NO126923B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av L-glutaminsyre ved fermentering.

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av L-glutaminsyre hvor man bruker en ny bakteriestamme som er istand til å assimilere hydrokarboner, særlig gassformige hydrokarboner.

Oppfinnerne har tidligere undersøkt metoder for fremstilling av L-glutaminsyre hvor billige hydrokarboner har vært brukt som karbonkilder, og har offentliggjort resultater fra arbeider med bakterier som er istand til å lage L-glutaminsyre fra n-paraffiner. Ved fortsatt forskning i dette feltet har det lykkes oppfinnerne

å finne frem til en ny bakteriestamme, som er istand til å prod-usere L-glutaminsyre med stort utbytte når gassformige hydrokarboner brukes som hovedkarbonkilde. En slik metode er særlig

fordelaktig fordi L-glutaminsyre er et meget viktig stoff innenfor biokjemi og ernæring.

Formålet med oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte

for fremstilling av L-glutaminsyre ved fermentering, som kan utføres på en effektiv og relativt enkel måte, og som kan brukes i industriell skala, med lavere omkostninger fra billige rå-materialer og med stort utbytte, slik at svakhetene og ulempene ved tidligere metoder blir overkommet.

Fermentering ved bruk av den nye stamme som er beskrevet i oppfinnelsen, og med gassformige hydrokarboner som hovedkarbonkilde har spesielt mange fordeler når det gjelder industriell fremstilling av L-glutaminsyre. For eksempel 1) råstoffet som brukes som karbonkilde er billig, og finnes i store mengder, 2) lagring og transport av råstoffet og derved tilførselen av dette til kulturmediet kan utføres lett, 3) overflødig råstoff gjenvinnes lett, 4) konsentrasjonen av karbonkilden kontrolleres lett under fermenteringen, 5) fermenteringsvæsken er klar efter endt fermentering, 6) separasjon og rensing av sluttproduktet fra det overflødige råstoffet er relativt enkelt når man sammen-ligner med de tradisjonelle metoder der sukkerarter eller flytende hydrokarboner brukes som råstoff. På grunnlag av dette kan man anse denne metode hvor L-glutaminsyre fremstilles direkte ved fermentering av gassformige hydrokarboner ved å bruke den spesielle nye stamme som den billigste metode for fremstilling av L-glutaminsyre som hittil er beskrevet.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av L-glutaminsyre hvor en mikroorganisme av slekten Corynebacterium dyrkes under aerobe forhold, i et vandig næringsmedium som inneholder et hydrokarbon eller en blanding av hydrokarboner, fortrinnsvis et gassformig hydrokarbon med fra 2 til 4 karbonatomer, som hovedkarbonkilde, hvorefter L-glutaminsyre utvinnes fra dyrkingsvæsken. Fremgangsmåten karakteriseres ved at det som mikroorganisme anvendes Corynebacterium alkanum ATCC 21194.

Fra US-patent 3.222.258 er det kjent å fremstille L-glutaminsyre ved å dyrke mikroorganismer av slekten Corynebacterium. I patentet er det imidlertid ikke gitt noe eksempel på anvendelse av gassformig hydrokarbon, selv om anvendelse av et slikt hydrokarbon er nevnt. Utbyttet av L-glutaminsyre som oppnåes i henhold til patentet, er meget lavt, f.eks. fra 6 til 281 mg pr. liter, selv når det anvendes flytende hydrokarbon.

Ved anvendelse av Corynebacterium alkanum ATCC 21194 oppnåes imidlertid et L-glutaminsyreutbytte på 18 mg pr. ml når n-butan anvendes som råmateriale. Utbyttet er ca. 64 til 300 ganger så stort som utbyttet angitt i nevnte US-patent. Det er derfor klart at mikroorganismen som anvendes i henhold til oppfinnelsen, har en meget bedre evne til å danne L-glutaminsyre enn mikro-organismene beskrevet i US-patentet.

