DE1909997B - Verfahren zur Herstellung von Mikro Organismen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Mikro Organismen

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DE1909997B
DE1909997B DE1909997B DE 1909997 B DE1909997 B DE 1909997B DE 1909997 B DE1909997 B DE 1909997B
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atcc
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English (en)
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Katsunobu Kimura Kazuo Yamamoto Masaki Machida Tanaka (Japan)
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, zur Herstellung von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium bei üblichen pH- und Temperaturverhältnissen in . Gegenwart wenigstens eines gasförmigen Kohlenwasserstoffs, wie Äthan, Propan oder n-Butaii, als Hauptkohlenstoffquelle und Isolierung und Gewinnung der so erzeugten Mikroorganismen. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Nocardia paraffinica ATCC 21198, Nocardia paraffinica ATCC 21199, Nocardia butanica ATCC 21197, Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195, Brevibacterium butanicum ATCC 21196 oder Corynebacterium alkanum ATCC 21194 einsetzt.
Aus der britischen Patentschrift 1 062 816 ist es bereits bekannt, Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines gasförmigen Kohlenwasserstoffs als Hauptkohlenstoffquelle zu züchten. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von dem in dieser britischen Patentschrift beschriebenen Verfahren dadurch, daß Mikroorganismen einer neuen Species eingesetzt werden. Die Verwendung dieser Mikroorganismen ermöglicht den Einsatz beliebiger gasförmiger Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle, was gemäß der genannten britischen Patentschrift nicht möglich ist, wie auch das weiter unten folgende Beispiel 7 zeigt.
Die mikrobiologischen Eigenschaften der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sind wie folgt:
I. Nocardia paraffinica, ATCC 21198 und ATCC 21199
A. Morphologische Eigenschaften
1. Form der Mikroorganismen: Übliche kurze Stäbchen; junge Zellen zeigen den Myzeliumzustand; verzweigte und vergleichsweise lange Zellen werden gefunden. Die Bildung von Sporen hängt davon ab, ob das Myzelium aufbricht.
2. Größe: 0,5 bis 0,75 · 2,5 bis 16,0 μ.
3. Bewegungsvermögen; Nicht beweglich.
4. Sporen: gebildet.
5. Flagellum: Nicht gebildet.
6. Gramfärbung: Positiv.
7. Säurebeständige Verfärbung: Positiv.
B. Züchtungseigenschaften
1. Das Wachstum erfolgt in einer Fleischbrühenagarplattenkultur sehr langsam (kreisförmig, runzelig, wellenförmig, nabeiförmig, gelblichrot, glanzlos und undurchsichtig).
2. In einer Fleischbrühenagarschrägkultur verläuft das Wachstum langsam (fadenförmig, glanzlos, gelblichrot, geruchlos, brüchig). Das Kulturmedium wird nicht verändert.
3. In einer Fleischbrühekultur erfolgt das Wachstum der Oberfläche häutchenartig, wobei man kaum eine Trübung und kein Absitzen feststellt.
4. In einer Gelatinestichkultur verläuft das Wachstum in dem oberen Teil besser als
in dem unteren Teil, wobei keine Verflüssigung erfolgt.
35
45
C. Physiologische Eigenschaften
1." Optimale Temperatur: 25 bis 37°C (leichtes Wachstum bei 420C).
2. Optimales pH: 6,0 bis 9,0.
3. Sauerstoffbedarf: Aerob.
4. Lackmusmilch: Nicht verändert oder alkalisch. Ί >; :: ·
5. Schwefelwasserstoff: Erzeugt.
6. Indol: Nicht erzeugt.
7. Stärke: Nicht zersetzt.
8. Nitrat wird reduziert.
9. Katalase: Positiv.
10. Erzeugung von Ammonium: Negativ.
11. Voges-Proskauer-Test: Negativ.
12. Verbrauch von Zuckern: Aus Glucose, Fructose, Mannose, Rohrzucker, Mannit und Sorbit wird Säure erzeugt.
13. Kohlenwasserstoff-assimilierende Eigenschaften: Assimilieren Äthan, Propan, η-Butan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan und n-Heptadecan.
Nocardia paraffinica ATCC 21198 und ATCC 21199 sind, soweit Untersuchungen ergeben haben, nur in der Konsistenz des Schrägagars verschieden. ATCC 21198 ist brüchig, während ATCC 21199 butterartig ist.
