DE1965975C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von C tief 32 H tief 64 O tief 2 Fettsauretrehaloseester Ausscheidung aus 1905472 - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von C tief 32 H tief 64 O tief 2 Fettsauretrehaloseester Ausscheidung aus 1905472Info
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Description
Lösungsmittels, Hinzufügen von kaltem Aceton, Sammeln der erhaltenen Niederschläge und schließlich
Reinigen mit Hilfe von Aceton.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläuternWenn
nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht je Liter Fermentationsflüssigkeit.
Mycobacterium sp. ATCC 12 297 wird als Einsaat-Mikroorganismus verwendet und in einem Einsaatmedium
gezüchtet, das 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton, 0,3% Natriumchlorid und 5% n-Paraffine
enthält. Dieses Einsaatmedium wird unter aerobem Schütteln 24 Stunden lang gezüchtet. Die erhaltene
Einsaatkultur wird in einem Verhältnis von 10 Volumprozent in 3,0 1 eines Fermentationsmediums eingeimpft,
das sich in einem 5-1-Jar-Fermenter befindet,
und neben η-Paraffinen die folgenden Substanzen enthält:
0,2 %
0,1 %
0,002 %
0,02 %
0,001 %
1 mg/1
1 mg/1
1,0 %
0,1 %
K2HPO4,
MgSO4 · 7 H2O,
MnSO4 · 4 H2O,
FeSO4 · 7 H2O,
ZnSO4 · 7 H2O,
CuCl4 · 2 H2O,
NH4NO3,
Maisquellwasser.
MgSO4 · 7 H2O,
MnSO4 · 4 H2O,
FeSO4 · 7 H2O,
ZnSO4 · 7 H2O,
CuCl4 · 2 H2O,
NH4NO3,
Maisquellwasser.
Die Züchtung wird bei 300C unter Rühren mit
einer Rührgeschwindigkeit von 600 Upm und unter Belüftung mit sterilisierter Luft mit einer Durchsatzgeschwindigkeit
von 1 1 pro Liter pro Minute 80 Stunden lang durchgeführt. Zu Beginn der Züchtung
werden dem Züchtungsmedium 600 ml eines Gemisches von C11 bis C18 η-Paraffinen hinzugefügt,
und der pH-Wert des Mediums wird mit wäßrigem Ammoniak auf 6,8 bis 7,5 eingestellt.
Die Isolierung des Zielproduktes erfolgt entsprechend
der vorstehenden Methode. Nach Beendigung der Züchtung werden 2,5 1 der Fermentationsflüssigkeit
mittels einer Zentrifuge abgetrennt und der wasserlösliche Teil der unteren Schicht wird durch Absaugen
entfernt. Zu 0,4 I der oberen Schicht wird die fünffache
Menge eines Chloroform-Methanol-Gemisches (1:1) hinzugefügt Nach 30minutigem Extrahieren
unter Rühren bei Raumtemperatur wird die obere Schicht filtriert. Die erhaltenen Niederschläge werden
mit dem obengenannten Lösungsmittel gewaschen. Das Filtrat und die nach Waschen der Niederschläge
erhaltene Lösung werden vermischt und auf ein Volumen von 3,2 1 eingestellt Dann wird das Lösungsmittel
bei 400C unter vermindertem Druck entfernt, und die Lösung wird erhitzt und mittels einer Zentrifuge
abgetrennt. Die obere Schicht wird abgenommen und η-Hexan zu derselben hinzugefügt Dann wird die
erhaltene Lösung auf 250 ml verdünnt und durch eine Silicagelsäule (5,2 ■ 20 cm) hindurchgeschickt. Danach
wird η-Hexan durch die Säule laufen gelassen, um alle zurückgebliebenen η-Paraffine auszuwaschen. Sodann
wird Chloroform durch die Säule geleitet, um nichtao
polare Substanzen zu entfernen. Nach Sammlung der Fraktionen (600 ml), die mit dem Chloroform-Methanol-Gemisch
(95:5) eluiert worden waren, Entfernen des Lösungsmittels bei 400C unter vermindertem
Druck, Hinzufügen von warmem Aceton zwecks as Auflösung des Gemisches und Stehenlassen des
Gemisches unbewegt in einem kalten Raum wird ein Niederschlag mit gelatinöser Konsistenzerhalten. Wenn
man das Auflösen mit Aceton und das Ausfällen in einer ähnlichen Weise wie oben beschrieben wiederholt,
werden so nach 4tägigem Züchten 2,3 g Trehaloseester einer Monocarbonsäure mit der experimentellen
Formel C38H84O8 aus 1,6 1 der Fermentationsflüssigkeit
gewonnen.
Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Abwandlung, daß Micrococcus paraffinolyticus ATCC 15 582 an
Stelle von Mycobacterium sp. ATCC 12 297 als Einsaatstamm verwendet wird, wobei 3,5 g des Trehaloseesters
einer Monocarbonsäure mit der experimentellen Formel C31H64O1 aus 1,6 1 der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit
gewonnen werden.
Claims (1)
1 2
_,^ organische Säuren, z. B. Essigsäure, Milchsäure usw.
Patentaaspruch: ~"~\ Diese Substanzen können entweder einzeln oder im
Gemisch von zweien oder mehreren Verwender Verfahren zur biotechnischen Herstellung von werden.
CgaHMOjj-Fettsäuretrehaloseester, dadurch 5 Als Stickstoffquelle können verschiedene Arten
gekennzeichnet, daß man Mycobacterium anorganischer oder organischer Salze oder Verbinsp.
ATCC12 297 oder Micrococcus paraffinolyticus düngen des Stickstoffes verwendet werden, wie Harn-ATCC
15 582 in einem η-Paraffine als Haupt- stoff, wäßriges Ammoniak oder Ammoniumsab, z. B.
kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium bei Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumüblichen Temperaturen und pH-Werten aerob io nitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat usw.,
züchtet. ocjer natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie ?viais-
quellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton,
Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Casammosäure,
Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt usw. Auch
Ester von Zuckern werden in großem Umfang als 15 diese Substanzen können entweder einzeln oder in
oberflächenaktive Mittel und in verschiedenen In- Kombination von zweien oder mehreren verwc-uiet
dustriezweigen verwendet. Demzufolge besteht ein werden.
dringendes Bedürfnis nach einem Fermentationsver- Anorganische Verbindungen, die dem Zucht, losfahren zur Gewinnung der Fettsäureester von Zuckern medium hinzugesetzt werden können, sind ß.
auf wenig kostspielige Weisf und innerhalb kurzer ao Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihymo-Ze'1·
genphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, '■ ;n-
Es wurde nun gefunden, daß C32He4O2-FeItSaUrC- sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriun aiotrehaloseester
in den Zellen oder an der Oberfläche der rid, Zinksulfat usw.
Zellen von Mycobacterium sp. ATCC 12 297 oder Außerdem können dem Züchtungsmedium best;,^n-
Micrococcus paraffinolyticus ATCC 15 582 erhalten 25 te essentielle Nährstoffe wie Aminosäuren, z. B.
wird, wenn man einen dieser Stämme aerob in einem Asparaginsäure, Threonin, Methionin usw., und,. Jer
η-Paraffine als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Vitamine, z. B. Biotin, Thiamin, Cobalamin u ;!.,
Nährmedium bei üblichen Temperaturen und pH-Wer- zugefügt werden.