Den nye stammen som anvendes i henhold til oppfinnelsen, har fått betegnelsen Corynebacterium aLkanum. Den er isolert fra naturen (jord) og har følgende bakteriologiske kjennetegn:

Corynebacterium alkanum

A) Morfologiske egenskaper

Form: Vanligvis korte staver. Ufullstendig delte celler, forgrenede celler og "snapping-type fission" celler er ofte blitt observert.

Størrelse: 0,5 x 2,5 - 5.0 mikron.

Bevegelighet: Ikke-bevege1ige.

Sporer: Ikke dannet.

Flageller: Ikke dannet.

Gram-farvning: Positiv

Syre-fasthet i. Ikke syre-fast.

B) Vekstegenskaper

(1) Agar kolonier: middels vekst, sirkelformede, glatte, hele, glinsende og ugjennomsiktige, konvekse og gul-grå. (2) Skrå-agar: middels vekst, smal strek med glatte kanter, glinsende, gul-grå, luktfri, smøraktig, kulturmediet uforandret.

(3) Buljong: Overflatevekst svak, middels uklar.

(4) Gelatin stikk-kultur: Ingen eller svak vekst på toppen.

Gelatin ikke fluidisert.

C) Fysiologiske egenskaper

(1) Optimum temperatur: 25 - 30°C. (Svak vekst ved 35°C).

(2) Optimum pH: 5,0 - 9,0 (Ingen vekst ved pH 4,0).

(3) Oksygenkrav: Aerob.

(4) Lakmus melk: Uforandret eller alkalisk.

(5) Hydrogensulfid: Dannet.

(6) Indol: Ikke dannet.

(7) Stivelse: Ikke spaltet.

(8) Nitrater dannet fra nitrater.

(9) Katalase: Positiv.

(10) Ammonium produksjon: Negativ.

(11) Voges-Proskauer prøve: Negativ.

(12) Omdannelse av sukkerarter: Syre dannes fra glukose, fruktose, mannose, sukrose, laktose, mannitol og sorbitol. (13) Assimilering av hydrokarboner: Assimilerer propan, n-butan, n-dodekan, n-tridekan, n-tetradekan, n-pentadekan, n-heksadekan og n-heptadekan.

Basert på de ovennevnte egenskaper er Corynebacertium alkanum blitt plassert taksonomisk ved hjelp av "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology",7th Edition (1957). Denne mikroorganismen tilhører familien Corynebacteriaceae fordi den har stav-formete celler, er ikke-syre-fast, er ikke trådformet, er gram-positiv, danner ikke endosporer, har forgrenede celler og fer-menterer ikke sukkerarter anaerobt. Videre tilhører denne stammen slekten Corynebacterium fordi den har bøyde og "snapping-type fission" celler og fordi den er katalase-positiv, noe som er karakteristisk for denne slekten. Organismen er mest lik Corynebacterium agropyri og Corynebacterium rathayi blant artene innenfor slekten Corynebacterium. Men, som vist i tabellen er denne organismen forskjellig fra Corynebacterium agropyri i størrelse, gram-farvning og i veksten på buljong-skrå-agar. Den skiller seg også fra Corynebacterium rathayi i størrelse, vekst og evne til å fluidisere gelatin. Videre er den forskjellig fra de ovenfornevnte to artene når det gjelder kolonidannelse og evne til å assimilere flytende og gassformige hydrokarboner. Denne organismen er derfor opplagt en ny art og har følgelig fått navnet Corynebacterium alkanum.

Den nye stamme som her er blitt beskrevet, er deponert i

"American Type Culture Collection" og har fått følgende beteg-

nelse :

Corynebacterium alkanum ATCC 21194

Som vekstmedium kan man bruke enten et syntetisk kulturmedium

eller et naturlig næringsmedium så lenge det inneholder de næringsstoffene som er nødvendige for den stamme som skal brukes. Mediet må dessuten inneholde et hydrokarbon som hovedkarbonkilde

på grunn av organismens spesielle evne til å assimilere hydrokarbon. Slike næringsmedier er velkjente innenfor faget og inneholder stoffer som karbonkilde, en nitrogenkilde, uorganiske stoffer osv., som anvendt i passende mengder kan benyttes av vedkommende mikroorganisme.