II. Nocardia butanica, ATCC 21197
A. Morphologische Eigenschaften
1. Form der Mikroorganismen: Gewöhnlich kurze Stäbchen; junge Zellen zeigen Myzeliumzustand; verzweigte und vergleichsweise lange Zellen werden festgestellt. Die Bildung von Sporen hängt davon ab, ob das Myzelium aufbricht.
2. Größe: 0,5 bis 0,75 · 2,5 bis 16,0 μ.
3. Bewegungsvermögen: Nicht beweglich.
4. Sporen: Gebildet.
5. Flagellum: Nicht gebildet.
6. Gramverfärbung: Positiv.
7. Säurebeständige Verfärbung: Positiv.
B. Züchtungseigenschaften
1. In einer Fleischbrühenagarplattenkultur ist das Wachstum ein wenig langsam (kreisförmig, runzelig, wellenförmig, nabelförmig, matt rot, glanzlos und undurchsichtig).
2. In einer Fleischbrühenagarschrägkultur verläuft das Wachsen langsam (fadenförmig, glanzlos, matt rot, geruchlos, brüchig). Das Kulturmedium wird nicht verändert.
3. In einer Fleischbrühenkultur verläuft das Wachstum der Oberfläche häutchenf örmig, wobei die Brühe praktisch klar ist und keine Ablagerung gefunden werden kann.
4. In einer Gelatinestichkultur verläuft das Wachstum in dem oberen Teil besser als in dem unteren Teil, wobei man keine Gelatineverflüssigung feststellt.
C. Physiologische Eigenschaften
1. Optimale Temperatur: 25 bis 35°C (leichtes Wachstum bei 42° C).
2. Optimales pH: 6,0 bis 9,0.
3. Sauerstoffbedarf: Aerob.
4. Lackmusmilch: Nicht verändert oder alkalisch.
5. Schwefelwasserstoff: Erzeugt.
6. Indol: Nicht erzeugt.
7. Stärke: Nicht zersetzt.
8. Nitrat wird reduziert.
9. Katalase: Positiv.
10. Erzeugung von Ammonium: Negativ.
11. Voges-Proskauer-Test: Negativ.
12. Verbrauch von Zuckern: Säure wird aus Glucose, Fructose, Arabinose, Mannose, Rohrzucker, Galactose, Xylose, Mannit und Sorbit erzeugt.
13. Kohlenwasserstoff-assimilierende Eigenschaften: Assimilieren Äthan, Propan, η-Butan, n-Octan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan und n-Heptadecan.
Die taxonomischen Stellungen beider Mikroorganismen werden gemäß Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe, bestimmt.
Beide Bakterien gehören zu der Ordnung Actinomycetales, da ihre Zellen steif sind und in einigen Wachstumsphasen eine verzweigte myzeliumähnliche Struktur gebildet wird. In dieser Ordnung gehören sie zu der Familie Actinomycetaceae, da ein echtes Myzelium erzeugt wird und zusätzlich Sporen durch Aufbrechen des Myzeliums gebildet werden. Darüber hinaus gehören sie in dieser Familie zu dem Genus Nocardia, da sie in obligatorischer Weise aerob und säurebeständig sind. In diesem Genus kommen sie Nocardia asteroides, Nocardia polychromogenes, Nocardia caprae und Nocardia minima am nächsten. Wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht, unterscheiden sie sich von Nocardia asteroides in ihrer Farbe, in ihrem Wachstum, in einem Glucosemedium
ίο sowie hinsichtlich ihrer optimalen Wachstumstemperatur. Von Nocardia polychromogenes unterscheiden sie sich hinsichtlich Farbe, optimaler Wachstumstemperatur und Wirkung gegenüber Milch. Der Unterschied zu Nocardia caprae besteht in dem Wachstum in einem Glucosemedium sowie in einem Fleischbrühenmedium, in der Erzeugung eines Luftmyzeliums, in der Einwirkung gegenüber Milch sowie hinsichtlich einer säurebeständigen Verfärbung. Gegenüber Nocardia minima besteht ein Unterschied hinsichtlich Farbe, optimaler Wachstumstemperatur und säurebeständiger Verfärbung. Ferner besitzen diese neuen Bakterien ein Assimilationsvermögen für gasförmige Kohlenwasserstoffe. Sie können als eine neue Spezies betrachtet werden.
Sie unterscheiden sich voneinander in ihrer Farbe, Größe zu Beginn des Züchtens sowie in ihrem Zuckerverbrauch. Daher wurden sie als Nocardia paraffinica bzw. Nocardia butanica bezeichnet.
