DE1642708B2

DE1642708B2 - Verfahren zur Herstellung von Trehalose durch Fermentation

Info

Publication number: DE1642708B2
Application number: DE1642708A
Authority: DE
Inventors: Takeo Suzuki; Katsunobu Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1966-07-04
Filing date: 1967-07-03
Publication date: 1974-03-28
Also published as: US3655512A; DE1642708C3; GB1174322A; DE1642708A1

Description

mentationsflüssigkeit gewinnt. salze mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, die Polyoxy-

IS äthylenalkylamine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, die Polyoxyäthylenalkylallyläther mit 8 bis 18 Koh-

: lenstoffatomen, die AlkyltrimethylammoD; umhalo-

genide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, die Alkylbenzyldimethylammoniumhalogenide mit 12 bis

Die lirfindung betrifft ein Verfahren zur Her- 20 18 Kohlenstoffatomen, die Alkylpyridiniumhalostellung von Trehalose durch Fermentation. Dieses genide mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, die Alkyl-Verfahren liefert gute Ausbeuten an Trehalose. betaine mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, yerschie-Aus Naturprodukten sind bei technischen Gewin- dene höhere Fettsäuren, wie Ölsäure, Palmitinsäure, nungsverfahren nur sehr bescheidene Mengen an Stearinsäure usw., oder ihre Alkali- oder Erdalkali-Trehalose zu gewinnen. Es bestand daher ein Be- 25 salze, ferner Sorbitanmonooleat, Ester höherer Fettdürfnis nach einem Verfahren zur Herstellung von säuren, z. B. ölsäureester von Polyoxyäthylenglykol, Trehalose, welches die Erzielung guter Ausbeuten die Palmilinsäureester von Polyoxyäthylenglykol gestattet. Dieses Verfahren zu entwickeln, war der usw. und ähnliche. Typische Beispiele solcher obervorliegenden Erfindung zur Aufgabe gestellt, fiächenaktiven Mittel sind Polyoxyäthylenalkylamin, Es ist bekannt, bestimmte Mikroorganismen, wie 30 Polyoxyäthylenoleyläther, Sorbitanmonolaurat, PoIy-Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 15 592 oxyäthylensorbitanmonostearat, Polyoxyäthylenin einem wäßrigen, Kohlenwasserstoffe und Anti- sorbitanmonolaurat, Polyoxyäthylensorbitanmonobiotika erhaltenden Nährmedium zu züchten. In der pahnitat, Polyoxyäthylenalkylamid usw.
französischen Patentschrift 1 426 792 wird diese Der Zeitpunkt, zu dem diese Zusatzstoffe dem Züchtung zur biotechnischen Herstellung von L-Glut- 35 Züchtungsmedium zugesetzt werden, variiert in Abaminsäure vorgesehen; das hierbei venvendete Nähr- hängigkeit von dem speziellen verwendeten Typ. medium enthält Thiamin und n-Undecan in bestimm- Jedoch wird die größte Wirkung festgestellt, wenn ten Konzentrationen. Ziel der Erfindung war die man die Zusatzstoffe zu demselben Zeitpunkt hinzu-Entwicklung eines Verfahrens zur biotechnischen fügt, zu dem der Mikroorganismus in das Züchtungs-Herstellung von Trehalose, das in industriellem Maß- 40 medium eingeimpft wird oder während des Anfangsstab in wirksamer und einfacher Weise, bei niedrigen stadiums der Züchtung. Es wird darauf hingewiesen, Kosten und mit hohen Produktausbeuten durchführ- daß erwünschtenfalls eine Mischung zweier oder bar sein sollte. mehrerer der Antibiotika oder der oberflächenaktiven Der Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Mittel dem Züchtungsmedium zugesetzt werden Herstellung von Trehalose durch Fermentation, wel- 45 kann, wobei solche Kombinationen ebenfalls eine ches dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Mi- signifikante Beschleunigung der Produktion von kroorganismus Arthrobacter paraffineus ATCC Trehalose bei der Fermentation ergeben.
15 591 in einem Nährmedium, das wenigstens einen Die günstige Menge des verwendeter Zusatzstoffes Kohlenwasserstoff als Hauptkohienstoffquelle ent- kann innerhalb weiter Grenzen variiert werden, muß hält, züchtet und daß man mindestens ein Anti- 50 jedoch natürlich eine solche sein, daß das Wachstum biotikum oder mindestens ein oberflächenaktives des Arthrobacter paraffineus ATCC 15 591 nicht Mittel oder ein Gemisch davon dem Nährmedium gehemmt wird. Die Variierung der Mengen hängt hinzufügt und daß man schließlich die Trehalose aus von den besonderen Arten der Zusatzstoffe ab. der Fermentationsflüssigkeit gewinnt. Optimal ist eine Gesamtmenge von 50 bis 2000 ng

Es zeigte sich, daß durch Züchten des Mikro- 55 Gesamtzusatzstoff pro 1 ml Züchtungslösung.

