DE1965975B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von C tief 32 H tief 64 O tief 2-Fettsäuretrehaloseester. Ausscheidung aus: 1905472 - Google Patents

Description

Lösungsmittels, Hinzufügen von kaltem Aceton, Sam- lösliche Teil der unteren Schicht wiru durch Absaugen mein der erhaltenen Niederschläge und schließlich entfernt Zu 0,4 1 der oberen Schicht wird die fünf-Reinigen mit Hufe von Aceton. fache Menge eines Chloroform-Methanol-Gemisches Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung er- (1:1) hinzugefügt. Nach 30minutigem Extrahieren läutern. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich 5 unter Rühren bei Raumtemperatur wird die obere die Prozentangaben auf das Gewicht je Liter Fer- Schicht filtriert. Die erhaltenen Niederschläge werden mentationsflüssigkeit mit dem obengenannten Lösungsmittel gewaschen. _B . -I₁ Das Filtrat und die nach Waschen der Niederschläge eispiel l erhaltene Lösung werden vermischt und auf ein Vo-Mycobacterium sp. ATCC 12 297 wird als Einsaat- io lu-aen von 3,2 1 eingestellt. Dann wird das Lösungs-Mikroorganismus verwendet und in einem Einsaat- mittel bei 40⁰C unter vermindertem Druck entfernt, medium gezüchtet, das 1,0% Fleischextrakt, 1,0% und die Lösung wird erhitzt und mittels einer Zentri-Pepton, 0,3% Natriumchlorid und 5% η-Paraffine fuge abgetrennt. Die obere Schicht wird abgenommen enthält. Dieses Einsaatmedium wird unter aerobem und η-Hexan zu derselben hinzugefügt. Dann wird die Schütteln 24 Stuhlen lang gezüchtet. Die erhaltene 15 erhaltene Lösung auf 250 ml verdünnt und durch eine Einsaatkultur wird in einem Verhältnis von 10 Volum- Silicagelsäule (5,2 · 20 cm) hindurchgeschickt. Danach prozent in 3,0 1 eines Fermentationsmediums einge- wird η-Hexan durch die Säule laufen gelassen, um alle impft, das sich in einem 5-1-Jar-Fermenter befindet, zurückgebliebenen η-Paraffine auszuwaschen. Sodann und neben η-Paraffinen die folgenden Substanzen wird Chloroform durch die Säule geleitet, um nichtenthält: 30 polare Substanzen zu entfernen. Nach Sammlung der 0 2 °/K HPO Fraktionen (600 ml), die mit dem Chlcroform-Metha-0 1 °/ M²gSO *'l H,0 nol-Gemisch (95:5) eluiert worden waren, Entfernen 0002 y MnSO* · 4 H²o' ^^es Lösungsmittels bei 40⁰C unter vermindertem 0Ό2 °/ FeSO *· 7 H O Druck, Hinzufügen von warmem Aceton zwecks o'oOl °/ ZnSO · 7 rfo' ^a5 Auflösung des Gsmisches und Stehenlassen des l'mg/l ° CuCl · 2 H O' Gemisches unbewegt in einem kalten Raum wird ein 10 y NH NO ² ' Niederschlag mit gelatinöser Konsistenz erhalten. Wenn

n'i °/ MnitmipTkvasspr ^man das Auflösen mit Aceton und das Ausfällen in

VJ₉I /n ividisuueuwasser. . „, ,. . ,,. . . ti·« · 1

einer ahnlichen Weise wie oben beschrieben wieder-

Die Züchtung wird bei 3O⁰C unter Rühren mit 30 holt, werden so nach 4tägigem Züchten 2,3 g Tre-

einer Rührgeschwindigkeit von 600 Upm und unter haloseester einer Monocarbonsäure mit der experi-

Belüftung mit sterilisierter Luft mit einer Durchsatz- mentellen Formel C₃₂H₆₄O₂ aus 1,6 1 der Fermenta-

geschwindigkeit von 1 1 pro Liter pro Minute tionsflüssigkeit gewonnen.