Tabelle I
Nocardia
asteroides		 Nocardia
polychromogenes		 Nocardia caprae Nocardia
minima		 Nocardia
paraffinica
ATCC 21198
ATCC 21199		 — Nocardia
butanica
ATCC 21197		 + .
Farbe Leicht gelbes Zuerst farb Gelblichrot — Mattrot -j-
Wachstum, los. In der —
wird tiefgelb letzten
bis gelblich Wachstums
rot periode
fleischrot
oder koral
lenrot
Wachstum in Bilden dünne Geringfügige Bilden gelb Bilden matt
einem Glucose gelbliche Ablagerung lichrote rote Häut
medium Häutchen feiner Flok- Häutchen. chen. Keine
ken. Bildung Keine Ab Ablagerung,
von Luft- lagerung, die die Brühe ist
myzeln Brühe ist praktisch klar
praktisch klar
Wachstum in Mäßig, Flok- desgl. desgl.
einem Fleisch kenablage-
brühemedium rung. Bildung
von Luft-
myzeln
Optimale Wachs 370C 22 bis 250C 22 bis 25° C 25 bis 37°C 25 bis 35°C
tumstemperatur
Wirkung gegen Wachsen Verfestigen Nicht ver Nicht ver
über Milch ändert ändert
Säurebeständige Leicht Die meisten Säurebestän Säurebestän
Verfärbung sind nicht dig dig
säurebestän
dig
Verbrauch von
Zuckern —
Arabinose
Galactose
Xylose
Corynebacterium alkanium ATCC 21194, Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195 und Brevibacterium butanicum ATCC 21196 werden jeweils aus dem Erdboden isoliert. Ihre mikrobiologischen Eigenschaften werden nachstehend angegeben:
I. Corynebacterium alkanium, ATCC 21194 A. Morphologische Eigenschaften
1. Form der Mikroorganismen: Gewöhnlich kurze Stäbchen; häufig werden unvollständige Spaltungszellen, verzweigte Zellen und V-artige Spaltungszellen beobachtet.
2. Größe: 0,5-2,5 bis 5,0 μ.
3. Bewegungsvermögen: Nicht beweglich.
4. Sporen: Nicht gebildet.
5. Flagellum: Nicht gebildet.
6. Gramverfärbung: Positiv.
7. Säurebeständige Verfärbung: Negativ.
Ίϊ. Züchtungseigenschaften
1. In einer Fleichbrühenagarplattenkultur mäßiges Wachstum (kreisförmig, glatt, vollständig, konvex, gelblichgrau, funkelnd und undurchsichtig).
2. In einer Fleischbrühenschrägagarkultur mäßiges Wachstum (fadenförmig, funkelnd, gelblichgrau, geruchlos, butterartig). Das Kulturmedium wird nicht verändert.
3. In einer Fleischbrühenkultur verläuft das Wachstum der Oberfläche langsam, wobei sich die Brühe etwas eintrübt.
4. In einer Gelatinestichkultur erfolgt ein geringfügiges Wachstum in dem oberen Teil, wobei keine Gelatineverflüssigung festzustellen ist.
C. Physiologische Eigenschaften
1. Optimale Temperatur: 25 bis 300C. Das Wachsen erfolgt extrem leicht bei 35° C.
2. Optimales pH: 5,0 bis 9,0 (kein Wachstum bei einem pH von 4,0).
3. Sauerstoffbedarf: Aerob.
4. Lackmusmilch: Nicht verändert oder alkalisch.
5. Schwefelwasserstoff: Erzeugt.
6. Indol: Nicht erzeugt.
7. Stärke: Nicht zersetzt.
8. Nitrat wird reduziert.
9. Katalase: Positiv.
10. Erzeugung von Ammonium: Negativ.
11. Voges-Proskauer-Test: Negativ.
12. Verbrauch von Zuckern: Säure wird aus Glucose, Fructose, Mannose, Rohrzucker, Lactose, Mannit und Sorbit erzeugt.
13. Kohlenwasserstoff assimilierende Eigenschaften: Assimilieren Propan, n-Butan, N-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan und n-Heptadecan.
II. Brevibacterium butanicum, ATCC 21196 A. Morphologische Eigenschaften
1. Form der Mikroorganismen: Gewöhnlich kurze Stäbchen; häufig werden unvollständige Spaltungszellen und V-artige Spaltungszellen gebildet, wobei jedoch keine verzweigten Stellen festgestellt werden.
