßt sich die L-Glutaminsäure aber auch mit hoher Ausbeute unter Zugabe der verschiedensten Vitamine, Aminosäuren, Nucleinsäurebasen u. dgl. erhalten. Während des Verlaufs der Fermentation sind aerobe Züchtungsbedingungen erforderlich, und es ist wichtig, einen pH-Wert von 5,0 bis 9,0, insbesondere von 7,0 bis 8,0 aufrechtzuerhalten, was z. B. durch Zugabe eines Ammoniumsalzes, von Ammoniak oder von Harnstoff während des Züchtens erfolgen kann.

Verschiedene bekannte Verfahrensweisen, die sich bei der Herstellung von Glutaminsäure aus saccharidartigen Materialien mit Hilfe von Mikroorganismen als brauchbar erwiesen haben, können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden. So kann sich — wenn für die Fermentation schädliche Faktoren vorliegen — die Zugabe; von Antibiotica, wobei hauptsächlich Penicilline in Frage kommen, und/oder von oberflächenaktiven Mitteln, höheren Fettsäuren oder deren Derivaten od. dgl. in bezug auf die Bildung von L-Glutaminsäure als äußerst brauchbar erweisen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens. In den Beispielen besteht zwischen Gewichtsteilen und Volumteilen die gleiche Beziehung wie zwischen Gramm und Kubikzentimeter.

Beispiel 1

200 Volumteile eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung:

Gewichtsprozent

KH₂PO₄ 0,1

Na₂HPO₄ · 12H₂O 0,1

MgSO₄-7H₂O 0,1

FeSO₄ · 7H,0 0,02

MnSO₄ · 4H₂O 0,002

Fleischextrakt 0,1

(NH₄J₂SO₄ 2,0

n-Undecan 5,0

Natriumazetat 1,0

Phenolrot 0,001

Rest Wasser, pH = 7,0

werden in ein Gefäß mit einem Fassungsvermögen von 2000 Volumteilen gegeben. Dieses Medium wird dann mit dem Mikroorganismenstamm Arthrobacter simplex ATCC 15 799 beimpft und der Schüttelkultur unter aeroben Bedingungen bei 30⁰C für eine Zeitdauer von 72 Stunden bei 220 Schüttelbewegungen pro Minute unterworfen. Die Ansammlung von L-Glutaminsäure erreicht 20,0 mg/ccm.

Während des Züchtens wird der pH-Wert kontrolliert und — wenn erforderlich — durch Zugabe von (NH₄J₂CO₃ bei 7,0 bis 8,0 gehalten.

Nach Beendigung des Züchtens wird die L-Glutaminsäure aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert, indem diese in an sich bekannter Weise durch ein

Kationenaustauschharz gegeben wird, wodurch die L-Glutaminsäure auf dem Harz adsorbiert wird. Die !^Glutaminsäure wird dann mit Hilfe von verdünntem wäßrigem Ammoniak eluiert und die erhaltene Lösung eingeengt und sodann gekühlt. Die abgeschiedenen Kristalle von L-Glutaminsäure werden isoliert und umkristallisiert. Die Isolierung der L-Glutaminsäure aus der Fermentationsflüssigkeit stellt als solche keinen Teil der Erfindung dar und kann auf irgendeine Weise erfolgen, wie sie aus herkömmlichen Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure bekannt ist. Irgendwelche anderen bekannten Verfahren zur Isolierung von L-Glutaminsäure aus einem Fermentationsmedium, in dem sie gebildet wurde, können ebenfalls angewendet werden.

Beispiel 2

Es wurden 10000 Volumteile eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Gewichtsprozent

KH₂PO₄ .'.... 0.1

Na₇HPO₄- 12H₇O 0,1

MgSO₄ 7H₇O 0.1

FeSO₄-7H₇O 0,02

MnSO₄ · 4H₂O 0,002

Fleischextrakt .... 0,1

(NHJ₂SO₄ 1,0

Ammoniumazetat (berechnet als

Essigsäure) 1,0

Phenolrot 0,001

Rest Wasser, pH = 7,0

und durch Erhitzen in einem Fermentationsbehälter, der ein Fassungsvermögen von 20000 Volumteilen aufwies, sterilisiert.

Corynebacterium hydrocarboclustus ATCC 15 592 wird durch aerobe Schütlelkultur in einem flüssigen Impfmedium, das 1 Gewichtsprozent Kerosin (Erdöldestillationsfraktion), (die im wesentlichen aus einem Gemisch von n-C₁₂- bis n-C^-Paraffinkohlenwasserstoffen besteht, Siedepunkt etwa 200 bis 300° C) enthält, 24 Stunden vorgezüchtet.