Organismus Arthrobacter paraffineus 15 591 die bio- Sowohl ein synthetisches als auch ein natürliches

technische Herstellung von Trehalose in einem Züchtungsmedium ist für das erfindungsgemäße Ver-

wenigstens einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlen- fahren geeignet, sofern es die für das Wachstum der

stoffquelle enthaltenden Nährmedium möglich ist. Arthrobacter paraffineus ATCC 15 591 wesentlichen

Genauere Untersuchungen über die produzierten 60 Nährstoffe enthält. Solche Nährstoffe sind in der Sacchartdarten, ihre Herstellungsbedingungen und Technik bekannt, und zu ihnen gehören Substanzen

mögliche Mittel zur Beschleunigung ihrer Herstellung wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, an-

ergabeö, daß ein Zusatz eines Antibiotikums, wie organische Stoffe u. dgl., die in geeigneten Mengen

z. B. des Penicillins, oder eines Wachstumshemm- von dem Mikroorganismus ausgenutzt werden. Wie

stoffes, wie Z. B. eines oberflächenaktiven Mittels, die 65 oben angegeben, werden bei dem erfindungsgemäßen

Produktion von Trehalose bei der Fermentation des Verfahren Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoff- Arthrobacter paraffineus ATCC 15 591 in wäßrigen, que'le verwendet. Die bevorzugten Kohlenwasser- Kohlenwasserstoffe als Hauptkohienstoffquelle ent- stoffe sind η-Paraffine mit 6 bis 30 C-Atomen oder

s'orsclitecjene Arten von Kohlenwasserstoffdestillaten, die diese enthalten, Jedoch kann im Prinzip jeder Kohlenwasserstoff, der für die Mikroorganismen verwertbar ist, verwendet werden. Andere Kohienstoffquellen als Kohlenwasserstoffe können in dem Züchumgsmedium in kleineren Mengen vorhanden sein, dazu gehören Substanzen wie Kohlenhydrate, z. B. Glukose, Fruktose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen usw., oder irgendeine geeignete Kohlenstoffquelle wie z. B. Glycerin, Mannit, Sorbit usw. Verschiedene Gemische davon können verwendet werden. Als Stickstoffquelle können verschiedene anorganische und organische Salze und Verbindungen verwendet werden, wie z. B. Harnstoffe oder Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw., oder eine Aminosäure oder mehrere Aminosäuren im Gemisch oder natürliche Substanzen, die Stickstoff enthalten, wie z. B. Maisquellfljssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Caseinhydrolysate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt usw. Diese Substanzen können ebenfalls als Gemische zweier oder mehrerer verwendet werden. Anorganische Verbindungen, die zum Züchtungsmedium hinzugefügt werden können, sind z. B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Ka-Uumhydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Manganchlorid, Calciumchlorid usw. Spezielle Nährstoffe, die für das Wachstum des besonderen verwendeten Mikroorganismus notwendig sind, sollten ebenfalls zu dem Züchtungsmedium in geeigneten Mengen hinzugefügt werden.

Wie oben angegeben, werden "kohlenwasserstoffe als Hauptkohlenstoffquelle bei der erfindungsgemäßen Fermentation verwendet, wobei n-Paraffine mit 6 bis 30 C-Atomen bevorzugt werden. Hierzu gehören Paraffine (Alkane) mit geraden und verzweigten Ketten, wie z. B. η-Hexan, n-Oktan, η-Dekan, n-Dodekan, n-Hexadekan, Isooktan usw. Jedoch können auch andere Kohlenwasserstoffe wie Kerosin und Cycloparaffine, wie z. B. Cyclohexan. und Cyclooktan, ferner Olefine mit geraden und verzweigten Ketten, wie z.B. Penten-2, Hexen-1, Okten-1, Okten-2 usw., Cycloolefine, wie z.B. Cyclohexen, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, o-Xylol, usw. sowie Gemische davon und gemischte Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle usw., verwendet werden.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, wie z. B. aerobem Schütteln oder Rühren einer Submerskultur bei einer Temperatur von etwa 25 bis 40° C und einem pH von etwa 4,0 bis 9,0 durchgeführt. Falls notwendig, wird der pH auf innerhalb dieses Bereiches durch Zugabe einer Harnstofflösung, von wäßrigem Ammoniak oder einer Ammoniumcarbonatlösung zu dem Medium während der Züchtung eingestellt. Die Fermentation ist gewöhnlich nach etwa 2 bis 4 Tagen unter diesen Bedingungen abgelaufen. Sie ist dann beendet, wenn der Gesamtzuckergehalt seinen höchsten gemessenen Wert erreicht.