2. Größe: 0,5 · 3,0 bis 6,0 μ.
3. Bewegungsvermögen: Nicht beweglich.
4. Sporen: Nicht gebildet.
5. Flagellum: Nicht gebildet.
6. Gramverfärbung: Positiv.
7. Säurebeständige Verfärbung: Negativ.
B. Züchtungseigenschaften
1. In einer Fleischbrühenagarplattenkultur übermäßiges Wachstum (kreisförmig, glatt, vollständig, buckelig, hellbraun, matt und undurchsichtig).
2. In einer Fleischbrühenagarschrägkultur übermäßiges Wachstum (stachelig, matt, hellbraun, geruchlos, butterartig). Das Kulturmedium wird nicht verändert.
3. In einer Fleischbrühekultur erfolgt das Wachstum der Oberfläche häutchenartig. Die Brühe ist praktisch klar, wobei keine Ablagerung festgestellt wird.
4. In einer Gelatinestichkultur verläuft das Wachstum am besten in dem oberen Teil, wobei keine Gelatineverflüssigung festgestellt wird.
C. Physiologische Eigenschaften
1. Optimale Temperaturen: 25 bis 3O0C,
leichtes Wachstum bei 370C.
. 2. Optimales pH: 6,0 bis 9,0.
3. Sauerstoffbedarf: Aerob.
4. Lackmusmilch: Nicht verändert oder alkalisch.
5. Schwefelwasserstoff: Erzeugt.
6. Indol: Nicht erzeugt.
7. Stärke: Nicht zersetzt.
8. Nitrat wird reduziert.
9. Katalase: Positiv.
10. Erzeugung von Ammonium: Negativ.
11. Voges-Proskauer-Test: Negativ.
12. Verbrauch von Zuckern: Säure wird aus Glucose, Fructose, Arabinose, Mannose, Rohrzucker, Xylose, Mannit und Sorbit erzeugt.
13. Kohlenwasserstoff assimilierende Eigenschaften: Assimilieren Propan, n-Butan, n-Decan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan und n-Heptadecan.
III. Brevibacterium paraffinolyticum, ATCC 21195 A. Morphologische Eigenschaften
1. Form der Mikroorganismen: Stäbe, häufig V-artige Spaltungszellen, wobei jedoch keine verzweigten Zellen gefunden werden.
2. Größe: 0,5-2,5 bis 5,0 μ.
3. Bewegungsvermögen: Nicht beweglich.
4. Sporen: Nicht gebildet.
5. Flagellum: Nicht gebildet.
6. Gramverfärbung: Positiv.
7. Säurebeständige Verfärbung: Negativ.
7 8
B. Züchtungseigenschaften Wachstum und GelatineverMssigung vorhanden Dar-
über hinaus liegt em Unterschied von den vorstehend
1. In einer Fleischbrüheagarplattenkultur erwähnten zwei Spezies vor, und zwar hinsichtlich übermäßiges Wachstum (kreisförmig, glatt, der Konsistenz des Schrägagars sowie der Assivollständig, konvex bis kopfförmig, hell- 5 milationseigenschaften für gasförmige und flüssige rosa, funkelnd und undurchsichtig). Kohlenwasserstoffe. Daher kann man von einer
2. In einer Fleischbrüheschrägagarkultur neuen Spezies sprechen. Diese Spezies wurde als übermäßiges Wachstum (fädchenförmig, Corynebacterium alkanum, ATCC 21194 bezeichnet, funkelnd, gelblich grau, geruchlos, butter- Die taxonomische Stellung von Brevibacterium artig). Das Kulturmedium wird nicht ver- 10 butanicum, ATCC 21196, wird in der vorstehend ändert beschriebenen Weise bestimmt. Es gehört zu der
3. In einer Fleischbrühekultur erfolgt das Familie Brevibacteriaceae und zwar aus folgenden Wachstum an der Oberfläche langsam, Gründen: Vorliegen von Stabchenzellen, Saureunbewobei sich die Brühe mäßig eintrübt. standigkeit, keine Bildung von Tncnomen, Gram-
_ , . .,,, „, , 15 positiv, keine Bildung von Endosporen und keine
4. In einer Gelatmestichkultur erfolgt das BM von verzweigten Zellen. In dieser Familie Wachstum am oberen Teil leicht Eine hört es zu dem Genus Brevibacterium, und zwar Gelatmeverflussigung wird nicht festge- wegen der nicht verzweigten Stäbchen, die keine
Fäden bilden. In diesem Genus kommt es Brevi-
C. Physiologische Eigenschaften 20 bacterium maris, Brevibacterium fuscum und Brevi-
bacterium ammomagenes (vgl. die folgende Tabelle)
1. Optimale Temperatur: 25 bis 300C. Das am nächsten. Wie jedoch aus dieser Tabelle hervor-Wachstum erfolgt sehr leicht bei 350C. geht, besteht ein Unterschied zu Brevibacterium maris