Die auf diese Weise erhaltene Vorkultur wird in das in dem obengenannten Fermentationsbehälter befindliche sterilisierte Nährmedium in einem Mengenanteil von etwa 5 Volumprozent eingeführt, und es wird 72 Stunden bei 30 C unter Rühren mit etwa 300 Umdrehungen pro Minute gezüchtet, während 1 1 bakterienfreier Luft je Liter Medium und je Minute eingeleitet wird. .

Beginnend mit der 12. Stunde dieses Züchtens in dem Fermentationsbehälter wird Kerosin zu dem Medium in einer Menge von etwa 1,2 Gewichtsprozent alle 12 Stunden in einer solchen Weise gegeben, daß am Ende der Züchtungszeit insgesamt 5 Gewichtsprozent zugegeben worden sind. Während des Züchtens wird gleichzeitig mit dem Kerosin (NH₄J₂CO₃ zugegeben, um den pH-Wert der Nährmediumsfiüssigkeit bei 7,8 zu halten.

Die gebildete Menge an L-Glutaminsäure beträgt am Ende der Fermentation 15,1 mg/cem.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit der Abänderung wiederholt, daß 0,1% Fleischextrakt durch" 0,3% Maisquellwasser und 1% Natriumacetal (berechnet als Essigsäure) durch 1% Ammoiiiumacetal (berechnet als Essigsäure) ersetzt wurden und Coryne-

bacterium hydrocarboclustus ATCC 15 592 als Mikroorganismus an Stelle von Arthrobacter simplex ATCC 15 799 verwendet wurde; zusätzlich wurden in der 6. Stunde der Züchtung 50 Einheilen Penicillin G je Kubikzentimeter zugegeben. Ansonsten waten die. Züchtungsbedingungen die gleichen wie im Beispiel 1. Aus 200 ecm Fermentationsflüssigkeit wurden etwa 2,2 g L-Glutaminsäure erhalten.

ίο B e i s ρ i e 1 4

10000 Volumteile eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung wurden hergestellt:

Gewichtsprozent

KH₇PO₄ 0,1'

K₇HPO₄ 0,1

MgSO₄ -7H₇O ; 0,05

FeSO₄-7H₂O 0,02

MnSO₄-4H₂O 0,002

Fleischextrakt 0;l

(NH₄J₂SO₄ 1,0

Rest Wasser, pH etwa 7,0

Corynebacterium hydrocarboclustus ATCC 15 592 wird durch aerobe Schüttelkultur in einem flüssigen Impfmedium, das 1 Gewichtsprozent Kerosin enthält, 24 Stunden vorgezüchtet.

Die auf diese Weise erhaltene Vorkultur wird in das in dem obigen Fermentationsbehälter befindliche sterilisierte Nährmedium in einem Mengenanteil von etwa 5 Gewichtsprozent eingeführt, und es wird 96 Stunden unter Rühren bei etwa 30" C bei etwa 300 Umdrehungen pro Minute gezüchtet, während 1 1 sterilisierter Luft pro Liter Medium und pro Minute eingeleitet wird.

Zu Beginn des Züchtens werden 500 Volumteile eines Gemisches aus C,j-, C₁₂-, C₁₃-, C₁₄-, C₁₅-, C_lh-, C₁₇- und C₁₈-n-Paraffincn zugegeben, und der pH-Wert wird durch Einleiten von gasförmigem Ammoniak während dieser Zeit bei 6,8 bis 8,0 gehalten.

Die gebildete Menge an L-Glutaminsäurc betrug am Ende der Fermentationszeit 10,5 mg/ecm.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Steigerung der L-Glutaminsäurebildung bei der biochemischen Herstellung von L-Glutaminsäure durch aerobe Züchtung von n-Paraffinkohlenwasscrstoff assimilierenden Mikroorganismen in solche Kohlenwasserstoffe enthaltenden Nährmedien bei pH-Werten von 5 bis 9.

dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Arthrobacter simplex ATCC 15 799 oder Corynebacterium hydroearbocluslus ATCC 15 592 einsetzt und das Nährmcdium zusätzlich zur Paraffinkohlenwasserstoff-Kohlcnstoff-

(10 quelle Azetationen enthält, wobei die Azetationcnmenge gegenüber der Parafiinkohlenwasserstoffmenge geringer ist.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß mim die Azetationen in Form von

⁽¹5 Essigsäure oder Alkalia/.etal zuführt.

3. Verfahren nach Anspruch I und 2. dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkaliazelal Ammoniumazetat verwendet.

7 8

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, da- stoff mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen oder ein durch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium Gemisch von solchen Kohlenwasserstoffen vereine geringe Menge.Penicillin G zusetzt. wendet.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, da-

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als n-Paraffin- 5 durch gekennzeichnet, daß man als n-Paraffinkohlenwasserstoff einen n-Paraffinkohlen wasser- kohlenwasserstoffe Kerosin verwendet. .