Både gassformige og flytende hydrokarboner kan brukes som

karbonkilde ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Gassformige hydrokarboner med fra 2 til 4 karbonatomer som etan, n-propan, isopropan, n-butan, sek-butan, isobutan og tert-butan kan brukes. Flytende alifatiske hydrokarboner med fra 5 til 18 karbonatomer

er brukbare, f.eks. n-pentan, n-oktan, n-dekan, n-dodekan, n-heksadekan, isopentan, isooktan osv. Videre er cykliske paraffiner som cykloheksan og cyklooktan brukbare, og dessuten rette og forgrenede olefiner som penten-2, heksen-1, okten-2 osv. og endelig cykloolefiner som for eksempel cykloheksan. Det er også mulig å bruke aromatiske hydrokarboner som benzen, isomere xylener etc og blandinger av disse. Videre er blandede hydrokarboner som kerosen, lette oljer, tunge oljer, paraffinoljer etc, vel-egnete som karbonkilder. Blandinger av to eller flere av disse stoffene kan naturligvis også benyttes i mediet.

Små mengder av andre karbonkilder som sukker og sukkeralkoholer

kan benyttes i mediet. Eksempler er glukose, fruktose, maltose, sukrose, stivelse, stivelse-hydrolysat og melasse. På samme måte kan organiske syrer som f.eks. eddiksyre, melkesyre etc.

og alkoholer som etanol, n-butanol etc. benyttes i mediet. Disse stoffene kan også benyttes enten enkeltvis eller i blandinger av to eller flere.

De uorganiske eller organiske nitrogenkildene som vanligvis

benyttes ved glutaminsyre-fermentering, kan også benyttes ved

foreliggende fremgangsmåte. Det dreier seg om forskjellige uorganiske eller organiske salter eller forbindelser slik som: urea, ammoniakk, ammoniumsalter som ammoniumklorid, ammonium-sulfat, ammoniumnitrat, ammoniumacetat, ammoniumfosfat etc.,

eller naturlige stoffer som inneholder nitrogen, slik som mais-støpevæske, gjærekstrakt, kjøttekstrakt, pepton, fiskemel,

buljong, kasein hydrolysater, kasaminosyrer, fiskeekstrakter, kliekstrakt fra ris, osv. Også disse kan benyttes enten alene eller i blandinger av to eller flere.

Uorganiske forbindelser som kan tilsettes mediet, omfatter magnesiumsulfat, natriumfosfat, kaliumdihydrogenfosfat, kalium-monohydrogenfosfat, jernsulfat, manganklorid, kalsiumklorid, natriumklorid, sinksulfat etc.

Fermenteringen eller dyrkingen av mikroorganismen utføres under aerobe forhold, f.eks. ved rysting eller ved røring under gjennomblåsing av luft i en suspendert kultur, ved en temperatur på

f.eks. fra ca. 20° til 50°C og ved en pH fra 4,0 til 9,0. Efter dyrking fra ca. 3 til 7 dager under disse betingelser, vil store mengder L-glutaminsyre finnes akkumulert i kulturvæsken.

Hvis gassformige hydrokarboner benyttes, tilsettes de som gass blandet med luft eller oksygen, og en gjennomblåsningsmetode benyttes. Konsentrasjonene av gassene som brukes, trenger ikke være begrenset til en spesiell verdi.

De forskjellige teknikker som brukes ved tradisjonelle fermen-teringer hvor sukkerholdige materialer eller flytende hydrokarboner benyttes, kan brukes ved foreliggende fremgangsmåte.

F.eks. økes fermenteringshastigheten i stor grad ved tilsetning

til mediet av små mengder ikke-metaboliserbare hydrokarboner som pristan, andre stoffer med tilsvarende virkning eller overflateaktive stoffer. Disse stoffene gjør at de gassformige hydrokar-bonene løser seg raskere i kulturmediet.