2. Optimales pH: 5,0 bis 9,0 (kein Wachs- hinsichtlich Größe, Farbe und Höhe der Kolonien, tum bei einem pH von 4,0). 25 der Erzeugung von Schwefelwasserstoff sowie der
3. Sauerstoffbedarf: Aerob. Wirkung auf Rohrzucker. Ferner besteht ein Unter-
4. Lackmusmilch: Nicht verändert oder al- 8^ zu Brevibacterium fuscum hinsichtlich Größe kaiisch Farbe und Hohe der Kolonien sowie hinsichtlich
5. Schwefelwasserstoff: Erzeugt. ^ines Wachstums einer Stichkultur sowie einer Fleisch-
30 bruhekultur. Der Unterschied zu Brevibacterium
6. Indol: Nicht erzeugt. ammoniagenes liegt in der Größe, in der Höhe sowie
7. Stärke: Nicht zersetzt. in der Farbe der Kolonien sowie ferner in der Kono _T. -JJ- sistenz der Kolonien sowie in bezug auf die Assi-
8. Nitrat wird reduziert. milationseigenschaften für gasförmige und flüssige
9. Katalase: Positiv. 35 Kohlenwasserstoffe. Daher kann man von einer
10. Erzeugung von Ammonium: Negativ. neuen SP^s^J6?' di\als Brevibacterium buta
nicum, ATCC 21196 bezeichnet worden ist.
11. Voges-Proskauer-Test: Negativ. Die taxonomische Stellung von Brevibacterium
12. Verbrauch von Zuckern: Säure wird aus paraffinolyticum, ATCC 21195, wird in der vor-Glucose, Fructose, Rohrzucker, Lactose, 4° stehend beschriebenen Weise bestimmt. Es gehört Mannit und Sorbit erzeugt. zu der Familie Brevibacteriaceae, und zwar aus fol-
13. Kohlenwasserstoff assimilierende Eigen- genden Gründen: Stäbchenzellen, Säureunbeständigschaf ten: Assimilieren Propan, η-Butan, keit, keine Bildung von Trichomen, Grampositiv, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Te- keine Bildung von Endosporen und keine Bildung tradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan und 45 von verzweigten Zellen. In dieser Familie gehört es n-Heptadecan. zu dem Genus Brevibacterium, und zwar wegen der
nicht verzweigten Stäbchen, die keine Fäden bilden.
Die taxonomische Stellung von Corynebacterium In diesem Genus kommt es Brevibacterium maris, alkanum, ATCC 21194 wird nach Bergey's Manual Brevibacterium fuscum und Brevibacterium amof Determinative Bacteriology, 7. Ausgabe, bestimmt, 5° moniagenes am nächsten. Wie aus der folgenden und zwar in Abhängigkeit von den vorstehend erwähn- Tabelle hervorgeht, unterscheidet es sich von Breviten Eigenschaften. Es gehört zu der Familie Coryne- bacterium maris hinsichtlich Größe, Farbe, Wachsbacteriaceae, und zwar im Hinblick auf die Stab- tum in einer Fleischbrühenkultur, Wirkung auf Rohrzellen, die Säureunbeständigkeit, das Fehlen einer zucker und Erzeugung von Schwefelwasserstoff. Bildung von Trichomen, die Grampositivität, das 55 Gegenüber Brevibacterium fuscum besteht ein Unter-Fehlen einer Vergärung von Zuckern unter aeroben schied hinsichtlich Größe und Wachstum in einer Bedingungen, das Fehlen einer Bildung von Endo- Gelatinestichkultur. Darüber hinaus besteht ein Untersporen und des Bildens einer Zellenverzweigung. In schied gegenüber Brevibacterium ammoniagenes hindieser Familie gehört es zu dem Genus Corynebac- sichtlich Größe, Farbe sowie Konsistenz der Kolöterium, da es eine gekrümmte und V-artige Spaltung 60 nien und der Assimilationseigenschaften für gasförzeigt, wobei der Katalasetest positiv ist. In diesem mige und flüssige Kohlenwasserstoffe. Daher kann Genus kommt Corynebacterium am nächsten Coryne- man von einer neuen Spezies sprechen. Diese wurde bacterium agropyri und Corynebacterium rathayi, als Brevibacterium paraffinolyticum, ATCC 21195, wobei jedoch ein Unterschied von Corynebacterium bezeichnet. Brevibacterium butanicum, ATCC 21196, agropyri hinsichtlich der Größe, der Gramverfärbung 65 und Brevibacterium paraffinolyticum, ATCC 21195, und des Wachstums in einer Fleischbrüheschrägagar- sind voneinander verschiedene Spezies, da sie sich kultur besteht. Außerdem ist ein Unterschied gegen- hinsichtlich Farbe, Glanz und Zuckerverbrauch unterüber Corynebacterium rathayi hinsichtlich Größe, scheiden.