ten züchtet. Pür dje Durchführung der erfindungsgenv: kn
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur bio- 30 Züchtung wird das Züchtungsmedium sterilisiert, und
technischen Herstellung von C32H64O2-FeItSaUrC- dann wird der zu verwendende Mikroorganismus in
trehaloseester, welches dadurch gekennzeichnet ist, dieses eingeimpft. Die Züchtung wird unter aercben
daß man Mycobacterium sp. ATCC 12 297 oder Bedingungen durchgeführt, z. B. als aerobe Sch uuel-
Micrococcus paraffinolyticus ATCC 15 582 in einem kultur oder als Submerskultur unter Rühren und Be-
n-Paraffine als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden 35 lüften, und zwar bei einer Temperatur von beispiels-
Nahrmedmm bei üblichen Temperaturen und pH- weise etwa 25 bis 400C und bei einem pH-Wert von
Werten aerob züchtet. beispielsweise etwa 4 bis 9. Während der Züchtung
Mit der Erfindung wurde ein Verfahren zur Her- wird der pH-Wert auf den angegebenen Bereich
stellung von C32He4Oa-Fettsäuretrehaloseester gefun- (vorzugsweise pH 6 bis 8) eingestellt, und zwar durch
den, das in verhältnismäßig einfacher Weise und vor- 40 Zusatz von z. B. Harnstofflösung, wäßrigem Amino-
teilhaft in industriellem Maßstab, bei niedrigen Kosten niak oder einer Ammoniumcarbonatlösung zu dem
und mit hoher Prokutausbeute durchgeführt werden Medium. Die Züchtung ist üblicherweise innerhalb
£»"" u· u von 2 bis 4 Tagen beendet. In der Praxis ist die
Der bioiechnisch herzustellende C31iHMO2-Fettsäure- Züchtung beendet, wenn die Messung der Gesamtester
trehaloseester ist ein wertvolles Emulgiermittel; seine 45 einen Maximalwert ergibt.
technische Verwertbarkeit liegt daher vor allem auf Das Fettsäureesterprodukt des Zuckers sammelt
dem Gebiet der Emulgatoren. sich vornehmlich in der öligen Schicht der Fermenta-
hur die Züchtung dei erfindungsgemäß einzuset- tionsflüssigkeit an. Demzufolge bietet sich dem Fachzenden
Stamme Mycobacterium sp. ATCC 12 297 und mann für die Isolierung des Produktes die folgende
Micrococcus paraffinolyticus ATCC 15 582 kann ent- 50 Methode an. Nach vollständigem Ablauf der Züchtung
weder ein synthetisches oder ein natürliches Nähr- wird der wäßrige Anteil der unteren Schicht der Fermedium
verwendet werden, das die für das Wachstum mentationsflüssigkeit entfernt, indem man die Fermente.
Mikroorganismen erforderlichen Nährstoffe tationsflüssigkeit ruhig in einem kalten Raum stehen-,
η derartige Nährstoffe sind bekannt. läßt oder indem man eine Trennung durch Zentrifu-
im Kahmen der vorliegenden Erfindung wird die 55 gieren vornimmt. Eine Chloroform-Methanol-Lösung
he.rme"tailon '" e'nem wäßrigen Nährmedium durch- (1:1) wird zu der oberen Schicht hinzugefügt, um die
gefuhrt, das als Hauptkohlenstoffquelle geradkettige Gesamtmenge der Lipoide aufzunehmen. Das Lösungsraralhne
(n-Alkane) mit 6 bis 25 Kohlenstoffatomen, mittel wird dann unter vermindertem Druck bei 400C
wie z. B. η-Hexan, n-Octan, n-Decan, n-Dodecan, entfernt, und der ölige Anteil der oberen Schicht wird
n-Mexadecan, n-Eicosan, oder Gemische davon, oder 60 durch Zentrifugieren gewonnen. Die so erhaltene Öl-Kohlenwasserstoffe
die sich von Erdöl ableiten, z. B. schicht wird durch eine Silicagelsäule hindurchge-Keros.n,
Leichtole, Schweröle, Paraffinöle usw., ent- leitet, und es wird eine Elution mit Hexan vorgehalt.
Zusammen mit dem Kohlenwasserstoff können nommen, um die vorhandenen η-Paraffine zu entferin
dem Fermentationsmed.um geringe Mengen anderer nen. Anschließend werden polare Verbindungen durch
KohlenstoffqueHen verwendet werden, wie Kohlen- 65 Elution mit Chloroform entfernt. C-.H^O.-Fettsäure-
mi S-1 Q,- 1U(LOS!' TrUCtOS?i ^alt0Se' Saccha" trehaloseester wird erhalten nach Durchführung einer
rose, Starke, Stärkehydrolysate, Melassen usw., oder Elution mit einem Chloroform-Methanolgemisch,
.rgendeme andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie Auffangen der jeweiligen Fraktionen, Entfernen de
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP573568 | 1968-01-01 | ||
| JP573568 | 1968-02-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1965975A1 DE1965975A1 (de) | 1971-01-21 |
| DE1965975C true DE1965975C (de) | 1973-04-19 |
Family
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