Fermenteringen er fullstendig når mengden av L-glutaminsyre dannet viser en maksimal verdi. Efter endt kultivering kan L-glutaminsyre gjenvinnes ved tradisjonelle metoder som behandling med ionebytter, ekstrahering med oppløsningsmidler, bunnfelling, adsorbsjon, kromatografering og lignende. En metode som foretrekkes er å la kulturvæsken passere en ionebytter for å få adsorbert L-glutamin-syren. Den blir derefter.eluert, konsentrert og avkjølt. De resulterende krystaller gjenvinnes og omkrystalliseres videre efter ønske for å få rene krystaller-.

De følgende eksempler skal tjene til å illustrere oppfinnelsen nærmere. Med mindre noe annet er angitt er de følgende prosenter basert på vekt pr. liter vann.

Eksempel 1

Corynebacterium alkanum ATCC 21194 brukes som inokuleringsorganisme. Den dyrkes med aerob rysting i 24 timer i et inokulumsmedium som inneholder 0,25% gjærekstrakt, 0,5% kjøttekstrakt, 0,5% pepton, 0,25% natriumklorid og 2% sorbitol ved pH 7,2 for å få en inokulumskultur. 2,7 liter sterilt fermenteringsmedium i en 5-

liter fermentator inokuleres med et 10% inokulum fra inokulums-kulturen. Fermenteringsmediet har følgende sammensetning:

Dyrkingen foregår ved 30°C i 96 timer under røring med en hastighet på 600 omdreininger pr. minutt og gjennomblåsing med en gass-blanding av n-butan og luft (50:50 volum/volum) med hastighet på 1 liter pr. minutt. Mediets pH holdes på 7,2 under dyrkingen ved å tilsette vandig ammoniakk til mediet. Når fermenteringen er fullstendig, er det dannet og akkumulert 18 mg/ml av L-glutaminsyre.

Bakteriecellene separeres fra fermenteringsvæsken ved sentrifugerihg efter at fermenteringen er avsluttet. Derefter justeres pH-verdien av fermenteringsvæsken til 2,0. Væsken får passere gjennom en ka-tionbytterharpiks, "Amberlite IB-120" (H-type), og harpiksen elueres med vandig ammoniakk. Den resterende effluent konsen-treres og avkjøles. Som resultat oppnår man 41 gram L-glutaminsyre-krystaller.

Eksempel 2

2,7 liter av et kulturmedium som består av følgende stoffer, lages i en 5 liters fermentator og steriliseres:

Mediets pH er 7,2.

En inokulumskultur av Corynebacterium alkanum ATCC 21194 lages

på samme måte som beskrevet i eksempel 1. Kulturmediet som er beskrevet ovenfor inokuleres med et 10% (volum) inokulum fra inokul-umskulturen.

Dyrkingen utføres på samme måte som beskrevet i eksempel 1 i 96 timer. Når dyrkingen er fullstendig, er 21 mg/ml av L-glutaminsyre akkumulert i kulturmediet.

Tilsetningen av antibiotika eller overflate-aktive stoffer til mediet øker fermenteringshastigheten og utbyttet av L-glutaminsyre. Antibiotika som kan brukes omfatter pencillin, bacitracin, cykloserin, kanamycin, streptomycin, spiramycin, cefalotin, cefaloridin og novobiocin. Overflateaktive stoffer som kan brukes, omfatter anioniske-, kationiske- og ikke-ioniske-stoffer, høyere fettsyrer og organiske estere. Blandinger av antibiotika og overflateaktive stoffer kan også brukes.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av L-glutaminsyre, hvor en mikroorganisme av slekten Corynebacterium dyrkes under aerobe forhold, i et vandig næringsmedium som inneholder et hydrokarbon eller en blanding av hydrokarboner, fortrinnsvis et gassformig hydrokarbon med fra 2 til 4 karbonatomer, som hovedkarbonkilde, hvorefter L-glutaminsyre utvinnes fra dyrkingsvæsken, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Corynebacterium alkanum ATCC 21194.