Tabelle II
10
Corynebacterium
agropyric		 Corynebacterium
rathayi		 Corynebacterium
alkanum, ATCC 21194
Größe 0,4 bis 0,6 · 0,6
bis 1,1 μ		 0,6 bis 0,75 · 0,75
bis 1,5 μ		 0,5 · 2,5 bis 5,0 μ
Farbe in einer Fleischbrüheschräg-
agarkultur		 gelb gelb gelblichgrau
Gramverfärbung wechselnd positiv positiv
Zuckerverbrauch
Glucose
Rohrzucker
Lactose		 Säure wird erzeugt
Säure wird erzeugt		 Säure wird erzeugt
Säure wird erzeugt
Säure wird erzeugt		 Säure wird erzeugt
Säure wird erzeugt
Säure wird erzeugt
Zersetzungsvermögen von Stärke schwach — keines
Gelatinestichkultur
Farbe und Wachstum in einer
Fleischbrüheagarplattenkultur		 nicht verflüssigt
gelb
langsam
sehr zähes Wachstum		 allmählich verflüssigt
nach 7 Wochen
gelb
langsames Wachstum		 nicht verflüssigt
gelblichgrau
mäßiges Wachstum
butterartig
Tabelle III
Brevibacterium
maris		 Brevibacterium
fuscum		 Brevibacterium
ammoniagenes		 Brevibacterium
parafflnolyticum
ATCC 21195		 Brevibacterium
butanicum
ATCC 21196
Größe 0,7 bis 0,8 · 0,6 · 1,5 μ 0,8 · 1,4 bis 1,7 μ 0,5 · 2,5 bis 5,0μ 0,5 · 2,5 bis 5,0μ
1,0 bis 1,2 μ
Fleischbrühe orangegelb, bräunlichgelb, grau oder hellrosafarben, hellbraun,
agarplattenkultur konvex leicht konvex schwach gelb, konvex bis buckelig
flach kopfförmig
Gelatinestich nicht verflüssigt allmählich nicht verflüssigt nicht verflüssigt nicht verflüssigt
kultur verflüssigt
Fleischbrühe bildet ein orange bildet ein Häut mäßige Trübung das Wachsen
kultur gefärbtes Häut chen, Sediment, in der Nähe der der Oberfläche
chen und ein keine Trübung Oberfläche verläuft lang
Sediment, keine sam, mäßige
Trübung Eintrübung
Zuckerverbrauch
Rohrzucker keiner —■ — Säure wird Säure wird
erzeugt erzeugt
Lactose keiner — — Säure wird Säure wird
erzeugt nicht erzeugt
Schwefelwasser nicht erzeugt — — erzeugt erzeugt
stoff
Zur Durchführung der Gärung kann entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Nährmedium verwendet werden, sofern es die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismen-Stamms wesentlichen Nährmittel enthält. Derartige Nährmittel sind bekannt. Es handelt sich beispielsweise um Substanzen, wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen od. dgl., wobei diese Substanzen von den eingesetzten Mikroorganismen in den entsprechenden Mengen verbraucht werden.
Die erfindungsgemäße Gärung wird in einem wäßrigen Nährmedium durchgeführt, das einen gasförmigen Kohlenwasserstoff oder eine Mischung aus gasförmigen Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstofiquelle enthält. Von den verwendeten gasförmigen Kohlenwasserstoffen seien Äthan, Propan und Butan
erwähnt. Kohlenstoffquellen, die in kleinen Mengen in dem Gärungsmedium verwendet werden können, sind beispielsweise flüssige Kohlenwasserstoffe, wie z. B. n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan, n-Heptadecan od. dgl., Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Rohrzucker, Stärkehydrolysat, Melassen od. dgl., oder andere geeignete Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Glyzerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren od. dgl.