Nach Beendigung der Fermentation wird die Fermentationsflüssigkeit filtriert und dann über ein Kationenaustauscherharz geschickt, so daß sämtliche zugleich mit der Trehalose produzierten Aminosäuren sowie die vorliegenden Kationen absorbiert und entfernt werden. Die Abflußlösung wird dann über ein Anionenaustauscherharz geschickt, um organische Säuren und andere saure Substanzen zu entfernen. Die auf diese Weise erhabene Abflußlösung wird unter vermindertem Druck oder nach einem Entfärbungsvorgang konzentriert. Hieraus kann dann die Trehalose gewonnen werden.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern. Die Prozentgehalte sind Gewichtsprozente, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Arthrobacter paraffineus ATCC 15 591 wird unter aeroben Bedingungen zur Bildung einer Einsaatkultur 24 Stunden lang unter Schütteln in einem Züchtungsmedium, das 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton und 0.5% Natriumchlorid enthält und einen pH von 7,0 (vor Sterilisation) aufweist, gezüchtet. Die entstehende Einsaatkultur wird in eine! Inokulationsmenge entsprechend 10 Volumprozent in einem 5-1-Fermenter, der 3 1 eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung enthält (pro Liter Wasser), eingeimpft:

Prozent

K,HPO₄ 0,2

MgSO₄ ·7Η,Ο 0,1

MnSO₄ ·4Η;Ο 0,002

FeSO₄·7Η.,Ο 0,002

ZnSO₄ ·7Η;Ο 0,001

NH₄NO₃ ." 1,0

Maisquellflüssigkeit 0,3

Die Züchtung wird dann 80 Stunden lang bei 30⁰C unter Rühren bei 600 U/Min, und Belüftung mit sterilisierter Luft bei einer Durchsatzgeschwindigkeit von 1 Liter pro Liter durchgeführt. Zu Beginn der Züchtung werden zu dem Medium 400 ml n-Paraffine mit 10 bis 18 C-Atomen hinzugesetzt. Nach 10 bis 24 Stunden der Züchtung wc'den 12 000 Einhei-

4« ten Penicillin hinzugefügt. Der pH des Züchtungsmediums wird mit wäßrigem Ammoniak innerhalb des Bereiches von 6,0 bis 9,0 eingestellt.

Die bei Abschluß der Fermentation in der Kulturflüssigkcit produzierte Menge der Saccharide beträgt 15 g/l Gesamtzucker. Wird die Züchtung ohne Zugabe von Penicillin, sonst jedoch unter den gleichen Bedingungen, durchgeführt, beträgt die produzierte Menge Saccharide nur 6 g/l Gesamtzucker.

Die Abtrennung der Trehalose wird folgendermaßen durchgeführt:

Nach Abschluß der Fermentation werden 2,5 1 der Fermentationsflüssigkeit unter Verwendung eines Filtrierhilfsmittels filtriert und die Bakterienzellen abgetrennt und entfernt. Anschließend wird die filtrierte Lösung über 21 eines stark sauren Kationenaustauscherharzes in der Η-Form (Austauscher auf Basis Polystyrolsulfonat) geschickt und mit Wasser gewaschen. Es werden 3 1 Abflußlösung erhalten, die dann über 11 eines stark basischen Anionenaustauscherharzes in der OH-Form geschickt werden. Die so erhaltenen 4,3 1 Abflußlösung (mit einem pH von 5,4) werden unter vermindertem Druck auf 100 ml konzentriert. Hierzu wird eine salzsaure Methanollösung hinzugefügt, um die Saccharide aüszu-

fällen. Nachdem man die erzeugten Niederschläge in einem kalten Raum stehengelassen hat, werden sie filtriert und getrocknet. Das Endprodukt enthält 25 g eines weißen Saccharid-Gemisches, das 8 g Trehalose,

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12 g Glukose und 3 g eines Mannosearabinose-Polymerisats enthält.