80 Stunden lang durchgeführt. Zu Beginn der Züch- . · 1 ?

tung werden dem Züchtungsmedium 600 ml eines 35 Beispiel 2

Gemisches von C₁₁ bis C₁₈ η-Paraffinen hinzugefügt, Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Abwandlung,

und der pH-Wert des Mediums wird mit wäßrigem daß Micrococcus paraffinolyticus ATCC 15 582 an

Ammoniak auf 6,8 bis 7,5 eingestellt. Stelle von Mycobacterium sp. ATCC 12 297 als Ein-

Die Isolierung des Zielproduktes erfolgt entsprechend saatstamm verwendet wird, wobei 3,5 g des Trehaloseder vorstehenden Methode. Nach Beendigung der 40 esters einer Monocarbonsäure mit der experimentellen Züchtung werden 2,5 1 der Fermentationsflüssigkeit Formel C₃₂H₆₄O₂ aus 1,6 1 der erhaltenen Züchtungsmittels einer Zentrifuge abgetrennt und der wasser- flüssigkeit gewonnen werden.

Claims (1)

1 2

organische Säuren, ζ. Β. Essigsäure, Milchsäure usw.

Patentanspruch: Diese Substanzen können entweder einzeln oder im

Gemisch von zweien oder mehreren verwendet Verfahren zur biotechnischen Herstellung von werden.

CajH^Oa-Fettsäuretrehaloseester, dadurch 5 Als Stickstoff quelle können verschiedene Arten gekennzeichnet, daß man Mycobacterium anorganischer oder organischer Salze oder Verbinsp. ATCC12 297 oder Micrococcus paraffinolyricus düngen des Stickstoffes verwendet weiden, wie Harn-ATCC 15 582 in einem η-Paraffine als Haupt- stoff, wäßriges Ammoniak oder Ammoniumsalz, z. B. kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium bei Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Aromoniumüblichen Temperaturen und pH-Werten aerob io nitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat usw., züchtet " oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Mais-

, .·■ ■ . . quellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, F^pton,

Fischmehl, Bouillon, Caseinhydrolysate, Casaminosäure, Fischpreßsäfte, Reiskleieextrakt usw. Auch

Ester von Zuckern werden in großem Umfang als 15 diese Substanzen können entweder einzeln oder in oberflächenaktive Mittel und in verschiedenen In- Kombination von zweien oder mehreren verwendet dustriezweigen verwendet. Demzufolge besteht ein werden.

dringendes Bedürfnis nach einem Fermentationsver- Anorganische Verbindungen, die dem Züchtungs-

fahren zur Gewinnung der Fettsäureester von Zuckern medium hinzugesetzt werden können, sind z. B. auf wenig kostspielige Weise und innerhalb kurzer 20 Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydro-Zeit. genphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisen-

Es wurde nun gefunden, daß C₃₂H₆₄C₂-FeItSaUrC- sulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlotrehaloseester in den Zellen oder an der Oberfläche der rid, Zinksulfat usw.

Zellen von Mycobacterium sp. ATCC 12 297 oder Außerdem können dem Züchtungsmedium bestimm-

Micrococcus paraffinolyticus ATCC 15 582 erhalten 25 te essentielle Nährstoffe wie Aminosäuren, z. B. wird, wenn man einen dieser Stämme aerob in einem Asparaginsäure, Threonin, Methionin usw., und/oder η-Paraffine als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden Vitamine, z. B. Biotin, Thiamin, Cobalamin u. dgl., Nährmedium bei üblichen Temperaturen und pH-Wer- zugefügt werden.

ten züchtet. Für die Durchführung der erfindungsgemäßen

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur bio- 30 Züchtung wird das Züchtungsmedium sterilisiert, und technischen Herstellung von C₃₂H₆₄O₂-FeItSaUrC- dann wird der zu verwendende Mikroorganismus in trehaloseester, welches dadurch gekennzeichnet ist, dieses eingeimpft. Die Züchtung wird unter aeroben daß man Mycobacterium sp. ATCC 12 297 oder Bedingungen durchgeführt, z. B. als aerobe Schüttel-Micrococcus paraffinolyticus ATCC 15 582 in einem kultur oder als Submerskultur unter Rühren und Ben-Paraffine als Hauptkohlenstoffquelle enthaltenden 35 lüften, und zwar bei einer Temperatur von beispiels-Nährmedium bei üblichen Temperaturen und pH- weise etwa 25 bis 40⁰C und bei einem pH-Wert von Werten aerob züchtet. beispielsweise etwa 4 bis 9. Während der Züchtung