Als Stickstoffquelle kommen verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff, Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat od. dgl. Außerdem kann man eine oder mehrere Aminosäuren verwenden. Ferner können
natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, eingesetzt werden, beispielsweise Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Pepton, Fleischbrühe, Kaseinhydrolysate, lösliche Fischbestandteile, Reiskleieextrakt od. dgl. Diese Substanzen können ebenfalls entweder für sich allein oder in Kombination aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden.
Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium in entsprechenden Mengen zugesetzt werden können, sind beispielsweise Phosphate, wie z. B. Natriumphosphat, Dinatriummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogen-. phosphat, Metallverbindungen, wie beispielsweise Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Kobaltchlorid, Nickelchlorid, Calciumchlorid, Calciumcarbonat, Borsäure, Natriummolybdat od. dgl. Es kann ferner notwendig sein, bestimmte wesentliche Nährmittel dem Kulturmedium zuzusetzen, und zwar je nach dem eingesetzten Mikroorganismus, wobei beispielsweise Aminosäuren, wie z. B. Asparaginsäure, Threonin, Methionin od. dgl., und/oder Vitamine, beispielsweise Biotin, Thiamin, Kobalamin od. dgl., erwähnt seien.
Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen bei einer Züchtungstemperatur von ungefähr 20 bis 500C und bei einem pH von ungefähr 4,0 bis 9,0 durchgeführt. Der verwendete gasförmige Kohlenwasserstoff wird in gasförmigem Zustand zugeführt. Er wird mit Luft oder Sauerstoff vermischt verwendet. Beispielsweise seien als verwendete gasförmige Kohlenwasserstoffe Äthan, Propan und Butan erwähnt. Die Gaskonzentration unterliegt keinen besonderen Beschränkungen.
Verschiedene Gärungsmethoden, die bei der Durchführung üblicher Gärungsverfahren unter Verwendung von Saccharinmaterialien oder flüssigen Kohlenwasserstoffen als Hauptkohlenstoffquellen angewendet werden, können ausgeübt werden. Beispielsweise kann die Gärungsgeschwindigkeit durch Zugabe von kleinen Mengen an verzweigtkettigen flüssigen Kohlenwasserstoffen erheblich beschleunigt werden. Ferner können Substanzen, die eine ähnliche Wirkung besitzen, oder grenzflächenaktive Mittel zur Erhöhung der Auflösungsgeschwindigkeit der gasförmigen Kohlenwasserstoffe in dem Kulturmedium zugesetzt werden. Nach Beendigung der Gärung können die Mikroorganismenzellen von der Kulturbrühe nach üblichen Methoden abgetrennt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf Gewichts-/ Volumprozent.
B ei s ρ i el 1
2,7 1 eines Kulturmediums, das aus 0,05 % KH2PO4, 0,05% Na2HPO4 · 12 H2O, 0,01% MgSO4 · 7 H2O, 0,001 % MnSO4 · 4 H2O, 0,001 % FeSO4 · 7 H2O, 0,001% ZnSO4 · 7 H2O, 0,001% CaCl2 · 2 H2O, 10 y/1 H3BO3, 10 y/1 Na2MoO4 · 2 H2O, 50 y/1 CuSO4 · 5 H2O, 10 y/1 CoCl2 · 2 H2O, 50 y/1 NiCl2 · 6 H2O, 0,05% Maisquellwasser und 0,2% NH4NO3 bei einem pH von 7,2 besteht, werden in ein 5-1-Gärungsgefäß gegeben und sterilisiert.
Nocardia paraffinica, ATCC 21198, wird zuvor unter Schütteln in einem Kulturmedium gezüchtet, das 0,25% Hefeextrakt, 0,5 % Fleischextrakt, 0,5% Pepton, 0,25 % Natriumchlorid und 2,0 % Sorbit enthält. Das pH dieses Mediums beträgt 7,2, wobei das Züchten 24 Stunden lang durchgeführt wird. Diese Bakterien werden auf das erste Kulturmedium in einer Menge von 10% aufgeimpft und bei 30° C unter Rühren (ungefähr 600 Upm) gezüchtet. Dabei erfolgt eine Belüftung mit 11/1 pro Minute eines gemischten Gases (die Konzentration an n-Butan in Luft beträgt 1,3%) während einer Zeitspanne von 72 Stunden. Das pH wird während des Züchtens
ίο durch Zugabe von Ammoniakwasser auf einem Wert von 7,2 gehalten.