Beispiel 2

Die Züchtung wird mit demselben Mikroorganismus, demselben Medium und unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 durchgeführt. Die Wirkung auf die Produktion von Trehaiose durch Zugabe verschiedener Antibiotika und oberflächenaktiver Mittel nach 18 Stunden der Züchtung zu dem Medium ist in Tabelle 1 aufgezeigt, welche die nach 80 Stunden der Züchtung produzierten Mengen von Trehaiose angibt.

Tabelle I

Zugeseuter Stoff

Hinzugefügte Mengen

Produzierte

Mengen
ohne Zugabe

(g/l)

Trehaiose mit Zugabe

Penicillin G (Kaliumsalz)

Streptomycinsulfat

Mitomycin

Bacitracin

Cycloserin

Sorbitanmonooleat

Polyoxyäthylensorbitanmonostearat .
Penicillin plus
Polyoxyäthylensorbitanmonopalmitat

Polyoxyäthylenalkylamin

50 Einheiten/ml
10 Einheiten/ml

5 Einheiten/ml
20 Einheiten/ml
50 Einheiten/ml

1 mg/ml

4 Einheiten/ml pius
1 mg/ml
1 mg/ml

2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4

2,4 2,4

10,5

7,4

10,0

10,2

7,8

7,0

6,2

11,4
8,6

Beispiel 3

Die Fermentationsfiüssigkeit, die erhalten wird, wenn man Arthrobacter paraffineus ATCC 15 591 in demselben Medium und unter denselben Bedingungen wie im Beispiel 1 züchtet, wird filtriert. Dann werden 2,5 1 des Filtrats unter Verwendung eines stark ;auren Kationenaustauschers in der H-Form entsalzen, und die mit Schwefelsäure erzeugten Niederschläge werden daraus entfernt. Danach wird eine äquivalente Menge Methanol hinzugefügt, so daß das Zuckerpolymerisat ausgefällt wird. Nach Rückgewinnung des Methanols wird die überstehende Lösung durch Chromatographie unter Verwendung von gereinigter Kohle in eine gemischte Lösung von Glukose, Fruktose, Ribose, Arabinose und Trehaiose getrennt.

Wie weiter oben angegeben, werden bei der vorliegenden Erfindung Antibiotika oder oberflächenaktive Mittel oder Gemische davon eingesetzt. Die Antibiotika oder die oberflächenaktiven Mittel können einzeln verwendet werden, oder sie können in Kombination verwendet werden. Verschiedene Antibiotika oder oberflächenaktive Mittel sind oben speziell aufgezählt worden, jedoch können zahlreiche Arten davon innerhalb des Anwendungsbereiches der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange sie für das Wachstum des Arthrobacter paraffineus ATCC 15 591 nicht schädlich sind. Unter oberflächenaktiven Mitteln versteht man in der Technik gewöhnlich synthetische organische Verbindüngen, die Oberflächenaktivität entfalten. Zu diesen gehören Netzmittel, Detergentien, Durchdringungsmittel, Verte.ilungsmittel, Dispergiermittel, Schaumbildner usw. Alle diese Arten von Substanzen sollen in den Bereich des Begriffes »oberflächenaktive Mittel« der vorliegenden Anmeldung fallen. Antibiotika sind antibakterielle Substanzen biologischen Ursprungs, und der Ausdruck »antibiotisch« wird hier in diesem Sinn verwendet.
Die Gewinnung der neben der Trehaiose noch gebildeten Saccharide ist nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Claims

haltenden Nährmedien merklich beschleunigt. Dem

Patentanspruch: Nährmedium kann sowohl ein Zusatzstoff als auch

beide Zusatzstoffe zugesetzt werden.

Verfahren zur Herstellung von Trehalose durch Antibiotika, die erfindungsgemäß dem Ziichtungs-

Fermentation, dadurch gekennzeichnet, 5 medium zugefügt werden können, sind z.B. Peni-

daß man den Mikroorganismus Arthrobacter cillin, Streptomycin, Bacitracin, Mitomycin, Cycloserin

paraffineus ATCC 15 591 in einem Nährmedium, und dergleichen oberflächenaktive Mittel, die erfin-

das wenigstens einen Kohlenwasserstoff als dungsgemäß verwendet werden können, sind alle

Hauptkohienstoffquelle enthält, züchtet und daß geeigneten anionischem kationischen oder nicht-

man mindestens ein Antibiotikum oder minde- io ionischen oder amphoteren oberflächenaktiven

stens ein oberflächenaktives Mittel oder ein Ge- Mittel, die in der Technik bekannt sind. Besonders

misch davon dem Nährmedium hinzufügt und wirksam sind die Polyoxyäthylensorbitanfettsäure-

daß man schließlich die Trehalose aus der Fer- ester mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, Alkylamin-