Mit der Erfindung wurde ein Verfahren zur Her- wird der pH-Wert auf den angegebenen Bereich stellung von C^H^Oa-Fettsäuretrehaloseester gefun- (vorzugsweise pH 6 bis 8) eingestellt, und zwar durch den, das in verhältnismäßig einfacher Weise und vor- 40 Zusatz von z. B. Harnstofflösung, wäßrigem Ammoteilhaft in industriellem Maßstab, bei niedrigen Kosten niak oder einer Ammoniumcarbonatlösung zu dem und mit hoher Prokutausbeute durchgeführt werden Medium. Die Züchtung ist üblicherweise innerhalb kann. von 2 bis 4 Tagen beendet. In der 1 Taxis ist die

Der biotechnisch herzustellende C^H^O^Fettsäure- Züchtung beendet, wenn die Messung der Gesamtester trehaloseester ist ein wertvolles Emulgiermittel; seine 45 einen Maximalwert ergibt.

technische Verwertbarkeit liegt daher vor allem auf Das Fettsäureesterprodukt des Zuckers sammelt

dem Gebiet der Emulgatoren. sich vornehmlich in der öligen Schicht der Fermenta-

Für die Züchtung der erfindungsgemäß einzuset- tionsflüssigkeit an. Demzufolge bietet sich dem Farhzenden Stämme Mycobacterium sp. ATCC 12 297 und mann für die Isolierung des Produktes die folgende Micrococcus paraffinolyticus ATCC 15 582 kann ent- 50 Methode an. Nach vollständigem Ablauf der Züchtung weder ein synthetisches oder ein natürliches Nähr- wird der wäßrige Anteil der unteren Schicht der Fermedium verwendet werden, das die für das Wachstum mentationsflüssigkeit entfernt, indem man die Fermendieser Mikroorganismen erforderlichen Nährstoffe tationsflüssigkeit ruhig in einem kalten Raum stehenenthält. Derartige Nährstoffe sind bekannt. läßt oder indem man eine Trennung durch Zentrifu-Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die 55 gieren vornimmt. Eine Chloroform-Methanol-Lösung Fermentation in einem wäßrigen Nährmedium durch- (1:1) wird zu der oberen Schicht hinzugefügt, um die geführt, das als Hauptkohlenstoff quelle geradkettige Gesamtmenge der Lipoide aufzunehmen. Das Lösungs-Paraffine (n-Alkane) mit 6 bis 25 Kohlenstoffatomen, mittel wird dann unter vermindertem Druck bei 40⁰C wie z. B. η-Hexan, n-Octan, n-Decan, n-Dodecan, entfernt, und der ölige Anteil der oberen Schicht wird n-Hexadecan, n-Eicosan, oder Gemische davon, oder 60 durch Zentrifugieren gewonnen. Die so erhaltene Öl-Kohlenwasserstoffe, die sich von Erdöl ableiten, z. B. schicht wird durch eine Silicagelsäule hindurchge-Kerosin, Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle usw., ent- leitet, und es wird eine Elution mit Hexan vorgehält. Zusammen mit dem Kohlenwasserstoff können nommen, um die vorhandenen η-Paraffine zu entferin dem Fermentationsmedium geringe Mengen anderer nen. Anschließend werden polare Verbindungen durch Kohlenstoffquellen verwendet werden, wie Kohlen- 65 Elution mit Chloroform entfernt. CgaH^Oa-Fettsäurehydrate, z. B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccha- trehaloseester wird erhalten nach Durchführung einer rose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melassen usw., oder Elution mit einem Chloroform-Methanolgemisch, irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie Auffangen der jeweiligen Fraktionen, Entfernen des