Nach Beendigung des Züchtens beträgt die angewachsene Menge des Bakteriums 10 mg in Form von getrockneten Zellen pro ml des Mediums. 30 g der Zellen werden nach einem Abzentrifugieren, Waschen mit Wasser und Trocknen erhalten.
B ei sp iel 2
Nocardia butanica, ATCC 12197, wird in der gleichen Weise wie im Beispiel! beschrieben gezüchtet, wobei mit einem gemischten Gas (die Konzentration des Propans in der Luft beträgt 1,5%) während einer Zeitspanne von 72 Stunden belüftet wird, mit der Ausnahme, daß Propan als Kohlenstoffquelle verwendet wird. Nach Beendigung des Züchtens beträgt die angewachsene Menge des Bakteriums in Form von getrockneten Zellen 10 mg/ml des Mediums.
Beispiel 3
Nocardia paraffinica, ATCC 21199, wird nach der im Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise gezüchtet, mit der Ausnahme, daß eine hohe Konzentration an η-Butan als Kohlenstoffquelle verwendet wird. Unter Verwendung eines gemischten Gases wird belüftet (die Konzentration an η-Butan in Luft beträgt 20%)· Nach 72stündigem Züchten werden 25 mg der getrockneten Zellen/ml des Mediums erhalten.
Beispiel 4
Brevibacterium paraffinolyticum, ATCC 21195, wird nach der im Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweise gezüchtet, wobei ein Kulturmedium verwendet wird, das aus 0,05% KH2PO4, 0,05% Na2HPO4 · • 12 H2O, 0,01% MgSO4 · 7 H2O, 0,001% MnSO4 · 4 H2O, 0,001% FeSO4 · 7 H2O, 0,001% ZnSO4 · 7 H2O, 0,001% CaCl2 · 2 H2O, 10 y/1 H3BO3, 10 y/1 Na2MO4 · 2 H2O, 50 y/1 CuSO4 · 5 H2O, 10 y/1 CoCl2 · 2 H2O, 50 y/1 NiCl2 · 6 H2O, 0,05% Maisflüssigkeit und 0,2% (NH^2SO4 besteht, mit der Ausnahme, daß ein gemischtes Gas mit einer 50%igen Butankonzentration in Luft zur Belüftung verwendet wird. Nach 96stündigem Züchten werden 4 mg der getrockneten Zellen/ml des Mediums erhalten.
B ei s pi el 5
Brevibacterium butanicum, ATCC 21196, wird
nach der im Beispiel 4 beschriebenen Arbeitsweise gezüchtet. Nach 96stündigem Züchten werden 5 mg der getrockneten Zellen/ml des Mediums erhalten.
Beispiel 6
Corynebacterium alkanum, ATCC 21194, wird nach der im Beispiel 4 beschriebenen Arbeitsweise gezüchtet. Nach einem 96stündigen Züchten werden 3 mg der getrockneten Zellen/ml des Mediums erhalten.
Beispiel 7
Es wurde ein Vergleichsversuch durchgeführt, wobei Micrococcus cerificans, ATCC 14987, gemäß der britischen Patentschrift 1062 816 verwendet wurde. Dieser Mikroorganismus wurde parallel zu erfindungsgemäßen Mikroorganismen gezüchtet, wobei zwei gasförmige Kohlenwasserstoffe, und zwar Propan und Butan, als Kohlenstoff quelle verwendet wurden. Während die Zellen der erfindungsgemäßen Mikroorganismen in der Kulturbrühe in der in den Beispielen gezeigten Weise angereichert wurde, vermochte der Mikroorganismus Micrococcus cerificans ATCC 14987 Propan und Butan nicht zu assimilieren, so daß keine Zellen erhalten wurden.
Daraus ist zu ersehen, daß bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beliebige gasförmige Kohlenwasserstoffe als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden können. Man braucht daher erfin-
dungsgemäß im Hinblick auf die jeweils verwendete gasförmige Kohlenstoffquelle keinerlei Auswahl zu treffen.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium bei üblichen pH- und Temperaturverhältnissen in Gegenwart wenigstens eines gasförmigen Kohlenwasserstoffs,
    ίο wie Äthan, Propan oder η-Butan, als Hauptkohlenstoffquelle und Isolierung und Gewinnung der so erzeugten Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Nocardia paraffinica ATCC 21198, Nocardia paraffinica ATCC 21199, Nocardia butanica ATCC 21197, Brevibacterium paraffinolyticum ATCC 21195, Brevibacterium butanicum ATCC 21196 oder Corynebacterium alkanum ATCC 21194 einsetzt.

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